羅 靚,易天新,冷文飛

(1.重慶市中西醫(yī)結合康復醫(yī)院,重慶 400013；2.重慶市墊江縣中醫(yī)院,重慶 408300)

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是臨床常見的慢性退行性關節(jié)疾病,以關節(jié)疼痛、關節(jié)活動受限、晨僵、關節(jié)腫脹為主要臨床特點,其發(fā)病機制復雜,通常認為與炎癥、創(chuàng)傷、代謝、遺傳、免疫反應等多種因素相關。目前臨床治療KOA主要通過口服抗炎止痛藥、關節(jié)腔注射藥物、康復理療、手術等方法緩解疼痛,改善功能狀態(tài),但均存在一定的局限性。而中醫(yī)藥治療KOA具有療效顯著、不良反應小等優(yōu)勢[1]。薏苡仁湯出自清·林珮琴《類證治裁》,由薏苡仁、蒼術、羌活、麻黃、桂枝、獨活、當歸、川芎、防風、川烏、生姜、甘草12味中藥組成,有祛風除濕、散寒通絡止痛的功效。研究顯示,薏苡仁湯能緩解KOA患者的疼痛癥狀,改善其膝關節(jié)功能,且安全性較好[2]。本研究運用網絡藥理學方法,將薏苡仁湯的活性化學成分及關鍵作用靶點篩選后進行聚類分析,構建“中藥復方-成分-靶點-通路-疾病”網絡,探討其治療KOA的有效藥物成分和可能作用機制,為新藥的研發(fā)和臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 薏苡仁湯有效活性成分篩選 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以薏苡仁湯所含的12味中藥作為Herb name,設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件檢索有效活性成分[3]。

1.2 有效活性成分靶點預測 采用TCMSP數據庫檢索有效活性成分的靶點蛋白名稱,并通過Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)轉換為基因名。

1.3 KOA疾病相關靶點信息收集 將“knee osteoarthritis”作為關鍵詞分別輸入DisGeNET(http://www.disgenet.org/search)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中,檢索KOA疾病靶點,分別設置Score≥0.3和Score≥10,刪除重復基因。

1.4 疾病與藥物共同靶點和核心活性成分篩選 運用Venny 2.1.0平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對薏苡仁湯有效活性成分靶點與KOA疾病相關靶點進行映射,獲得共同靶點。將共同靶點和對應的中藥活性成分輸入Cytoscape 3.7.1進行關聯,根據中介中心性(BC)對活性成分進行降序排列,篩選出核心活性成分。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡繪制 將藥物與疾病的交集靶點基因輸入STRING數據庫(http://string-db.org)中,設置置信度≥0.4和“homo sapiens(人屬)”為關鍵詞,繪制PPI網絡圖,根據分析結果統計靶標蛋白關聯頻次。

1.6 基因富集分析 通過R軟件Cluster Profile程序包(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)對篩選出的共同基因進行GO功能、KEGG通路富集分析后繪制柱狀圖、氣泡圖進行可視化處理。

1.7 中藥復方-成分-靶點-通路-疾病網絡構建 根據薏苡仁湯、有效活性成分、靶點、通路與KOA之間的關系,建立中藥復方-成分-靶點-通路-疾病網絡。采用Cytoscape 3.7.1進行可視化處理。

2 結果

(1)薏苡仁湯的有效活性成分篩選 收集薏苡仁湯12味中藥中不同活性成分共168種,其中薏苡仁9種,蒼術9種,羌活15種,獨活9種,防風18種,川烏3種,麻黃23種,桂枝7種,當歸2種,川芎7種,生姜5種,甘草92種。不同藥物中含有共同的活性成分,這些成分在發(fā)揮作用時可能起到增效作用。見表1。

表1 薏苡仁湯的有效活性成分

續(xù)表

(2)藥物靶點與疾病靶點的交集預測和核心活性成分篩選 利用Uniprot、TCMSP數據庫篩選出有效活性成分不同的藥物靶點212個,通過DisGeNET、GeneCards數據庫檢索到KOA疾病靶點198個,導入Venny 2.1.0進行映射后獲得交集靶點28個。藥物-疾病的交集靶點可認為是薏苡仁湯干預KOA的潛在基因靶點,見表2。將28個基因靶點與其對應的中藥活性成分進行關聯,根據BC對活性成分進行降序排列,篩選出主要核心活性成分為谷甾醇、甘露醇、漢黃芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。

表2 薏苡仁湯干預膝骨關節(jié)炎的潛在基因靶點

(3)PPI網絡圖 將28個交集靶點導入STRING平臺,設置置信度≥0.4和“homo sapiens(人屬)”為關鍵詞,構建PPI網絡圖(圖1見正文第125頁)?；赟TRING平臺構建共獲得28個節(jié)點,296條邊,平均Degree為21.2,其中節(jié)點表示靶標蛋白,每條邊表示靶標蛋白之間的作用關系。按點度中心性值降序排列后對核心作用靶點進行篩選,得到的核心靶點前10位為白細胞介素-6(IL-6)、趨化因子配體2(CCL2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、白細胞介素-1B(IL-1B)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2)、纖連蛋白1(FN1)、趨化因子配體8(CXCL8)。

圖1 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎28個交集靶點PPI網絡圖

(4)GO功能和KEGG通路富集分析 通過R軟件和Cluster Profile程序包,以P＜0.05為篩選條件,對薏苡仁湯治療KOA的潛在靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。①GO功能富集分析:A.生物過程1 162個,主要涉及細胞外基質組織形成、細胞黏附調節(jié)、細胞外結構組織形成、神經炎性反應調節(jié)、炎性反應調節(jié)、白細胞遷移、急性期反應、細胞間黏附正調節(jié)等(圖2見正文第125頁)。B.細胞組分8個,包括細胞外基質膠原蛋白、內質網腔、纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、膠原三聚體、膠原三聚體復合物、細胞外基質成分、血小板α顆粒內腔(圖3見正文第125頁)。C.分子功能30個,包括細胞因子活性、受體配體活性、細胞因子受體結合、生長因子受體結合、整聯蛋白結合、生長因子活性、金屬內肽酶活性、細胞黏附分子結合、絲氨酸型內肽酶活性、細胞外基質結構組成等(圖4見正文第125頁)。②KEGG通路富集分析71條,取排名前20位進行分析,發(fā)現由高到低依次為糖基化終產物及其受體信號通路、類風濕關節(jié)炎、IL-17信號通路、阿米巴病、流體剪切應力、動脈粥樣硬化等,用高級氣泡圖列舉排名前20位的條目,氣泡大小表示富集的通路條數,顏色表示P值大小(圖5見正文第125頁)。

圖2 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎GO功能生物過程分析

圖3 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎GO功能細胞組分分析

圖4 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎GO功能分子功能分析

圖5 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎KEGG通路富集高級氣泡圖

(5)構建中藥復方-成分-靶點-通路-疾病網絡 根據中藥復方、成分、靶點、通路、疾病之間的關系,通過Cytoscape 3.7.1進行網絡可視化。在導出的網絡圖(圖6見正文第125頁)中,用不同顏色節(jié)點表示活性成分、靶點、通路等,黃色菱形節(jié)點表示薏苡仁湯,紅色菱形節(jié)點表示KEGG和KOA,粉紅色圓形節(jié)點表示核心活性成分,藍色正方形節(jié)點代表核心作用靶點,綠色六邊形節(jié)點代表作用信號通路,各節(jié)點之間構成關系通過邊連接。圖中顯示同一靶點對應多個作用通路和多個作用靶點對應同一通路的關系。

圖6 薏苡仁湯治療膝骨關節(jié)炎中藥復方-成分-靶點-通路-疾病網絡圖

3 討論

近年來KOA的發(fā)病率不斷上升,但其病因尚不完全明確,可能與多種細胞因子調控和多基因表達有關[4]。KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇,《黃帝內經》言:“病在骨者,骨重不可舉,骨髓酸痛,寒氣至,名曰骨痹?！惫屎疂裥凸潜杂捎谒伢w外感風寒濕邪,內外之邪痹阻經脈所致。薏苡仁湯有祛風除濕、散寒通絡止痛的功效,其中薏苡仁、蒼術健脾除濕,桂枝、川烏、麻黃溫經散寒兼除濕,川芎、當歸養(yǎng)血活血,防風、獨活、羌活祛風勝濕,生姜溫中散寒,甘草調和諸藥。有研究表明,薏苡仁具有調節(jié)免疫功能、調整代謝紊亂的作用[5-6],麻黃具有抗炎、調節(jié)免疫的作用[7],防風可抗骨質疏松[8],獨活、當歸均可抗炎及保護軟骨[9-10],羌活、川烏可抗炎鎮(zhèn)痛[11-12],蒼術、桂枝、川芎、生姜均有抗炎作用[13-16]。雖然現代研究對薏苡仁湯中各主要成分的藥理作用研究較多,但對其治療KOA的作用機制報道較少。

本文基于網絡藥理學方法,對薏苡仁湯治療KOA的作用機制進行了初步研究,發(fā)現薏苡仁湯治療KOA的核心成分為谷甾醇、甘露醇、漢黃芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。有研究表明,血清膽固醇是骨關節(jié)炎(OA)進展的危險因素,在OA早期可觀察到軟骨內脂質沉積[17],谷甾醇有降低血清膽固醇的作用,從而延緩OA進程。漢黃芩素是一種類黃酮,通過抑制氧化應激、軟骨細胞凋亡,增加軟骨生成標記物的表達,抑制炎癥介質表達以治療OA[18]。有研究借助薄層色譜法驗證了槲皮素與IL-6蛋白對接良好,對KOA發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抗炎作用[19]。然而,目前對于甘露醇、柚皮素、花旗松素治療KOA的機制研究較少,尚需進一步研究驗證。

通過分析PPI網絡圖發(fā)現,薏苡仁湯治療KOA的核心蛋白包 括 IL-6、CCL2、MMP-9、VEGFA、MMP-2等。IL-6是一種促炎細胞因子,對于慢性炎性反應有重要意義,滑膜成纖維細胞分泌IL-6后,促炎性mRNA表達增加[20]。CCL2是一種高特異性趨化因子,機械刺激間充質細胞誘導CCL2募集經典單核細胞,這些細胞可以分化為吸收骨的破骨細胞,其遺傳消融或對其細胞表面趨化因子受體2(CCR2)的藥理靶向作用減輕了機械誘導的關節(jié)炎惡化[21]。VEGFA屬于血小板衍生生長因子(PDGF)/VEGF生長因子家族,在關節(jié)炎癥進展中參與了誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制凋亡等過程,而其剪接軸的變化與關節(jié)炎癥相關[22]。MMP-2和MMP-9同屬于明膠酶類,MMP-2在不同類型的關節(jié)炎中可促進細胞外基質降解,某些促炎細胞因子的釋放也通過MMP-2激活來調節(jié),導致進一步的組織破壞[23]。MMP-9多與關節(jié)軟骨所受壓應力所致關節(jié)軟骨Ⅳ型膠原纖維降解有關[24]。

GO富集分析結果顯示,薏苡仁湯治療KOA與細胞外基質組織、細胞黏附調節(jié)、細胞外結構組織形成、神經炎性反應等生物合成與代謝過程有關。有研究表明,軟骨細胞外基質的合成與降解之間平衡狀態(tài)的維持是OA發(fā)生與否的關鍵因素[25]。細胞組分涉及細胞外基質膠原蛋白、內質網腔、纖維狀膠原三聚體等,這些成分可能參與了細胞增殖與凋亡、炎性反應等過程。分子功能涵蓋細胞因子活性、受體配體活性、細胞因子受體結合、生長因子受體結合、整聯蛋白結合等。薏苡仁湯治療KOA的KEGG信號通路多與調節(jié)免疫和抗炎有關,主要有糖基化終產物及其受體信號通路、類風濕關節(jié)炎、IL-17信號通路等,而糖基化終產物及其受體信號通路多與糖尿病相關疾病有關,作用于KOA的報道較少,或可成為新的探索思路。

綜上所述,薏苡仁湯可通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮對KOA的治療作用,為后續(xù)的藥物研發(fā)和臨床治療提供了新的方向。

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張仲景所著《傷寒雜病論》提示,中醫(yī)應用方藥治病的方法為“觀其脈證,知犯何逆,隨證治之”,陳建國所著《經方脈證圖解》就是對這一方法的踐行。臨床應用一張方治病能夠取效,是因為符合了這張方對應的病機,而相應的病機會客觀地體現在脈診信息中,對應于某一張方病機的脈診信息,就是這張方的脈證。臨床中,只要準確把握一張方的脈證和方證,就可以準確地應用方藥治病。本書以圖示的方式,通過對50張常用經方“病機脈證圖”的詳細闡釋,既能夠幫助讀者領會經方對應的病機,也能夠幫助其掌握對應的脈證。書中還解讀了經方的方證,對藥物組成相似或病機相似的經方,從脈證的角度進行了詳細的鑒別,對于指導經方的臨床應用有很高的參考價值。

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