羅蓀琳, 范瑞祺,, 張婉君,, 賈 栗, 苑曉燕, 陳義強*,

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100171)

氟氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯是兩種常見的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，因其高效、廣譜、低毒的特性，已廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)蟲害防治[1]。相較于多數(shù)傳統(tǒng)農(nóng)藥，擬除蟲菊酯類殺蟲劑對哺乳動物毒性較低且效果好，因此在近幾十年里已逐漸發(fā)展為使用率排前三的殺蟲劑[2]，其典型代表氟氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯的使用量也大幅增加[3]。然而已有研究指出，包括氟氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯在內(nèi)的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生生物具有較高的毒性[2-4]。此外，這兩種農(nóng)藥還具有可與水體中有機沉積物結(jié)合的特性[5]，結(jié)合近年來關(guān)于氟氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯在部分水域中高檢出濃度的報道[6-7]，這兩種農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險尤其是對水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險值得引起關(guān)注。

傳統(tǒng)的環(huán)境風(fēng)險評估方法往往僅評價農(nóng)藥對非靶標(biāo)動物的半數(shù)致死濃度 (LC50)或者無可見有害作用水平/最小可見損害作用水平(NOAEL/LOAEL)，然而NOAEL/LOAEL 法得出的結(jié)果必然是試驗中實際采用的濃度，因此其結(jié)果的準(zhǔn)確性受限于試驗設(shè)計[8]。針對這一局限性，基準(zhǔn)劑量 (BMD) 法應(yīng)運而生。BMD 法最早在1984 年由Crump[9]提出，其定義為依據(jù)動物試驗所得的劑量-反應(yīng)關(guān)系，用適合的統(tǒng)計學(xué)模型求得受試物引起某一特定水平生物效應(yīng)的劑量，該生物效應(yīng)被稱為毒性基準(zhǔn)效應(yīng)(BMR)。一般用基準(zhǔn)劑量值95%置信區(qū)間下限 (BMDL) 來推導(dǎo)動物或人類安全暴露水平的參考值 (POD)[10-11]。

斑馬魚因易于觀察，且對環(huán)境污染物敏感，適合用于環(huán)境污染物的毒理學(xué)研究[12-13]。本研究以斑馬魚胚胎為模型，通過測定氟氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯暴露對斑馬魚胚胎自主運動和仔魚心率、孵化率、死亡率及畸形率的影響，采用BMD法比較了兩種藥劑對斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性差異，同時還比較了兩種農(nóng)藥BMDL10值與LOAEL值的關(guān)系，以期對BMD 法在農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估領(lǐng)域的應(yīng)用前景進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備

氟氯氰菊酯 (cyfluthrin) 原藥，純度96.4%，Sigma-Aldrich 公司 (美國)；高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin) 原藥，純度99.1%，Dr.Ehrenstorfer 公司 (德國)；二甲基亞砜 (DMSO)，純度99.7%，ThermoFischer 公司 (美國)；其他試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑公司。

SPX-250B-G 智能可編程光照培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SZ-10 體視顯微鏡，日本Olympus 公司；acA1300-60gm 面陣相機，德國Basler 公司；視頻采集軟件Media Recorder 4.0和視頻分析軟件DanioScope 1.1，荷蘭Noldus 公司。

1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)及魚卵收集

野生型Tu 系斑馬魚Danio rerio購自武漢斑馬魚資源中心，采用愛生科技的斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)，在封閉的斑馬魚房進行飼養(yǎng)?？刂乒庹?黑暗周期為14 h/10 h，室溫保持在 (28.5 ± 2.0) ℃，每日飼喂兩次新鮮孵化的豐年蝦Artemia salina幼蟲。

在試驗前一天下午選擇性成熟的雌、雄魚若干，按照兩雌/兩雄的比例放入繁殖盒中，用隔板隔開，于次日早晨光周期開始時抽開隔板，使雌雄魚自由追逐交配，收集抽開隔板0.5 h 內(nèi)受精的魚卵。

1.3 斑馬魚胚胎的染毒暴露

準(zhǔn)確稱取兩種供試農(nóng)藥，采用DMSO 溶解配制成儲備液，再用Holt Buffer (含NaCl 3.5 g/L，KCl 0.05 g/L，CaCl20.1 g/L，NaHCO30.05 g/L) 稀釋成對應(yīng)濃度的暴露液，其中DMSO 的最終體積分?jǐn)?shù)為0.1% (已證明此體積分?jǐn)?shù)下不會引起顯著的發(fā)育毒性)。參照De Perre 等[14]和Wang 等[15]的報道及預(yù)試驗結(jié)果，最終確定處理液中氟氯氰菊酯的系列質(zhì)量濃度為10.00、13.48、18.17、24.50、33.02、44.51 和60.00 μg/L，高效氯氟氰菊酯的系列質(zhì)量濃度為1.00、2.15、4.64、10.00、21.55、46.42 及100.00 μg/L，同時以體積分?jǐn)?shù)0.1% 的DMSO為溶劑對照組。將收集的受精后4 h 的卵置于體視顯微鏡 (6.3 × ) 下進行觀察，剔除未受精、凝結(jié)及卵膜破損的卵。將斑馬魚卵置于六孔板中，每孔20 枚，孔中已預(yù)先加入10 mL 暴露液。每濃度3 個重復(fù)，每24 h 更換一次暴露液，同時剔除死亡卵，持續(xù)染毒96 h。于受精后96 h 時記錄各組胚胎死亡率和畸形率，其中畸形指標(biāo)包括脊柱彎曲、心包水腫及卵黃囊水腫。

1.4 發(fā)育指標(biāo)檢測

分別統(tǒng)計受精后24、48、72 及96 h 時斑馬魚胚胎的死亡率，死亡標(biāo)志為卵凝結(jié)和心跳停滯；同時自受精后48 h 起每隔24 h 統(tǒng)計各組的畸形率，統(tǒng)計項目包括心包水腫、卵黃囊水腫和尾部畸形；并統(tǒng)計胚胎受精后48 h 的孵化率，孵化標(biāo)準(zhǔn)為仔魚與卵膜完全分離。

于受精后24 h，每個處理選擇5 個胚胎在體視顯微鏡下觀察，使用Media Recorder 錄制其1 min的自主擺動情況，并通過DanioScope 進行自主運動情況的分析和統(tǒng)計。在受精后48 h，同樣每處理選擇5 條仔魚，使用相同方法進行30 s 心率的采集與分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計

使用Origin 8.0 軟件 (OriginLab，美國) 對死亡率和畸形率進行統(tǒng)計，并計算LC50值和致畸作用EC50值。分別通過Shapiro-Wilk 檢驗和Levene檢驗驗證胚胎發(fā)育指標(biāo)方差的正態(tài)性和齊性。如果滿足條件，則采用單因素方差分析并進行事后LSD檢驗；如果不滿足條件，則使用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗并進行Bonferroni 事后檢驗(P＜0.05 為差異顯著)。采用Benchmark Dose Software 3.2 軟件(美國環(huán)保署，EPA) 分別計算基準(zhǔn)劑量 (BMD10，benchmark dose of 10% response) 值及其置信區(qū)間下限(BMDL10，lower confidence limit of BMD10)值，選取擬合度最佳的模型作為BMD 曲線[16]。同時將試驗中觀察到的可引起指標(biāo)明顯變化的最小劑量定義為最小可見損害作用水平 (LOAEL，lowest observed adverse effect level)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟氯氰菊酯對斑馬魚胚胎和仔魚發(fā)育指標(biāo)的影響

氟氯氰菊酯對斑馬魚仔魚的受精后96 h LC50值為45.12 μg/L，對仔魚的致畸作用EC50值為14.33 μg/L；致死和致畸作用的LOAEL 值分別為20.00 和13.48 μg/L。和溶劑對照組相比，盡管只有中等劑量 (18.17～44.51 μg/L) 的氟氯氰菊酯會引起胚胎受精后24 h 自主運動次數(shù)顯著增加 (圖1A)，但不同質(zhì)量濃度 (10.00～60.00 μg/L) 氟氯氰菊酯暴露均能導(dǎo)致仔魚受精后48 h 心率顯著加快和孵化率顯著升高 (圖1B、1C)，44.51 μg/L 的氟氯氰菊酯會引起受精后48 h 仔魚心包水腫、脊柱彎曲和卵黃囊水腫 (圖2B)，而24.50 和13.48 μg/L 的氟氯氰菊酯則不會引起脊柱彎曲，其致畸作用主要表現(xiàn)為心包水腫和卵黃囊水腫 (圖2C、2D)。

圖1 氟氯氰菊酯對斑馬魚胚胎和仔魚發(fā)育指標(biāo)的影響Fig. 1 The effect of cyfluthrin on developmental parameters of zebrafish embryos and larvae

圖2 氟氯氰菊酯對受精后48 h 仔魚致畸作用的典型表現(xiàn)Fig. 2 Typical manifestations of teratogenic effects of cyfluthrin on 48 h post-fertilization larvae

2.2 高效氯氟氰菊酯對斑馬魚胚胎和仔魚發(fā)育指標(biāo)的影響

高效氯氟氰菊酯對斑馬魚仔魚的受精后96 h LC50值為58.66 μg/L，對仔魚的致畸作用EC50值為46.12 μg/L；致死和致畸作用的LOAEL 值分別為10.00 和46.42 μg/L。和溶劑對照組相比，盡管只有高劑量 (46.42～100.00 μg/L) 的高效氯氟氰菊酯會引起胚胎受精后24 h 自主運動次數(shù)顯著增加 (圖3A)，中高劑量 (21.55～100.00 μg/L) 下可使胚胎受精后48 h孵化率顯著升高 (圖3B)，但不同質(zhì)量濃度 (1.00～100.00 μg/L) 高效氯氟氰菊酯暴露均能導(dǎo)致胚胎受精后48 h 心率顯著加快 (圖3C)。此外，與氟氯氰菊酯情況類似，高劑量 (46.42 μg/L) 下高效氯氟氰菊酯會引起受精后48 h 仔魚心包水腫和卵黃囊水腫 (圖4B)，而中低劑量 (2.15 和10.00 μg/L) 下則僅引起心包水腫 (圖4C、4D)。

圖3 高效氯氟氰菊酯對斑馬魚胚胎和仔魚發(fā)育指標(biāo)的影響Fig. 3 The effect of lambda-cyhalothrin on developmental parameters of zebrafish embryos and larvae

圖4 高效氯氟氰菊酯對受精后48 h仔魚致畸作用的典型表現(xiàn)Fig. 4 Typical manifestations of teratogenic effects of lambda-cyhalothrin on 48 h post-fertilization larvae

2.3 通過基準(zhǔn)劑量法推算氟氯氰菊酯對斑馬魚發(fā)育指標(biāo)的影響

氟氯氰菊酯對斑馬魚胚胎受精后96 h 死亡率、受精后96 h 畸形率、受精后48 h 心率、受精后24 h 自主運動和受精后48 h 孵化率的BMD10值分別為18.07、10.94、1.67、16.62 和10.39 μg/L，BMDL10值分別為14.56、10.75、1.17、14.54 和9.50 μg/L (表1)。由此推測受精后48 h 心率是斑馬魚胚胎暴露于氟氯氰菊酯的最敏感指標(biāo)，其后依次為受精后48 h 孵化率、受精后96 h 畸形率、受精后24 h 自主運動和受精后96 h 死亡率。氟氯氰菊酯對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性所有指標(biāo)的BMDL10值均小于LOAEL 值，其中差值最大的是受精后24 h 胚胎自主運動指標(biāo)，而差值最小的是受精后48 h孵化率。

表1 氟氯氰菊酯發(fā)育指標(biāo)的基準(zhǔn)劑量Table 1 BMD of developmental parameters after exposure to cyfluthrin

2.4 通過基準(zhǔn)劑量法推算高效氯氟氰菊酯對斑馬魚發(fā)育指標(biāo)的影響

高效氯氟氰菊酯對斑馬魚胚胎受精后96 h 死亡率、受精后96 h 畸形率、受精后48 h 心率、受精后24 h 自主運動和受精后48 h 孵化率的BMD10值分別為6.14、37.49、7.2、45.46 和6.32 μg/L，BMDL10值分別為4.83、24.74、5.17、44.15 和4.03 μg/L (表2)。由此推測受精后48 h 孵化率是斑馬魚胚胎暴露于高效氯氟氰菊酯的最敏感指標(biāo)，受精后96 h 死亡率次之，其后依次為受精后48 h 心率、受精后96 h 畸形率和受精后24 h 自主運動。和氟氯氰菊酯最敏感指標(biāo) (受精后48 h 心率) 的BMDL10值相比，高效氯氟氰菊酯最敏感指標(biāo) (受精后48 h 孵化率) 的BMDL10值更低。此外，除受精后48 h 心率外，高效氯氟氰菊酯對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性其他各項指標(biāo)的BMDL10值均小于LOAEL 值。受精后48 h 的LOAEL 值小于BMDL10值，其原因可能是由于試驗中所有劑量處理均可引起心率的變化，從而導(dǎo)致BMD 計算存在偏差。在剩下的4 項指標(biāo)中，BMDL10與LOAEL 差值最大的是受精后96 h 畸形率，而差值最小的是受精后24 h 胚胎自主運動。

表2 高效氯氟氰菊酯發(fā)育指標(biāo)的基準(zhǔn)劑量Table 2 BMD10 of developmental parameters after exposure to lambda-cyhalothrin

3 結(jié)論與討論

本研究采用基準(zhǔn)劑量法，探究了氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯對斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn)兩種藥劑對斑馬魚的5 個發(fā)育指標(biāo)均有不同程度的毒性作用。通過BMD 推算氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯對斑馬魚發(fā)育毒性指標(biāo)的敏感性，結(jié)果顯示，這兩種同屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類的殺蟲劑對斑馬魚發(fā)育毒性的最敏感指標(biāo)并不相同，其中氟氯氰菊酯的最敏感指標(biāo)為受精后48 h 心率，高效氯氟氰菊酯的最敏感指標(biāo)是受精后48 h 孵化率，且氟氯氰菊酯最敏感指標(biāo)的BMDL10值要低于高效氯氟氰菊酯最敏感指標(biāo)的BMDL10值，表明即使相同類別的不同藥劑，其對斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性仍可能存在差異。這種差異可能源自二者的理化性質(zhì)特征[18-19]，或者其結(jié)合特定受體的能力不同[20-21]，也可能來自于二者的毒代動力學(xué)差異[22-23]。

相比較而言，除了高效氯氟氰菊酯處理組的48 h 心率外，兩種藥劑其他觀測指標(biāo)的BMDL10值均低于LOAEL 值，體現(xiàn)了BMD 法的優(yōu)勢。因為相較于NOAEL 或LOAEL 法，BMD 法可依據(jù)給定的樣本量和劑量水平，進行多種數(shù)學(xué)模型的擬合，并從中選出最優(yōu)模型，進而可從實驗數(shù)據(jù)中挖掘到更多、更精準(zhǔn)的信息[24]。并且，NOAEL或LOAEL 法判定的結(jié)果必然是實驗設(shè)計中給定的一個劑量，實際的無作用劑量/最低水平劑量會小于NOAEL 或LOAEL 值，而BMD法可利用所有實驗數(shù)據(jù)進行擬合判定，從而為制定安全暴露水平提供更準(zhǔn)確可靠的結(jié)果[25]。此外，BMD 法計算的結(jié)果主要以95%置信區(qū)間的方式呈現(xiàn)，這也在一定程度上增加了其結(jié)果的可信度[16]。本研究不僅揭示了同屬Ⅱ型擬除蟲菊酯類的氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯在對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性上存在差異，還提示兩種農(nóng)藥的大多數(shù)胚胎發(fā)育毒性指標(biāo)的BMDL10值均低于LOAEL值，說明以BMDL10值作為參考，可能獲得更低、更加保守的毒性閾值。

關(guān)于高效氯氟氰菊酯的48 h 心率BMDL10值高于LOAEL 值這一特殊情況，則表明BMD 法依然依賴于實驗設(shè)計的準(zhǔn)確性[26]，因此若出現(xiàn)類似這種所有試驗劑量均引起某一指標(biāo)顯著變化的情況，則說明該BMD 法的擬合結(jié)果可能不夠準(zhǔn)確。這也說明在運用BMD 法評價化合物的毒性時，實驗設(shè)計應(yīng)該嚴(yán)格遵循毒理學(xué)實驗的原則和BMD 法的相關(guān)指南，同時也表明BMD 法仍有待進一步完善，需要在實際應(yīng)用的過程中不斷發(fā)現(xiàn)問題并加以改進。

有關(guān)BMD 法在風(fēng)險評估領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢，目前也有一些機構(gòu)提出了較為全面的評估報告。例如歐洲食品安全局 (EFSA) 認(rèn)為BMD 法相對于NOAEL 法更為準(zhǔn)確[8]，美國環(huán)保署 (EPA)也已推薦使用BMD 法評估化合物的健康風(fēng)險[27]，另外還有一些研究者嘗試采用BMD 法評價化合物的環(huán)境風(fēng)險[28-29]。然而目前我國尚未將BMD 法納入農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估標(biāo)準(zhǔn)或指南中?？紤]到BMD 方法本身仍在不斷完善，例如引入貝葉斯方法完善數(shù)學(xué)模型，引入多模型平均的概念[10]等，且BMD 評價方法正逐步受到認(rèn)可，因此其在未來的農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估當(dāng)中應(yīng)具有一定的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，BMD 法不僅可用于比較同屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類的氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯在對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性上的差異，還可以更好地挖掘?qū)嶒灁?shù)據(jù)，計算得到比傳統(tǒng)LOAEL 法所得結(jié)果更低的毒性閾值，同時還能降低對試驗劑量設(shè)計的依賴。因此，BMD 法在農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險評估方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可為風(fēng)險評估提供新的思路和策略，但其進一步的應(yīng)用與推廣仍有待深入研究和探索。