陳 儉，代冰濤，王紅明，宋守鋼，譚北平，2，章 雙，2*

（1廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】珍珠龍膽石斑魚（Epinephelu fus‐coguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）是以褐點(diǎn)石斑（E.fuscoguttatus）為母本、鞍帶石斑魚（E.lanceo‐latus）為父本雜交培育獲得（Koh et al.，2008；王麗娜等，2017），也稱為龍虎斑，是一種生性兇猛的肉食性魚類，隸屬于鱸形目（Perciformes）鱸亞目（Percoidei）鮨科（Serranidae）。因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者喜愛，且生長(zhǎng)速度快，市場(chǎng)價(jià)值高。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖致使其養(yǎng)殖環(huán)境惡化，進(jìn)而導(dǎo)致病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（羅鳴等，2013）。免疫增強(qiáng)劑是指通過提高機(jī)體非特異性免疫功能以增強(qiáng)對(duì)外界應(yīng)激和病原感染抵抗能力的物質(zhì)，具有安全性、廣泛性及穩(wěn)定性等特點(diǎn)，能有效解決傳統(tǒng)化學(xué)藥物防治引起的耐藥性、藥物殘留及水體污染等問題（An‐derson，1992）。因此，在飼料中添加免疫增強(qiáng)劑替代化學(xué)藥物是魚蝦類等水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控的新方向?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已有較多研究報(bào)道（韓夢(mèng)瑤等，2021），其中又以β-葡聚糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用最廣泛，主要用于改善生長(zhǎng)性能和增強(qiáng)免疫力，以及提高機(jī)體抗氧化能力、促進(jìn)消化和優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)等（許冰瑩和邵慶均，2019）。Bahmani等（2000）以不同水平的β-葡萄糖喂養(yǎng)波斯鱘魚（Acipenser persicus），結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)性能顯著提高。Ji等（2017）研究表明，β-葡聚糖不僅能明顯提高虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）特異性生長(zhǎng)速率、體重增加和飼料效率，還能使其在應(yīng)對(duì)殺鮭氣單胞菌感染時(shí)的存活率顯著增加。Reyes-Becerril等（2018）對(duì)太平洋紅鯛魚（Lutjanus peru）的外周血白細(xì)胞進(jìn)行體外測(cè)定，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖組能顯著增加魚體的非特異性免疫應(yīng)答，在受到細(xì)菌感染后體內(nèi)的過氧化物酶活性顯著增強(qiáng)。Li等（2019）研究表明，在飼料中添加β-葡聚糖不僅可改善凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的消化酶活性、抗氧化能力和免疫能力，還能大量增加芽孢桿菌等益生菌，優(yōu)化腸道中定殖微生物群結(jié)構(gòu)。Nguyen等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，在鯉魚（Cyprinus carpio）養(yǎng)殖過程中以植物油形式在基礎(chǔ)飼料中添加β-葡聚糖能抑制體內(nèi)的一些炎癥反應(yīng)，且對(duì)其免疫調(diào)節(jié)無顯著負(fù)面影響。β-葡聚糖在石斑魚產(chǎn)業(yè)也有廣泛應(yīng)用，不僅可降低石斑魚在運(yùn)輸過程中帶來的損傷（Wu et al.，2020），還可作為珍珠龍膽石斑魚哈維氏弧菌疫苗的免疫佐劑（Wei et al.，2020），也可減輕土霉素對(duì)珍珠龍膽石斑魚造成的不良影響（Lee et al.，2020）。此外，張海艷等（2018）采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析腹腔注射β-葡聚糖對(duì)斜帶石斑魚的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖可引起魚體免疫相關(guān)基因差異表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)β-葡聚糖可作為新型漁業(yè)免疫增強(qiáng)劑?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，β-葡聚糖作為飼料添加劑在石斑魚上的研究主要集中在生長(zhǎng)性能及免疫相關(guān)生化指標(biāo)等方面（Chang et al.，2013；Lee et al.，2020），而鮮見從轉(zhuǎn)錄組水平分析差異表達(dá)免疫基因和腸道優(yōu)勢(shì)菌群的研究報(bào)道，特別是以β-葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑對(duì)珍珠龍膽石斑魚免疫途徑的分子機(jī)制及作用通路尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】以珍珠龍膽石斑魚為研究對(duì)象，通過在飼料中添加β-葡聚糖進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，考察β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)的影響，并進(jìn)行高通量測(cè)序及腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，旨在明確β-葡聚糖誘導(dǎo)珍珠龍膽石斑魚的免疫響應(yīng)機(jī)制，為β-葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料配方

β-葡聚糖來源于釀酒酵母，購(gòu)自青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司?；A(chǔ)飼料配方如表1所示，其粗蛋白含量為50.18%、粗脂肪含量為11.63%。以基礎(chǔ)飼料組為對(duì)照組，參考吳春玉等（2013）、李永娟等（2015）的研究結(jié)果，在基礎(chǔ)飼料中添加100 mg/kg β-葡聚糖。飼料原料粉碎后過60目篩，準(zhǔn)確稱取各飼料原料，將β-葡聚糖按逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，采用雙螺桿擠條機(jī)（F-75華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠）加工成2.0和2.5 mm規(guī)格的飼料。飼料制作完成在通風(fēng)處風(fēng)干，用自封袋密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成配方（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Basic feed composition（dry matter basis）

1.2 試驗(yàn)用魚及養(yǎng)殖管理

珍珠龍膽石斑魚苗購(gòu)自廣東省湛江市雷州石斑魚苗場(chǎng)，購(gòu)回后暫養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地室內(nèi)的海水魚養(yǎng)殖系統(tǒng)1000 L玻璃鋼桶中，期間投喂商品料，馴化1周后隨機(jī)挑選規(guī)格一致、初始平均體重為6.12±0.22 g、健壯無病的珍珠龍膽石斑魚置于玻璃鋼桶（500 L）中進(jìn)行養(yǎng)殖。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理（對(duì)照組和β-葡聚糖組），每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾魚，養(yǎng)殖8周。養(yǎng)殖期間，按魚體重3%進(jìn)行表觀飽食投喂2次（8：00和17：00），投喂量依據(jù)攝食情況和天氣變化及時(shí)調(diào)整。投喂1 h后通過虹吸法清除殘餌和糞便，每天換水1次，每次換水量為50%。試驗(yàn)期內(nèi)養(yǎng)殖車間由自然光照提供光源，水溫28~30 ℃，海水鹽度為26.5‰~28.0‰，連續(xù)充氧，溶解氧含量>6.8 mg/L，pH 7.8~8.2，氨氮含量<0.03 mg/L。記錄養(yǎng)殖過程中試驗(yàn)魚的異常現(xiàn)象。

1.3 樣本采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，空腹24 h后稱取每桶珍珠龍膽石斑魚總重，記錄存活尾數(shù)，體重和體長(zhǎng)用于生長(zhǎng)性能分析。以丁香酚進(jìn)行麻醉后，通過尾靜脈取血法抽取全血，每個(gè)重復(fù)6尾魚，每尾魚抽取1 mL，前3尾全血放入裝有抗凝劑的無菌防爆管，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；后3尾全血置于離心管中，離心收集上清液，分裝后-80 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)測(cè)定。采集完血剩下的試驗(yàn)魚解剖3尾取胃和腸道，剔除內(nèi)容物及腸系膜，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，置于防爆管中，液氮速凍后-80 ℃保存。取出待測(cè)樣品在4 ℃下解凍，用剪刀剪成小塊，加入10倍體積的預(yù)冷生理鹽水，高速組織勻漿機(jī)冰浴勻漿，勻漿液經(jīng)2500 r/min離心10 min后取上清液，用于測(cè)定消化酶活性。每個(gè)重復(fù)取4尾珍珠龍膽石斑魚，用75%酒精擦拭體表，無菌條件下剖取中腸，以無菌生理鹽水漂洗后裝入無菌防爆管中，液氮速凍后-80 ℃保存，用于腸道微生物測(cè)定。同時(shí)，對(duì)飼料進(jìn)行常規(guī)分析，其中粗蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量測(cè)定采用索氏提取法。

1.4 生長(zhǎng)性能分析

珍珠龍膽石斑魚的存活率、增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、肝體比及肥滿度分別按以下公式計(jì)算：

存活率（SR，%）=Nt/N0×100

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100

飼料系數(shù)（FCR）=F/（Wt+Wn-W0）

肝體比（HSI，%）=肝臟重/全魚重×100

肥滿度（CF，g/cm2）=Wi/（L3）×100

式中，Nt為終末珍珠龍膽石斑魚尾數(shù)，N0為初始珍珠龍膽石斑魚尾數(shù)，Wt為終末珍珠龍膽石斑魚總重，W0為初始珍珠龍膽石斑魚總重，Wn為死亡個(gè)體總量，t為養(yǎng)殖時(shí)間，F(xiàn)為攝入飼料干重，Wi為珍珠龍膽石斑魚體重（g），L為珍珠龍膽石斑魚體長(zhǎng)（cm）。

1.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

珍珠龍膽石斑魚血清生化指標(biāo)采用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次，血清生化指標(biāo)包括總蛋白（Total protein，TP）、葡萄糖（Glucose，GLU）、總膽固醇（To‐tal cholesterol，TCHO）、總甘油三酯（Total triglyceride，TG）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）、胃蛋白酶（Pepsin）、腸胰蛋白酶（Trypsin）、腸淀粉酶（Amy‐lase）、腸脂肪酶（Lipase）活性。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

1.6.1 測(cè)序文庫構(gòu)建及Illumina測(cè)序 用TRIzol?試劑（美國(guó)Invitrogen公司）從血細(xì)胞中提取總RNA，以帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若為原核生物，則用試劑盒去除rRNA）。加入Fragmenta‐tion Buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)Qia Quick PCR試劑盒純化并加入EB緩沖液洗脫后進(jìn)行末端修復(fù)、加poly（A）尾并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫委托廣州基迪奧生物科技有限公司，采用Illumina HiSeqTM4000進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2 轉(zhuǎn)錄組De novo組裝 Illumina測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw date）進(jìn)行過濾，去除含Adaptor的Reads、低質(zhì)量Reads（Q≤20的堿基數(shù)占整個(gè)Read的40%以上）、N率≥10%的Reads，得到高質(zhì)量的Clean reads。使用Trinity進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組De novo組裝：首先將具有一定長(zhǎng)度overlap的Reads連成更長(zhǎng)的片段，再通過Reads overlap得到不含N的組裝片段即組裝獲得Unigenes。

1.6.3 轉(zhuǎn)錄組注釋分析 注釋前利用Trinity提供的ORF預(yù)測(cè)流程對(duì)組裝的Unigenes進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，通過HMMER 3.0對(duì)組裝的Unigenes在Pfam數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白家族注釋分析。設(shè)定期望值<0.00001，使用BLASTx對(duì)拼接所得的所有核苷酸序列分別在Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.6.4 差異表達(dá)基因富集分析 使用Bowtie將Clean reads比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組序列上，通過RSEM對(duì)Bowtie比對(duì)結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析，以RPKM/FPKM衡量基因的表達(dá)量水平，并運(yùn)用edgeR進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。FDR≤0.05且|log2FC（Sample2/Sample1）|≥1，則該基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因。然后利用Blast2 GO在GO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能分類注釋，并在KEEG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行代謝通路富集分析。

1.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性，選擇保存在-80 ℃用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，包括肌紅蛋白（Myoglobin）基因、絮凝蛋白FLO11（SPRR3）基因、Septin-5基因、細(xì)胞表面糖蛋白（MCAM）基因、血清剝奪反應(yīng)因子（SDPR）基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白（Pol）基因、Kruppel-like因子9（KLF9）基因、干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）基因、C-myc啟動(dòng)子結(jié)合蛋白（DENND4A）基因和肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（FKBP5）基因。差異表達(dá)基因擴(kuò)增引物序列如表2所示，以EF1α為內(nèi)參基因。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃15 s，60 ℃10 s，72 ℃20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法換算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 2 Real-time fluorescent quantitative PCR amplified primer sequence information

1.7 腸道菌群組成分析

1.7.1 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收 采用美國(guó)Hipurte PowerSoil?的DNA Isolation Kit試劑盒完成珍珠龍膽石斑魚腸道細(xì)菌總DNA提取，采用16S rDNA序列V3~V4區(qū)通用引物（341F：5'-CCTAYGGGRBGCAS CAG-3'；806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：5×FastPfu Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μL，DNA模板10 ng，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后利用成像系統(tǒng)檢測(cè)，并在紫外燈下割取目的條帶，隨后按凝膠回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說明純化目的產(chǎn)物，最后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果。將DNA濃度調(diào)至25 ng/μL，所有樣品按1∶1混勻后，通過Illumina HiSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行建庫及測(cè)序，委托廣州賽哲生物科技股份有限公司完成。

1.7.2 信息學(xué)分析 得到Clean Tags后進(jìn)行OTUs聚類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況；同時(shí)對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Al‐pha多樣性分析（包括物種豐富度指數(shù)Chao1和ACE，多樣性指數(shù)Shannon和Simpson），明確樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等；最后在門和屬2個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的物種豐度和物種分布，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.04對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以分析組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

與對(duì)照組相比，添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚的終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率（P<0.05，下同）。β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚的存活率和肥滿度也高于對(duì)照組，肝體比低于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05，下同）。在飼料系數(shù)方面，β-葡聚糖組顯著高于對(duì)照組（表3）。

表3 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of adding β-glucan to feed on growth perfor‐mance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.2 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清生化和免疫指標(biāo)的影響

如表4所示，飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚血清中總蛋白含量，同時(shí)顯著降低總膽固醇和總甘油三酯水平。與對(duì)照組相比，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均呈下降趨勢(shì)，其中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈顯著下降趨勢(shì)。添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性未造成顯著影響，但可使過氧化氫酶和溶菌酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著降低。

表4 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清生化和免疫指標(biāo)的影響Table 4 Effects of adding β-glucan to feed on serum biochemical and immune indexes of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.3 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚消化酶的影響

如表5所示，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚的胃蛋白酶和腸道脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組，而胰蛋白酶和腸淀粉酶活性與對(duì)照組相比無顯著差異。

表5 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚消化酶的影響Table 5 Effects of adding β-glucan to feed on digestive en‐zyme of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.4 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚轉(zhuǎn)錄組的影響

2.4.1 測(cè)序及序列組裝結(jié)果 利用Illumina HiSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，濾掉低質(zhì)量堿基后得到的有效堿基（Clean bases）數(shù)目為8194810200個(gè)，Clean bases占總堿基數(shù)的98.50%。原始Reads濾過后得到54632068條Clean reads，占原始Reads的97.14%，其中GC含量為49.96%、Q20為98.50%、Q30為95.50%。采用Trinity對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝，共獲得79291條Unigenes，其長(zhǎng)度范圍為201~20143 bp，所有Unige‐nes長(zhǎng)度均大于200 bp，平均長(zhǎng)度為941 bp，Unigenes的N50為2141 bp。進(jìn)一步對(duì)Unigenes進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著序列長(zhǎng)度的增加，Unigenes分布數(shù)量呈逐級(jí)遞減趨勢(shì)（圖1），沒有明顯中斷現(xiàn)象，表明本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高。

圖1 Unigenes序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 Unigenes sequence length statistics

2.4.2 轉(zhuǎn)錄組注釋分析結(jié)果 通過與Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有28811條Unigenes與已知基因同源，占整個(gè)組裝轉(zhuǎn)錄本的36.34%，在Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋到的同源序列數(shù)目分別為28664（占36.15%）、19668（占24.80%）、16056（占20.24%）和14866（占18.74%）條。物種同源性分析結(jié)果（圖2）顯示，珍珠龍膽石斑魚Unigenes與Nr數(shù)據(jù)庫中的脊椎動(dòng)物基因高度同源，其中與大黃魚（Larimichthys crocea）的同源序列比例最高，達(dá)22.26%（6381個(gè)），其次是與盲曹魚（Lates calcarifer），其同源序列比例達(dá)22.10%（6335個(gè)）。

圖2 轉(zhuǎn)錄組序列同源物種分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Transcriptome sequence allied species distribution statistics

對(duì)79291條Unigenes進(jìn)行GO功能注釋分析，結(jié)果顯示共有35161條Unigenes在生物學(xué)過程（Biologi‐cal process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）三大類別的53個(gè)功能分支中得到注釋（圖3）。在生物學(xué)過程方面，Unigenes主要注釋到細(xì)胞過程（Cellular process）、單一生物過程（Single-organism process）、代謝過程（Metabolic pro‐cess）和生物調(diào)控（Biological regulation）等功能條目上；在細(xì)胞組分方面，以注釋到細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞部分（Cell part）、生物膜（Membrane）、生物膜部分（Membrane part）和細(xì)胞器（Organelle）等功能條目的Unigenes較多；在分子功能方面，Unigenes主要注釋到結(jié)合（Binding）和催化活性（Catalytic activity）2個(gè)功能條目上。

圖3 Unigenes的GO功能注釋分析結(jié)果Fig.3 GO functional annotation analysis result of unigenes

對(duì)79291條Unigenes進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果如圖4所示，共有16849條Unigenes富集為細(xì)胞過程（Cellular processes）、有機(jī)系統(tǒng)（Organis‐mal systems）、代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）和環(huán)境信息（Envi‐ronmental information processing）五大分類，富集到的Unigenes數(shù)目分別為2875（占17.06%）、2129（占12.64%）、6865（占40.74%）、2089（占12.40%）和2891（占17.16%）條，共涉及228條KEGG信號(hào)通路，其中免疫相關(guān)通路有16條。

圖4 Unigenes的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果Fig.4 KEGG signaling pathway enrichment analysis result of unigenes

2.4.3 差異表達(dá)基因篩選及富集分析結(jié)果 依據(jù)FDR≤0.05且|log2FC（Sample2/Sample1）|≥1的篩選條件，共篩選獲得8014個(gè)差異表達(dá)基因（圖5），包括4990個(gè)上調(diào)基因和3024個(gè)下調(diào)基因。GO功能注釋分析結(jié)果（圖6）表明，分別有470、262和436個(gè)差異表達(dá)基因注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別中。在生物學(xué)過程類別中，以生物調(diào)控所占比例最高，其次是細(xì)胞過程、代謝過程和單一生物過程；在細(xì)胞組分類別中，以細(xì)胞類別所占比例最高，其次是細(xì)胞部分及細(xì)胞器；在分子功能類別中，主要是結(jié)合及分子傳感器活性功能。KEEG信號(hào)通路富集分析結(jié)果（圖7）顯示，共有648個(gè)差異表達(dá)基因富集到175個(gè)KEEG信號(hào)通路上。其中，富集基因數(shù)目最多且具有顯著差異的前10個(gè)信號(hào)通路分別是細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、吞噬體（Phagosome）、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、微生物在不同環(huán)境中的代謝（Microbial metabolism in diverse environ‐ments）、細(xì)胞黏附分子（Cell adhesion molecules）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、JAK-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）、神經(jīng)活性配體—受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、糖化/葡萄糖生成（Glycolysis/gluconeogenesis）及IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（Intestinal immune network for IgA production）。在富集到的KEGG信號(hào)通路中共有16條通路與免疫功能相關(guān)，涉及139個(gè)顯著差異基因。與對(duì)照組相比，β-葡聚糖組有108個(gè)顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因和31個(gè)顯著下調(diào)的差異表達(dá)基因富集到13條免疫調(diào)節(jié)通路上（表6）。

表6 飼料添加β-葡聚糖后珍珠龍膽石斑魚中與免疫通路相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 6 DEGs related to immune pathway in E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂after adding β-glucan to the feed

圖5 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.5 Volcano map of DEGs

圖6 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析結(jié)果Fig.6 GO functional annotation analysis of differentially expressed genes（DEGs）

圖7 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果Fig.7 KEGG signaling pathway enrichment analysis of DEGs

2.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 隨機(jī)挑選在對(duì)照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚間呈顯著差異表達(dá)的相關(guān)基因（Myoglobin、SPRR3、Septin5、MCAM、SDPR、Pol、KLF9、IRF4、DENND4A和FKBP5）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖8）顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)得到的基因相對(duì)表達(dá)量與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果基本一致。

圖8 珍珠龍膽石斑魚差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 Real-time fluorescent quantitative PCR verification analysis of DEGs in E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.5 飼料中添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的影響

2.5.1 腸道菌群多樣性分析結(jié)果 珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性分析結(jié)果（表7）表明，β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的OTUs數(shù)量、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，而Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)在兩處理組間無顯著差異。

表7 飼料添加β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性的影響Table 7 Effects of adding β-glucan to feed on intestinal bacte‐ria community diversity of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.5.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成 在門分類水平上，對(duì)照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群中共發(fā)現(xiàn)30個(gè)門類，包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）及厚壁菌門（Firmicutes）等。選取2個(gè)處理組相對(duì)豐度排名前5的物種生成相對(duì)豐度柱形堆疊圖，結(jié)果顯示其總相對(duì)豐度均超過97%（圖9），但不同門類細(xì)菌在兩處理組間的相對(duì)豐度存在明顯差異，β-葡聚糖組中變形菌門、藍(lán)藻門的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（圖10-A和圖10-C），而厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度極顯著高于對(duì)照組（圖10-B和圖10-D）。

圖9 在門分類水平上對(duì)照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異Fig.9 Intestinal bacteria community structural difference of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂in control and β-glu‐can groups at phylum level

圖10 β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度的影響Fig.10 Effects of β-glucan on phylum-level dominant bacteria relative abundance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

在屬分類水平上，對(duì)照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群中共發(fā)現(xiàn)295個(gè)種屬，包括發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphin‐gomonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）及無色桿菌屬（Achromobacter）等，選取2個(gè)處理組相對(duì)豐度排名前5的物種生成相對(duì)豐度柱形堆疊圖（圖11）。不同種屬細(xì)菌在兩處理組間的相對(duì)豐度也存在明顯差異，β-葡聚糖組中發(fā)光桿菌屬的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（圖12-A），鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度極顯著低于對(duì)照組（圖12-B），而其余3 個(gè)種屬的相對(duì)豐度在兩處理組間無顯著差異（圖12-C、圖12-D和圖12-E）。

圖11 在屬分類水平上對(duì)照組和β-葡聚糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異Fig.11 Intestinal bacteria community structural difference of E.fuscoguttatus ♀× E.lanceolatus♂in control and βglucan groups at genus level

圖12 β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度的影響Fig.12 Effects of β-glucan on genus-level dominant bacteria relative abundance of E.fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

3 討論

已有大量研究表明，在飼料中添加β-葡聚糖能有效提高魚類的生長(zhǎng)性能。Selvaraj等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加酵母β-葡聚糖能提高鯉魚的存活率、特異性和非特異性生長(zhǎng)性能；周艷萍等（2008）研究表明，β-葡聚糖能提高異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的存活率，但效果不顯著；吳春玉等（2013）對(duì)花鱸的研究表明，飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高其增重率和特定生長(zhǎng)率。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚的增重率和特定生長(zhǎng)率，表明β-葡聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑起到促生長(zhǎng)作用。肝體比和肥滿度是反映魚體形體的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，飼料中添加β-葡聚糖可降低珍珠龍膽石的肝體比，提高其肥滿度，但效果均不顯著，與β-1,3-葡聚糖對(duì)花鱸的研究結(jié)果（吳春玉等，2013）一致。此外，多種魚類攝食添加β-葡聚糖的飼料時(shí)其飼料系數(shù)顯著提高。許國(guó)煥等（2004）對(duì)羅非魚的研究發(fā)現(xiàn)，投喂β-葡聚糖飼料組的飼料系數(shù)顯著高于基礎(chǔ)飼料組，推測(cè)是由于胰蛋白酶分解產(chǎn)物中存在抑制生長(zhǎng)因子。周艷萍等（2008）研究表明，對(duì)異育銀鯽投喂210和420 mg/kg的β-葡聚糖時(shí)其飼料系數(shù)均顯著提高。本研究中，β-葡聚糖添加組珍珠龍膽石的飼料系數(shù)明顯高于對(duì)照組，可能與β-葡聚糖對(duì)魚的消化能力產(chǎn)生的影響有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

血清生化指標(biāo)可反映機(jī)體物質(zhì)代謝和某些組織器官的變化，常用于評(píng)價(jià)魚體健康及營(yíng)養(yǎng)狀況等。其中，血清總蛋白含量能反映魚體的營(yíng)養(yǎng)與代謝狀況，也間接反映機(jī)體的免疫水平（Bahmani et al.，2000）；血清總膽固醇和總甘油三酯的變化情況可反映機(jī)體脂質(zhì)代謝功能。吳春玉等（2013）在花鱸中的研究表明，飼料中添加適量β-葡聚糖在一定程度上能升高花鱸體內(nèi)血清總蛋白含量，降低總膽固醇和總甘油三酯水平，說明飼料中添加β-葡聚糖能促進(jìn)機(jī)體蛋白合成，進(jìn)而提高花鱸對(duì)蛋白的消化吸收，同時(shí)脂類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過代謝而促進(jìn)其生長(zhǎng)。本研究結(jié)果也表明，在珍珠龍膽石斑魚飼料中添加β-葡聚糖能顯著提高血清總蛋白含量，并顯著降低血清總膽固醇和總甘油三酯水平，說明β-葡聚糖在不同魚類中能發(fā)揮相似的功能。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是衡量動(dòng)物機(jī)體肝臟是否受損的標(biāo)志之一，其活性隨著肝臟受損傷的程度增加而升高，當(dāng)肝臟受到損傷或短期內(nèi)外界環(huán)境的刺激，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性就會(huì)升高（Giannini et al.，2003）。本研究結(jié)果表明，珍珠龍膽石斑魚血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均低于對(duì)照組，且β-葡聚糖添加組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與對(duì)照組間差異顯著，說明β-葡聚糖能有效保護(hù)珍珠龍膽石斑魚肝臟不受損。汪成竹和陳昌福（2008）、賀國(guó)龍等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，以β-葡聚糖為主要成分的酵母細(xì)胞壁免疫多糖可顯著降低草魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，改善草魚的肝功能。過氧化氫酶能將體內(nèi)形成的過氧化物氧化成無害物質(zhì)，對(duì)宿主起保護(hù)作用；溶菌酶則具有抗菌、消炎、抗病毒等作用；丙二醛是膜脂氧化的重要標(biāo)志物，能加劇膜氧化，具有細(xì)胞毒性（張晨光等，2021）。Engstad等（1992）研究發(fā)現(xiàn)給虹鱒中注射β-葡聚糖其血清過氧化氫酶活性顯著提

高；王永宏等（2013）研究表明腹腔注射β-葡聚糖可有效提高暗紋東方魚血清過氧化氫酶和溶菌酶活性；吳春玉等（2013）研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加適量β-葡聚糖能一定程度上降低花鱸血清丙二醛含量。在本研究中，β-葡聚糖能顯著提高珍珠龍膽石斑魚血清過氧化氫酶和溶菌酶活性，并顯著減低丙二醛含量，進(jìn)一步證實(shí)β-葡聚糖可提高魚類的抗氧化水平與抗菌能力，降低丙二醛造成的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而提升機(jī)體免疫力。

本研究的差異表達(dá)基因GO功能注釋分析結(jié)果表明，分別有470、262和436個(gè)差異表達(dá)基因注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別中；KEGG信號(hào)通路富集分析則發(fā)現(xiàn)有有648個(gè)差異表達(dá)基因被富集到175個(gè)KEEG信號(hào)通路上，其中有16條通路與免疫功能有關(guān)，以MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、Jak-STAT信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡等通路富集到的差異表達(dá)基因最多。Jak-STAT信號(hào)通路參與機(jī)體的多種調(diào)節(jié)反應(yīng)，其中，白細(xì)胞介素-6（IL-6）與白細(xì)胞介素-6受體α（IL-6Rα）結(jié)合，通過這種結(jié)合IL-6可誘導(dǎo)gp130同型二聚化（Heinrich et al.，1998），而gp130同型二聚化可觸發(fā)JaK-STAT級(jí)聯(lián)，異常的IL-6信號(hào)或?qū)е伦陨砻庖咝约把装Y等疾?。∟eurath and Finotto，2011；Sansone and Bromberg，

2012）。Toll樣受體（TLRs）可識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式，在先天性免疫應(yīng)答中扮演重要角色，是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線（Horng et al.，2001；Kagan and Medzhitov，2006）。Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域包含接頭蛋白（TIRAP），可介導(dǎo)相關(guān)Toll樣受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加β-葡聚糖能誘導(dǎo)珍珠龍膽石斑魚IL-6基因和TI‐RAP基因高表達(dá)，提示IL-6和TIRAP介導(dǎo)的JaKSTAT信號(hào)通路及Toll樣受體信號(hào)通路在先天免疫屏障中發(fā)揮作用，參與珍珠龍膽石斑魚抗病免疫反應(yīng)。

魚類消化道中的菌群主要是通過環(huán)境或食物進(jìn)入消化道定殖，進(jìn)而成為魚類消化道重要的組成成分，與魚類的健康及免疫密切相關(guān)。魚類一旦接觸到周圍的水生環(huán)境和活餌料，多種細(xì)菌即開始在腸道內(nèi)定殖，而最先定殖的細(xì)菌與宿主腸道環(huán)境相適應(yīng)，因此腸道是消化道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量最多的部位（宋增福和吳天星，2007）。多糖通常被認(rèn)為是一種腸道功能調(diào)節(jié)劑，能改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，并抑制有害菌繁殖。在本研究中，添加β-葡聚糖后珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的OTUs數(shù)量、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組，表明β-葡聚糖能顯著提高腸道菌群物種豐富度和多樣性。腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果顯示，珍珠龍膽石斑魚腸道菌群以變形菌門占主導(dǎo)地位，其次是厚壁菌門和擬桿菌門。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是動(dòng)物腸道當(dāng)中最常見的定殖菌，其中變形菌門豐度升高可能是導(dǎo)致腸道菌群不平衡的主要原因（Shin et al.，2015）。擬桿菌門和厚壁菌門所產(chǎn)生的多糖水解酶能有效降解膳食纖維，進(jìn)而產(chǎn)生單糖和短鏈脂肪酸，是腸道內(nèi)壁細(xì)胞基本代謝的能量來源之一（Mount‐fort et al.，2002）。楊俊花等（2017）研究表明，在小鼠腸道中，腸道炎癥可能會(huì)伴隨著變形菌門上升及擬桿菌門下降。在本研究中，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在β-葡聚糖添加組和對(duì)照組珍珠龍膽石斑魚腸道中均占優(yōu)勢(shì)，但β-葡聚糖添加組變形菌門的相對(duì)豐度較對(duì)照組呈顯著下降趨勢(shì)，表明添加β-葡聚糖可調(diào)節(jié)魚腸道有益菌的相對(duì)豐度，在屬分離水平上也得到證實(shí)。美人魚發(fā)光桿菌（P.damselae）又稱?；【?，隸屬于發(fā)光桿菌屬，是海洋魚類常見的一種致病菌，能致使魚類死亡（王洪彬等，2018）。因此，發(fā)光桿菌屬相對(duì)豐度的下降能有效抑制美人魚發(fā)光桿菌的產(chǎn)生。何遠(yuǎn)法等（2017）以添加酵母培養(yǎng)物（葡聚糖≥50%，甘露寡糖≥1%）的飼料喂養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦，其腸道中發(fā)光桿菌屬豐度下降；Jung-Schroers等（2015）研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加β-葡聚糖對(duì)鯉魚腸道菌群也有一定的影響，尤其是顯著降低腸道中的弧菌數(shù)目，增加菌群多樣性。在本研究中，β-葡聚糖添加組珍珠龍膽石斑魚腸道中的發(fā)光桿菌屬相對(duì)豐度明顯下降，也表明β-葡聚糖可調(diào)節(jié)魚類腸道菌群多樣性，優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)組成。

4 結(jié)論

β-葡聚糖能有效增強(qiáng)珍珠龍膽石斑魚的抗氧化能力及提高其腸道菌群物種豐度和多樣性以抵御外界有害菌的繁殖，同時(shí)提升珍珠龍膽石斑魚的抗炎癥和抗病等免疫能力。即β-葡聚糖在珍珠龍膽石斑魚上具有良好的生長(zhǎng)和免疫增強(qiáng)效果，可作為新型免疫增強(qiáng)劑推廣應(yīng)用。