吳昊天，李亞琳，王 軍，陳曉雯，陸 穎*，王成輝*

（1水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室（上海海洋大學），上海 201306；2農業(yè)農村部淡水水產種質資源重點實驗室（上海海洋大學），上海 201306）

0 引言

【研究意義】棕鱒（Salmo trutta）屬于鮭形目（Salmoniformes）鮭科（Salmonidae）鮭亞科（Salmononae），原產于歐洲、非洲北部和中亞一些地區(qū)（胡江偉和阿地力，2018）。棕鱒是適應高海拔的冷水魚類，其肉質鮮美，具有重要的經濟價值。新疆烏魯木齊達阪城東溝冷水魚實驗場和西藏亞東縣亞東鮭魚繁育基地是我國目前僅有的2個棕鱒人工養(yǎng)殖基地（分別簡稱為“新疆棕鱒”和“西藏棕鱒”），棕鱒人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展對當?shù)鼐用駥崿F(xiàn)脫貧致富具有重要作用。然而，新疆棕鱒與西藏棕鱒的養(yǎng)殖方式不同，氣候環(huán)境也存在較大差異，因此，對兩地棕鱒進行群體遺傳學研究，有助于從基因組水平深入了解這些群體的遺傳結構，進而指導物種保護和育種研究?！厩叭搜芯窟M展】新疆棕鱒和西藏棕鱒的來源可追溯到19世紀末20世紀初。1866年，英國人將棕鱒引入青藏高原的亞東河流域養(yǎng)殖，在我國被稱為亞東鮭魚（胡江偉和阿地力，2018；高擘為等，2020）。與青藏高原的其他魚類相比（陳毅峰，2002），亞東鮭魚的生長速度和性成熟更快，使得亞東鮭魚在當?shù)匮杆俳⒘朔N群（豪富華等，2007）。1900年左右，來自英國的棕鱒被引入克什米爾（Sahoo et al.，2016），隨后從克什米爾傳播到巴基斯坦。自2011年起，新疆地區(qū)開始從巴基斯坦引入棕鱒養(yǎng)殖，后逐步推廣到新疆多地（胡江偉和阿地力，2018）。棕鱒在國內的發(fā)源歷史及其養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀目前還極少有人關注。豪富華（2006）、豪富華等（2006）曾對亞東鮭魚及引種自丹麥的棕鱒進行生物學和遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞東鮭魚相較于引種自丹麥的棕鱒有著包括生長速度、胚胎發(fā)育和繁殖特點上的差異，但其對線粒體基因組分子標記的研究中發(fā)現(xiàn)亞東鮭魚與丹麥棕鱒的序列無任何差異，但通過11個多態(tài)性微衛(wèi)星標記的研究卻發(fā)現(xiàn)亞東鮭魚的遺傳多樣性高于丹麥棕鱒。孟瑋等（2017）基于ITS1基因序列對西藏棕鱒和引自巴基斯坦的新疆棕鱒進行群體遺傳分析，認為新疆棕鱒的遺傳多樣性高于西藏棕鱒。目前，國際上主要使用微衛(wèi)星分子標記（Eszterbauer et al.，2015；Prod?hl et al.，2019）和利用限制性酶切位點相關DNA測序（Restriction-site associated DNA，RAD-seq）得到的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記（Leit‐wein et al.，2016）來研究棕鱒群體的遺傳多樣性。Lemopoulos等（2019）比較使用RADseq得到的SNP標記與使用微衛(wèi)星標記估計棕鱒遺傳多樣性和雜合水平的效果，發(fā)現(xiàn)使用SNP標記在對多位點的估計上更具優(yōu)勢。盡管棕鱒染色體水平的基因組序列已發(fā)表（Hansen et al.，2021），但通過基因組重測序對棕鱒群體進行遺傳多樣性研究的報道還較少。截至2022年1月，僅Saha等（2022）參考棕鱒染色體水平基因組，基于重測序數(shù)據，在瑞典Bunnersj?arna湖區(qū)的2個共存棕鱒群體中找到2個群體間存在生殖隔離的證據?！颈狙芯壳腥朦c】棕鱒具有40條染色體，曾發(fā)生過染色體加倍，高度的遺傳變異性以致使用少數(shù)的基因或分子標記難以正確反映棕鱒遺傳多樣性的實際水平。2019年，英國Sanger研究所完成了25個物種的基因組計劃，其中包括棕鱒的高質量基因組序列（Hansen et al.，2021），這使得在基因組水平解析棕鱒的遺傳多態(tài)性成為可能?！緮M解決的關鍵問題】采用第二代高通量測序技術對來自新疆達坂城和西藏亞東的2個棕鱒群體進行基因組重測序，從基因組水平研究2個棕鱒群體的遺傳多樣性和群體結構，并通過群體間選擇消除分析探究2個群體基因組中選擇信號的差異，為棕鱒的分子輔助育種打下數(shù)據和方法基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和基因組DNA提取

于西藏亞東縣亞東鮭魚繁育基地和新疆烏魯木齊市達坂城東溝冷水魚實驗場的2個棕鱒養(yǎng)殖群體中各采集12條棕鱒，共24個樣本。剪取樣本尾鰭1 cm，液氮速凍后提取基因組DNA，構建雙端測序文庫，使用Illumina Hiseq-x-ten測序平臺進行全基因組隨機測序，平均測序深度10X。

1.2 基因組重測序和SNP鑒定

依據已公布的棕鱒基因組序列作為參考序列（Hansen et al.，2021），使用Burrows-Wheeler Aligner將測序讀段比對至參考基因組上（Li and Durbin，2009）。使用Genome Analysis Toolkit（McKenna etal.，2010）和SAMtools軟件（Li et al.，2009）進行SNP鑒定，在默認參數(shù)下鑒定出SNP。使用VCFtools（Danecek et al.，2011），在-max-missing=0.2和mac=2的條件下進行過濾。

1.3 群體遺傳多態(tài)性分析

計算4種與遺傳多態(tài)性相關的統(tǒng)計量，包括核苷酸多態(tài)性（Pi）（Ness et al.，2010）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）（Chesnokov and Artemyeva，2015），計算Pi、Ho、He和PIC在基因組上的平均值，以衡量新疆棕鱒與西藏棕鱒的遺傳多態(tài)性差異。

1.4 群體結構和親緣關系分析

使用Plink將vcf文件轉換為等位基因信息文件，并進行主成分分析（Principal components analysis，PCA）。使用IQ-Tree繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Nguyen et al.，2015）。計算過程中選擇使用經驗堿基替換率的TVM模型（Transversion model），Bootstrap次數(shù)為1000。使用Admixture對2個棕鱒的群體結構進行分析（Alexander et al.，2009），并通過計算CV error進行驗證。

1.5 選擇印跡分析

使用PopLDdecay分析2個棕鱒群體的連鎖不平衡衰減（Linkage disequilibrium decay）速度（Zhang et al.，2019），以確定群體中可能存在的選擇信號。使用Vcftools在長度為50 kb、步長為10 kb的基因組長度滑窗中計算群體分化指數(shù)（FST）和Pi值，并進行基于FST和Pi的選擇消除分析，篩選同時滿足Pi值相差最大和FST值最大（top1%）的區(qū)域作為具體明顯選擇印跡的染色體候選區(qū)域，位于這些區(qū)域的基因則為可能受到選擇的候選基因。

1.6 候選基因篩選

將在選擇印跡分析中得到的染色體區(qū)段進行SNPeff注釋（Cingolani et al.，2012），將其中發(fā)生錯義突變、選擇性剪接突變和基因調控原件突變的基因序列在KEGG代謝途徑數(shù)據庫中運行Blast‐KOALA進行通路分析，注釋基因功能及參與的代謝途徑。

2 結果與分析

2.1 群體遺傳多樣性分析結果

本研究中所涉及的測序數(shù)據共得到4694474928條Illumina序列（reads），與參考基因組的mapping率超過97%。經SNP Calling，共鑒定出8559684個SNP位點（表1）。在鑒定出的SNP中，堿基轉換率略高于堿基顛換率，說明在棕鱒基因組中同樣存在堿基轉換偏差（趙輝等，2006）。

表1 樣本及測序信息Table 1 Information of the samples and sequencing

對4種表征遺傳多態(tài)性的統(tǒng)計量Pi、He、Ho、PIC進行計算和分析，發(fā)現(xiàn)2個群體的群體遺傳多樣性非常相近（表2），其中，西藏群體的Pi值約為0.348，僅略高于新疆的0.336；其他3個統(tǒng)計量也有類似結果。此外，無論是新疆群體還是西藏群體，群體內部的He和Ho值均較相近，符合哈迪—溫伯格平衡，說明2 個群體內部的交配方式可能以隨機交配為主（Chesnokov and Artemyeva，2015）。對比全基因組中2個群體所鑒定到的SNP密度，發(fā)現(xiàn)2個群體的SNP密度分布高度相似（圖1），但在1號染色體的11~39 Mb處、4號染色體的2和18 Mb處、13號染色體的60 Mb處、18號染色體的10、27和29.7 Mb等處、20號染色體的6 Mb處、21號染色體的16~42.5 Mb處、25號染色體的25.1 Mb處、28號染色體的8、14和17 Mb處，以及31號染色體的7 Mb處的SNP密度差異明顯。

圖1 新疆群體（上）和西藏群體（下）的SNP密度圖Fig.1 SNP density diagram of Xinjiang（upper）and Tibetan（lower）populations

表2 群體遺傳多樣性比較Table 2 Genetic diversity comparison between the two popu‐lations

2.2 群體結構分析結果

在構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，有新疆棕鱒個體與西藏棕鱒聚為一簇，說明這2個群體的親緣關系較近（圖2）。但在用列前3位的主成分數(shù)據繪制的三維PCA分析圖中，發(fā)現(xiàn)主成分分析可將2個群體較好地分開，說明新疆棕鱒群體與西藏棕鱒群體在整體上存在一定的遺傳距離（圖3）。此外，在2個群體內部，各個體間的點分布不緊密，說明群體的遺傳單一性不高，個體間存在一定的遺傳差異。

圖2 新疆和西藏棕鱒個體系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Xinjiang and Tibetan brown trout individuals

使用Admixture進行群體結構分析，當預測出的祖先群體數(shù)為2時（K=2）已不能將這2個群體完全分開（圖4）。類似的，在CV error驗證中，K=1時的CV error最低，說明新疆群體和西藏群體可能來自同一種源（圖5）。2種分析方法均驗證2個群體具有共同的祖先，結合其他學者對亞東鮭魚種質來源的研究，基本上可確定新疆群體和西藏群體均來自于大西洋棕鱒居群（戶國等，2016）。

圖5 新疆和西藏棕鱒群體CV error驗證Fig.5 CV error verification in Xinjiang and Tibetan brown trout populations

考慮到群體內連鎖不平衡（LD）的發(fā)生，存在自然選擇、遺傳漂變、個體的遷入或遷出、近親繁殖等因素影響，比較2個群體的連鎖不平衡衰減速度（LDdecay）時，以LD降低到最大值一半時的平均LD長度來衡量連鎖不平衡衰減速度，結果（圖6）發(fā)現(xiàn)，2個群體連鎖不平衡衰減速度幾乎相等，新疆群體略高。在2個棕鱒群體中未觀察到Liu等（2019）在7個黃瓜群體間發(fā)現(xiàn)的LD衰減曲線形狀和數(shù)值顯著差異，說明新疆群體和西藏群體經歷的上述群體事件可能相似。

圖6 新疆棕鱒和西藏棕鱒的連鎖不平衡衰減Fig.6 Linkage disequilibrium decay of Xinjiang and Tibetan brown trout populations

2.3 群體選擇消除分析結果

為尋找受到較強選擇的染色體區(qū)域，通過鑒定得到的每個個體SNP位點，在2個群體間進行群體選擇消除分析。結果（圖7）顯示，在群體Pi比值［log2（Pi疆/Pi藏）］最低的1%區(qū)域與FST最大的1%區(qū)域交集（圖7左上角）所對應的染色體區(qū)域中，新疆群體的Pi低于西藏群體，且群體分化指數(shù)較高。推測在新疆群體的第5和第19號染色體上有大片段區(qū)域可能受到強烈的選擇；與之相似，Pi比值最高的1%區(qū)域與FST最大的1%區(qū)域的交集（圖7右上角）所對應的染色體區(qū)域中，西藏群體的Pi低于新疆群體，且群體分化指數(shù)較高，推測在西藏群體的第17和第18號染色體上有大片段區(qū)域可能受到強烈的選擇。根據棕鱒的基因組注釋信息（Hansen et al.，2021），在這些染色體區(qū)域上，共分布有94個編碼蛋白基因，其中33來自新疆群體，61個來自西藏群體。

圖7 新疆棕鱒和西藏棕鱒群體間基于FST和Pi的選擇消除分析Fig.7 FST-and Pi-based selective sweep analysis between Xinjiang and Tibetan brown trout populations

使用KEGG代謝通路數(shù)據庫對受到選擇的基因可能參與的代謝途徑進行分析，結果（表3）顯示，這些基因分別參與多個不同的信號通路，且這些信號通路主要與信號分子傳導、免疫和疾病等生理過程相關。群體選擇消除分析中鑒定出位于受到強烈選擇區(qū)域的94個基因中有21個基因與免疫或疾病相關，其中4個來自于新疆群體，17個來自于西藏群體（圖8）。西藏群體中受到選擇的基因所參與的通路主要包括PI3K-Akt信號傳導途徑、中性粒細胞胞外捕集器的形成、JAK-STAT信號傳導途徑、Hippo信號傳導途徑、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性、cAMP信號傳導途徑、細胞因子—細胞因子受體相互作用、FoxO信號傳導途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、神經活性配體—受體相互作用、mTOR信號傳導途徑、軸突引導、ECM-受體相互作用、細胞粘附分子和NOD樣受體信號傳導途徑，主要位于第1、4、14、17、18、19、21、23、26、30和31號染色體上；而新疆群體的這些基因參與的代謝途徑主要集中于MAPK信號傳導途徑、Ras信號傳導途徑、鈣信號傳導途徑、TNF信號傳導途徑、PI3K-Akt信號傳導途徑和Hippo信號傳導途徑，主要位于第5、29和39號染色體上。

表3 在不同KEGG通路上受到選擇的基因數(shù)量Table 3 Number of the involved genes under selection in different KEGG pathways

圖8 新疆和西藏群體FST曼哈頓圖Fig.8 Manhattan graph of FST between Xinjiang and Tibetan populations

3 討論

基因組重測序在許多物種中能獲取百萬以上的SNP分子標記，是魚類功能基因關聯(lián)定位及群體遺傳研究的有力工具。以大西洋鮭魚性成熟年齡相關基因的研究為例，前人基于6.5K SNP陣列數(shù)據進行過全基因組關聯(lián)分析，雖然得到了與性狀關聯(lián)的基因座，但未能獲得具體的基因或基因位置（Gutier‐rez et al.，2015）；Ayllon等（2015）基于野生和馴化的大西洋鮭魚群體的基因組重測序數(shù)據，獲得4326591個SNP標記，遠高于Gutierrez 等（2015）采用SNP陣列獲得的標記數(shù)量，同樣通過全基因組關聯(lián)分析，鑒定出vgll3基因是與大西洋鮭魚性成熟年齡相關的基因。在基因組龐大，特別是經歷過額外的全基因組加倍事件的鮭科和鱘科魚類中（Berthelot et al.，2014；Lien et al.，2016；Du et al.，2020），以基因組測序數(shù)據鑒定SNP分子標記進行分析較其他分子標記更準確（豪富華，2006）。新疆達坂城和西藏亞東縣的養(yǎng)殖棕鱒群體在SNP密度分布、連鎖不平衡衰減速度和核苷酸多態(tài)性等方面存在高度的相似性，暗示這2個群體可能引自同一種源。盡管新疆棕鱒引入我國僅比西藏棕鱒晚150多年，但強烈的自然或人工選擇壓力能對棕鱒的進化產生影響，導致生物學特性在短期內即發(fā)生改變（Pigeon et al.，2016），對虹鱒魚的多性狀人工選育可達每代7%的遺傳增益（Kause et al.，2005）。因此，在西藏和新疆的棕鱒養(yǎng)殖群體中可能存在適應性進化差異。與引自巴基斯坦的養(yǎng)殖棕鱒不同，西藏棕鱒有著更為悠久的野生歷史，從1866年棕鱒被引入到1998年棕鱒的人工養(yǎng)殖研究取得成功，西藏棕鱒維持了130多年的野生狀態(tài)。棕鱒相比西藏高原水體中的土著魚類，其性成熟較早且生長速度快，與亞東河當?shù)佤~類相比具有明顯優(yōu)勢（豪富華，2006），使得棕鱒養(yǎng)殖在西藏獲得成功，也可能是導致西藏棕鱒遺傳多樣性更高的原因。

選擇消除是指在強烈選擇壓力的作用下，有利變異的等位基因頻率會在較短時間內快速增加，其增加速度遠高于正常水平，以至于有利變異鄰近的稀有變異與之連鎖地被保留下來，并導致有利變異鄰近區(qū)域核苷酸多態(tài)性的減少。這是一種特殊的遺傳搭車現(xiàn)象（Stephan，2019）。對來自不同群體的基因組重測序數(shù)據進行選擇消除分析，能發(fā)現(xiàn)不同群體中受到強烈選擇的候選基因。該方法已應用于羅非魚和大西洋鮭魚的馴化相關候選基因篩選（Na‐val-Sanchez et al.，2020；Nayfa et al.，2020），并在3個不同羅非魚養(yǎng)殖群體間定位到多個與生長、早期發(fā)育和免疫特性相關的基因（Cádiz et al.，2020）。本研究中，選擇消除分析得到的候選基因主要與免疫相關，或許由于新疆棕鱒和西藏棕鱒在引種前已適應高海拔水體，均經歷過人為馴化，導致2個群體的適應差異主要集中在不同水體的病原體抗性上。

西藏棕鱒相比新疆棕鱒有著更高的群體遺傳多樣性，但西藏棕鱒受到選擇的功能基因更多，功能分布更廣，暗示著兩地棕鱒經受的選擇壓力存在差異。單一的選擇壓力會導致群體的遺傳多態(tài)性降低，并產生集中在少數(shù)染色體上的選擇印跡，與新疆棕鱒群體中發(fā)現(xiàn)的選擇印跡分布相似；而在西藏棕鱒中，發(fā)現(xiàn)的選擇印跡分散在多條染色體的多個區(qū)段上，說明更可能是多種選擇因素共同導致的結果。與引入我國前后均養(yǎng)殖在中低海拔地區(qū)（2300 m以下）的新疆棕鱒不同，生活在海拔2700~3700 m亞東河流域的西藏棕鱒在人工養(yǎng)殖成功前長期處于野生狀態(tài)，且在1992年被列為西藏二級重點水生野生保護動物前經歷了嚴重的過度捕撈，這些因素可能共同影響了西藏棕鱒中選擇印跡的分布。

4 結論

新疆棕鱒和西藏棕鱒相近的親緣關系和較小的遺傳差異揭示兩個棕鱒群體可能來自同一種源，2個群體受到選擇壓力較大的基因集中在免疫相關通路中，未發(fā)現(xiàn)存在明顯選擇信號的生長相關基因，說明新疆棕鱒和西藏棕鱒在引種后的人工選育程度不足，受到的選擇壓力仍以自然選擇為主。