唐青松 王 麗 徐 娥 劉春艷 肖明飛 肖 昊 吳綺雯 蔣宗勇 易宏波*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，貴陽(yáng) 550025)

仔豬早期斷奶易引起腸道功能受損和生長(zhǎng)遲緩，腸道健康問(wèn)題導(dǎo)致的斷奶后仔豬死亡率為6%～10%，有時(shí)甚至高達(dá)20%[1]。過(guò)去數(shù)十年，科學(xué)研究者們對(duì)腸道功能的研究主要聚焦于腸黏膜上層(上皮細(xì)胞、緊密連接蛋白、黏液素、分泌型免疫球蛋白和抗菌肽等)，然而對(duì)腸道黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的變化知之甚少。ECM主要由膠原蛋白(collagen)、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層黏連蛋白(laminin)、肌腱蛋白(tenascin，TN)以及蛋白聚糖/氨基聚糖等組成[2]。其中，膠原蛋白分子通過(guò)1/4的錯(cuò)位排布構(gòu)成纖維狀結(jié)構(gòu)，與ECM分子相互連接構(gòu)成復(fù)雜的三維矩陣網(wǎng)絡(luò)[3]，構(gòu)成黏膜下層重要的物理屏障。整合素(integrin)是一種普遍存在于動(dòng)物細(xì)胞表面的跨膜異質(zhì)二聚體，由α和β亞基組成，是ECM之間、細(xì)胞與ECM之間的相互識(shí)別和黏附的關(guān)鍵分子[4]。ECM為組織形態(tài)提供重要的結(jié)構(gòu)支撐，且參與細(xì)胞黏附、趨化、組織修復(fù)和維持動(dòng)物機(jī)體正常穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程[5]。此外，ECM是宿主細(xì)胞和病原體之間的重要屏障，且大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)均在ECM網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的宿主細(xì)胞微環(huán)境中進(jìn)行[6-7]。研究報(bào)道，破壞秀麗隱桿線蟲(chóng)基底膜ECM會(huì)加劇上皮細(xì)胞自噬[8]。果蠅腸道基底層Ⅳ型膠原蛋白突變會(huì)引起腸上皮細(xì)胞變性和腸功能異常[9]。此外，小鼠腸道整合素基因的敲除會(huì)引發(fā)腸道炎癥[10-11]。由此可見(jiàn)，ECM對(duì)動(dòng)物腸道功能及健康有著重要的調(diào)控作用。然而，ECM在仔豬腸道上的研究還未被引起重視，尤其是仔豬斷奶的關(guān)鍵階段的變化規(guī)律至今還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究不同日齡斷奶仔豬腸道ECM的表達(dá)規(guī)律，為斷奶仔豬腸道ECM的調(diào)控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

試驗(yàn)選用24頭健康和體況相近的21日齡“杜洛克×長(zhǎng)白×大白”三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分配到6個(gè)欄中，每欄4頭。試驗(yàn)期間所有仔豬自由采食商品飼糧和自由飲水，免疫程序與保健等程序均保持一致。分別于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(斷奶后0 d)、斷奶后7 d、斷奶后14 d、斷奶后28 d從每個(gè)重復(fù)欄中隨機(jī)選擇1頭仔豬進(jìn)行麻醉后處死。剖開(kāi)仔豬腹腔后仔細(xì)收集近端十二指腸、中段空腸和遠(yuǎn)端回腸約1.5 cm的組織樣品，完全浸泡于4%的多聚甲醛中，用于制作Masson染色切片。取近端十二指腸、中段空腸和遠(yuǎn)端回腸腸段剪開(kāi)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內(nèi)容物后保存于2 mL凍存管，液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 Masson染色

保存于固定液(4%多聚甲醛)的腸道組織樣品經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟后，切片經(jīng)Masson染液套裝(Servicebio，中國(guó))進(jìn)行染色，然后脫水和中性樹(shù)膠封片成片。使用Axio Scope A1顯微鏡(Zeiss，德國(guó))觀察切片圖像，采用Image-Pro軟件(Media Cybernetics，美國(guó))采集40倍和200倍放大的圖像。

1.3 免疫熒光

Masson染色中制作的蠟塊經(jīng)切片、脫水、抗原修復(fù)和畫(huà)圈后，用牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)孵育30 min，棄掉封閉液后滴加已稀釋的一抗[Ⅰ型膠原蛋白α2鏈(COL1A2)、Ⅳ型膠原蛋白α2鏈(COL4A2)、Ⅵ型膠原蛋白(collagen Ⅵ)]4 ℃孵育過(guò)夜，玻片置于PBS中在脫色搖床上洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加已稀釋的二抗，室溫孵育50 min，滴加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染液后避光孵育10 min，滴加自發(fā)熒光淬滅劑后沖洗10 min，洗滌3次后的切片用抗熒光淬滅封片劑封片。使用Zeiss LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss，德國(guó))獲取圖像。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明提取十二指腸、空腸和回腸組織樣品總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))評(píng)估總RNA的濃度和純度。將1 μg的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)逆轉(zhuǎn)錄得到20 μL的第1鏈cDNA，加入180 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水10倍稀釋用于qRT-PCR。qRT-PCR(CFX System，Bio-Rad，美國(guó))體系為10.0 μL：5.0 μL的iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國(guó))，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，4.0 μL的cDNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)。引物序列根據(jù)NCBI中豬的基因序列，使用Primer Premier 5.0(Premier，加拿大)進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究檢測(cè)的靶基因和管家基因——β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，0 d表達(dá)量設(shè)為1.0。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot分析

將大約100 mg的空腸組織樣加入1 mL的放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)裂解液，裂解液中提前加入100×的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。冰上放置30 min，10 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液。稀釋10倍的上清液使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))檢測(cè)蛋白濃度。等量的蛋白中加入5×上樣緩沖液(Biosharp，中國(guó))，100 ℃變性8 min。取大約30 μg的蛋白質(zhì)使用7%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上，使用5%BSA封閉1 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗常溫孵育1 h。一抗COL1A2(ab96723)、COL4A2(ab125208)、Ⅵ型膠原蛋白(ab6588)、層黏連蛋白(ab11575)、纖維黏連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)(ab6328)和β-肌動(dòng)蛋白(ab8226)購(gòu)至Abcam公司。使用Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad，美國(guó))檢測(cè)蛋白條帶，采用ImageJ軟件(National Institutes of Health，美國(guó))分析條帶蛋白灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用最小顯著性(LSD)法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡斷奶仔豬腸道膠原蛋白的分布

本試驗(yàn)使用Masson染色分析了斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的膠原蛋白纖維分布情況。結(jié)果表明，十二指腸中膠原蛋白纖維主要存在于腸黏膜下層，呈纖維狀穿插于彌散淋巴組織之間，黏膜上層膠原蛋白纖維含量較少(圖1)；空腸膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層有少量膠原蛋白纖維存在(圖2)；回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維，整體呈樹(shù)狀且主要分布于集合淋巴結(jié)之間(圖3)。

0 d：斷奶后0 d；7 d：斷奶后7 d；14 d：斷奶后14 d；28 d：斷奶后28 d。下圖同。

圖2 斷奶仔豬空腸膠原纖維Masson染色

2.2 不同日齡斷奶仔豬十二指腸ECM相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律

如圖4所示，與0 d相比，7、14和28 d斷奶仔豬十二指腸COL1A2、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(COL3A1)、COL4A2、Ⅴ型膠原蛋白α1鏈(COL5A1)、Ⅵ型膠原蛋白α1鏈(COL6A1)和肌腱蛋白C(TNC)的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；28 d十二指腸COL1A2和COL3A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于14 d(P<0.01)；14 d十二指腸COL3A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于7 d(P<0.05)。與0 d相比，7和14 d斷奶仔豬十二指腸FN1和整合素α1(ITGA1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，28 d十二指腸FN1和ITGA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；28 d十二指腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于14 d(P<0.05)。與0 d相比，14 d斷奶仔豬十二指腸整合素β2(ITGB2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；14和28 d十二指腸ITGB2的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)高于7 d。

圖3 斷奶仔豬回腸膠原纖維Masson染色

與0 d相比，數(shù)據(jù)柱標(biāo)記*表示差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標(biāo)記**表示差異極顯著(P<0.01)；#表示7、14和28 d之間差異顯著(P<0.05)，##表示7、14和28 d之間差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 不同日齡斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律

如圖5所示，與0 d相比，7 d斷奶仔豬空腸COL1A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，14和28 d空腸COL1A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；7、14和28 d空腸COL3A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，且28 d空腸COL3A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于7 d(P<0.05)；7和14 d空腸COL4A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，且28 d空腸COL4A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；7 d空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，28 d空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于7 d(P<0.05)；14和28 d空腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，且28 d空腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于7 d(P<0.05)；28 d空腸TNC和ITGB2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于7 d(P<0.01)，且28 d空腸ITGB2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于14 d(P<0.01)；7和14 d空腸ITGA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，28 d空腸ITGA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，且顯著低于7和14 d(P<0.05)。

圖5 斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律

2.4 不同日齡斷奶仔豬回腸ECM相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律

如圖6所示，與0 d相比，7 d斷奶仔豬回腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，且14 d和28 d回腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)高于7 d。斷奶仔豬回腸COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1、TNC、ITGA1和ITGB2的mRNA相對(duì)表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖6 斷奶仔豬回腸ECM相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律

2.5 不同日齡斷奶仔豬空腸ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)規(guī)律與免疫熒光分析

不同腸段中，斷奶對(duì)仔豬十二指腸ECM相關(guān)蛋白的影響最大，其次是空腸，對(duì)回腸影響最小。本試驗(yàn)采用空腸組織測(cè)定ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)規(guī)律，如圖7所示，與0 d相比，14和28 d斷奶仔豬空腸COL1A2、COL4A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，7 d空腸COL1A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)降低；14和28 d空腸層黏連蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)降低，且28 d空腸層黏連蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于7 d(P<0.05)；14和28 d空腸FN1的蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，且14 d空腸FN1的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于7 d(P<0.05)。

3 討 論

ECM為組織形態(tài)提供重要的結(jié)構(gòu)支撐，且參與細(xì)胞黏附、趨化、組織修復(fù)和維持機(jī)體正常穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程。研究報(bào)道，ECM的過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致腸道纖維化、炎癥以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加等病理現(xiàn)象[5,12-14]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)腅CM有助于動(dòng)物的腫瘤免疫[15-16]。因此，ECM是斷奶仔豬腸道功能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，斷奶會(huì)降低仔豬十二指腸和空腸膠原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型膠原蛋白)、FN1、層黏連蛋白、TNC、ITGA1和ITGB2的表達(dá)和分泌，并且降低了斷奶后7 d回腸FN1的表達(dá)。

膠原蛋白是ECM的主要組成成分，占哺乳動(dòng)物體內(nèi)總蛋白的25%～35%[17]。迄今為止，脊椎動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)28種不同類型的膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是動(dòng)物最豐富的膠原蛋白，約占總膠原蛋白的90%[17-18]。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型和Ⅵ型膠原蛋白是典型的纖維形成膠原蛋白，能夠組裝形成具有特征性的1/4交錯(cuò)排列的纖維矩陣網(wǎng)絡(luò)[3]。Ⅳ型膠原蛋白是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠原蛋白，負(fù)責(zé)穩(wěn)定整體ECM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]。本試驗(yàn)利用Masson染色分析了斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的膠原蛋白纖維分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)十二指腸、空腸和回腸中膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層膠原蛋白纖維分布較少，且回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維，整體呈樹(shù)狀且主要分布于集合淋巴結(jié)之間。本試驗(yàn)空腸的免疫熒光顯示，COL1A2主要呈小點(diǎn)狀分布于腸道黏膜上層，COL4A2呈纖維狀分布于腸黏膜下層，而Ⅵ型膠原蛋白在腸黏膜上層和下層均有較多分布，我們猜測(cè)Ⅵ型膠原蛋白可能是仔豬腸道中存在的主要膠原蛋白類型。Ⅵ型膠原蛋白是由3條不同的α鏈組成的三聚體，具有獨(dú)特的微纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]；Ⅵ型膠原蛋白中還存在參與蛋白質(zhì)互作的von Willebrand結(jié)構(gòu)域[19]，但其具體的生物學(xué)功能至今仍然還未見(jiàn)報(bào)道。

A為空腸蛋白條帶；B、C、D、E和F依次分別為COL1A2、COL4A2、Ⅵ型膠原蛋白、層黏連蛋白和FN1的蛋白條帶灰度值分析；G為空腸免疫熒光，圖片放大倍數(shù)為200。

膠原蛋白能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道形態(tài)和腸道屏障功能，并在腸道組織免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[20]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型膠原蛋白突變會(huì)引起果蠅腸上皮細(xì)胞變性、腸功能腸道障礙和形態(tài)異常[9]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后7、14和28 d十二指腸COL4A2、COL5A1和COL6A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低，且COL1A2和COL3A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均在斷奶后14 d最低，呈現(xiàn)出隨著時(shí)間的推移先降低后升高的趨勢(shì)。在空腸中，COL1A2、COL3A1和COL4A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均隨著斷奶后時(shí)間的推移而更為顯著降低，但COL5A1和COL6A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在斷奶后7 d最低，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。研究報(bào)道，對(duì)160個(gè)豬場(chǎng)的12 034頭仔豬進(jìn)行28 d的統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斷奶后3～4 d仔豬開(kāi)始腹瀉，斷奶后7～9 d腹瀉最為嚴(yán)重，斷奶后21 d仍然有很高的腹瀉率[21]。這與本試驗(yàn)?zāi)c道膠原蛋白的變化較為一致，尤其是十二指腸中的COL1A2和COL3A1和空腸中的COL5A1和COL6A1的mRNA表達(dá)變化，這可能是導(dǎo)致ECM變化的一個(gè)重要原因。然而，仔豬斷奶對(duì)回腸膠原蛋白mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性影響，這可能與回腸末端組織較為鈍化有關(guān)。此外，空腸COL1A2、COL4A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，仔豬斷奶后7～28 d空腸COL1A2和Ⅵ型膠原蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而空腸COL4A2的蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)H在斷奶后14和28 d顯著降低，這與基因表達(dá)結(jié)果基本相似。以上結(jié)果表明，斷奶應(yīng)激可能會(huì)降低斷奶仔豬空腸膠原蛋白的表達(dá)和分泌。

FN和層黏連蛋白是ECM的重要組成部分，屬于非膠原糖蛋白，它們具有既可與細(xì)胞結(jié)合，又可與ECM其他大分子結(jié)合的共同特點(diǎn)[3]。TNC是一種六聚體大分子ECM糖蛋白，是動(dòng)物組織炎癥、機(jī)械應(yīng)變、損傷和形成之間的匯聚節(jié)點(diǎn)[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后十二指腸FN1和TNC的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，斷奶后14和28 d空腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，回腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在斷奶后4 d降到最低后在14和28 d恢復(fù)到未斷奶時(shí)的水平。空腸FN1蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)相似。另外，本研究還檢測(cè)了層黏連蛋白的蛋白表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量同樣是在斷奶后14和28 d顯著降低。以往研究表明，F(xiàn)N1的表達(dá)上調(diào)會(huì)通過(guò)增加甲基化而降低蛋白酪氨酸磷酸酶受體M型，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器和激活子3磷酸化增加，促進(jìn)惡性膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞增殖[24]。此外，TNC被成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞廣泛分泌會(huì)引起動(dòng)物炎癥疾病[25]，且通過(guò)激活細(xì)胞因子參與組織損傷[26]。即使目前大多研究表明，F(xiàn)N1、層黏連蛋白和TNC的表達(dá)增多會(huì)導(dǎo)致組織損傷和腫瘤等疾病，但本試驗(yàn)中膠原蛋白、FN1、層黏連蛋白和TNC的表達(dá)在斷奶后卻降低了，這提示斷奶仔豬腸道ECM的降低另有其因，這仍需未來(lái)加以深入研究。

整合素是ECM分子之間和ECM與細(xì)胞之間的重要連接分子。整合素是具有二聚體的跨膜蛋白，一端連接胞內(nèi)的微絲，另一端跨膜連接胞外已固定在膠原蛋白纖維上的FN[27]。ITGA1和ITGB2是整合素的2個(gè)重要配體。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斷奶后7～28 d十二指腸ITGA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，但斷奶后14 d十二指腸ITGB2的mRNA相對(duì)表達(dá)量卻顯著提高。此外，斷奶后7～28 d空腸ITGA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，斷奶沒(méi)有引起空腸ITGB2的mRNA表達(dá)的變化，但相比斷奶后28 d與7 d和14 d相比極顯著提高。以往研究表明，敲除小鼠整合素基因會(huì)引起腸道炎癥和腸通透性增加[11]。此外，整合素與FN、層黏連蛋白等ECM相關(guān)蛋白在限制和促進(jìn)豬流行性腹瀉病毒感染中具有重要調(diào)控作用[28]。由此可見(jiàn)，整合素與ECM分子相互依存并發(fā)揮屏障和免疫調(diào)控作用，這與本試驗(yàn)?zāi)z原蛋白和FN、層黏連蛋白和TNC的表達(dá)較為一致。

4 結(jié) 論

① 不同日齡斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸中膠原蛋白纖維主要分布于腸黏膜下層，腸黏膜上層膠原蛋白纖維分布較少，且回腸具有比十二指腸和空腸更加豐富的膠原蛋白纖維。

② 仔豬斷奶后十二指腸和空腸的膠原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型膠原蛋白)、FN1、層黏連蛋白、TNC、ITGA1和ITGB2的表達(dá)和分泌降低；十二指腸COL1A2、COL3A1和FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在斷奶后14 d降到最低，空腸COL5A1和COL6A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在斷奶后7 d降到最低；仔豬斷奶后7 d回腸FN1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，但斷奶對(duì)其他ECM相關(guān)基因表達(dá)無(wú)顯著影響。