方增焜 黃 永 李昌柳 黃東挺 江文宇 董 奎

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，南寧市 530000； 廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院2 物理治療科，3 科教部，4 神經(jīng)康復(fù)科，南寧市 530000)

缺血性腦卒中是導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要原因，老年人受到的影響尤為嚴(yán)重[1]。缺血性腦卒中是由于腦血管系統(tǒng)閉塞，導(dǎo)致流向大腦某一區(qū)域的血液減少或停止，從而引起腦組織缺氧和壞死。腦組織缺血再灌注后，線粒體產(chǎn)生過量的活性氧，進(jìn)一步損害腦細(xì)胞；同時，膠質(zhì)細(xì)胞被激活后釋放炎癥細(xì)胞因子，并在梗死核心周圍形成瘢痕。梗死核心周圍是被稱為“半暗帶”的危險組織區(qū)域，是缺血性腦卒中研究的主要目標(biāo)[2]。

經(jīng)顱磁刺激是利用脈沖磁場作用于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦的特定區(qū)域內(nèi)誘導(dǎo)電流，通過改變刺激頻率可達(dá)到興奮或抑制局部大腦皮質(zhì)的作用。這種感應(yīng)電流可以抑制較低頻率的神經(jīng)活動，同時可以刺激較高頻率的神經(jīng)活動[3]。近年來，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)在成癮性疾病、抑郁癥、帕金森病、精神分裂癥和腦卒中等疾病中的治療潛力逐漸受到重視[4]。研究表明，腦卒中患者經(jīng)rTMS治療后運(yùn)動功能得到顯著改善[5]，這為腦卒中患者的康復(fù)帶來了希望。然而，rTMS治療的細(xì)胞和分子學(xué)作用機(jī)制仍不清楚。本研究建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，探討rTMS對缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 18只雄性健康SD大鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0001)，體重220～250 g，7～8周齡,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,室溫(25±2) ℃,濕度40%～60%,自由飲水進(jìn)食。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+rTMS組，每組6只。

1.2 試劑和儀器 主要試劑：原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche Applied Science公司，批號：11684817910)，二喹啉甲酸試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：2500T)，GAPDH抗體(Santa Cruz公司，批號：sc-25778)，Caspase-9抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號 ：A00080-7)，細(xì)胞色素C(cytochrome C,CytC)抗體(Thermo Fisher Scientific公司，批號：45-6100)，B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protein,Bax)抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：A00183)，小鼠抗免IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號 ：BM2020)。主要儀器：磁場刺激儀(依瑞德集團(tuán)，YRDCCY-Ⅰ型)，透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司，型號：H-9500)，電泳儀(Bio-Rad公司，型號：1645050)。

1.3 大鼠MCAO模型的建立 通過腹腔注射氯胺酮(40 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)進(jìn)行麻醉，觀察無夾爪反射即可進(jìn)行后續(xù)手術(shù)操作，術(shù)中維持麻醉時上述藥物濃度減半，圍術(shù)期監(jiān)測大鼠的體溫、呼吸頻率。常規(guī)備皮、消毒后，行頸中線垂直切口，顯露右側(cè)頸總動脈，分離頸內(nèi)動脈，使用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈。然后分離頸外動脈，雙線結(jié)扎頸外動脈并剪斷(留3～4 mm)，在距頸總動脈分叉約5 mm處，剪一斜行45°小口剪口，插入單絲尼龍縫合線栓，松開頸總動脈動脈夾，至頸總動脈分叉口后將頸外動脈和線栓逆時針旋轉(zhuǎn)，使線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈，松開頸內(nèi)動脈動脈夾，繼續(xù)進(jìn)線至大腦中動脈，當(dāng)感覺到阻力時停止插入，插入深度約為19 mm。閉塞2 h后拔出線栓再灌注，最后結(jié)扎切口，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠除不插線栓外，其他操作均一致。在整個手術(shù)、閉塞和再灌注過程中，用直腸體溫計監(jiān)測大鼠體溫，并通過平板熱墊維持在大鼠體溫在36.0 ℃～38.0 ℃之間。待大鼠麻醉蘇醒后，將其送回籠中，自由獲得食物、水。

1.4 干預(yù)方法 (1)缺血再灌注+rTMS組：使用帶有70 mm 8字形線圈的磁場刺激儀，對大鼠進(jìn)行rTMS。線圈位于大鼠眼睛和耳朵之間的背中央，線圈手柄垂直于大鼠的身體軸,在手術(shù)結(jié)束后2 h即進(jìn)行第1次治療,刺激頻率為0.5 Hz,強(qiáng)度為70%最大輸出強(qiáng)度,連續(xù)刺激20次為1組,2組/d，于大鼠處死前1日結(jié)束治療。(2)假手術(shù)和缺血再灌注組：將線圈放置在靠近大鼠頭部且背對大鼠頭部的位置，以確保聽覺條件相似，但不進(jìn)行電磁刺激,余處理同缺血再灌注+rTMS治療組。

1.5 運(yùn)動功能評估 分別于術(shù)后第1、3、7天，采用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[6]評估各組大鼠的運(yùn)動功能。mNSS包括運(yùn)動試驗(yàn)、感覺試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)、反射缺失和異常運(yùn)動?？偡?8分，評分越高，神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。

1.6 腦組織病理學(xué)改變 在術(shù)后第7天，各組隨機(jī)取3只大鼠，斷頸法處死后立刻取出腦組織，利用冷凍切片機(jī)制作8 μm厚的冠狀切片。切片經(jīng)蘇木精染色5 min后,1%鹽酸乙醇分化5 s，將切片置于氨水中10 s，伊紅染色3 min，脫水，用乙醇和二甲苯清除，最后用中性香脂密封。顯微鏡下觀察大鼠缺血腦組織的病理學(xué)改變。

1.7 透射電鏡觀察缺血周圍皮層組織中的線粒體結(jié)構(gòu) 在術(shù)后第7天，斷頸法處死各組剩余3只大鼠，取出大腦，解剖右側(cè)部分大腦缺血周圍皮層組織(假手術(shù)組取相應(yīng)區(qū)域的腦組織)，用1%四氧化鋨和1%亞鐵氰化物固定90 min，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，采用乙醇和丙酮分級脫水，然后用樹脂包埋。制備超薄切片，醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。在透射電子顯微鏡下觀察皮層組織的線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.8 檢測細(xì)胞凋亡 取1.7中右側(cè)剩余缺血周圍皮層組織制作冷凍切片，使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色，以評估神經(jīng)元凋亡情況。先用10%福爾馬林固定冷凍切片24 h，然后用TBS沖洗3次，每次5 min；用2% H2O2孵育切片10 min，用TBS洗滌3次，每次5 min，與TUNEL反應(yīng)混合物酶反應(yīng)，然后將切片放于37 ℃的濕盒子孵育1 h，用TBS沖洗3次，每次5 min。最后，將新鮮制備的3,3-二氨基聯(lián)苯胺溶液直接加入組織切片中，使用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。最后，用DM2500型熒光顯微鏡(Leica公司)觀察細(xì)胞凋亡情況。腦組織細(xì)胞凋亡率(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取1.7中缺血腦組織進(jìn)行勻漿并溶解在含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟、2%蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的冰冷RIPA裂解緩沖液中。采用二喹啉甲酸法測量蛋白濃度。通過10%～15%的SDS-PAGE分離等量(20～40 μg)的蛋白后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再用含脫脂牛奶的TBS封閉PVDF膜(pH值7.4)1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜，抗體稀釋比例如下：GAPDH為1 ∶2 000，Caspase-9、Bax為1 ∶500，CytC為1 ∶1 000。用TBST沖洗PVDF膜3次(5 min/次)后，用相應(yīng)的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育90 min。最后用TBST洗膜3次(5 min/次)后，利用ECL發(fā)光液(普利萊公司，批號：P1020)，進(jìn)行X膠片曝光，最后用ImageJ軟件檢測相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組間的比較采用方差分析(兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn))，重復(fù)測量資料的比較采用重復(fù)測量方差分析；非正態(tài)分布的計量資料以M(Q)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠的運(yùn)動功能變化 3組間的mNSS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=539.843，P組間<0.001)，術(shù)后各時間點(diǎn)其余兩組的mNSS均高于假手術(shù)組，而第7天缺血再灌注+rTMS組mNSS低于缺血再灌注組(P<0.05)；3組的mNSS均有隨時間下降的趨勢(F時間=230.515，P時間<0.001)；分組與時間有交互效應(yīng)(F交互=8.118，P交互<0.001)。見表1。

表1 3組大鼠mNSS的比較(x±s，分)

2.2 3組大鼠腦組織的病理學(xué)改變 缺血再灌注組大鼠出現(xiàn)較大的腦缺血梗死面積，而缺血再灌注+rTMS組大鼠的梗死區(qū)域較缺血再灌注組明顯縮小，見圖1A。此外，HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)正常，缺血再灌注組大鼠腦組織出現(xiàn)組織疏松、細(xì)胞稀疏、腫脹等異常表現(xiàn)，而缺血再灌注+rTMS組大鼠腦組織上述異常表現(xiàn)減輕，見圖1B。

圖1 3組大鼠腦組織大體和鏡下病理表現(xiàn)(HE染色，×40)

2.3 3組大鼠腦缺血周圍皮層組織中的線粒體結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)含高致密基質(zhì)的線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)完整而且外膜光滑無腫脹；缺血再灌注組大鼠的大部分大腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹伴低致密基質(zhì)，結(jié)構(gòu)破壞明顯，數(shù)目顯著減少,棘突排列紊亂,線粒體膜破損嚴(yán)重，呈現(xiàn)線粒體空泡化的趨勢；而缺血再灌注+rTMS組大鼠的線粒體異常形態(tài)表現(xiàn)較缺血再灌注組減輕。見圖2。

圖2 3組大鼠缺血周圍皮層組織中的線粒體結(jié)構(gòu)

2.4 3組大鼠腦缺血周圍皮層組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組僅可見個別凋亡神經(jīng)細(xì)胞，缺血再灌注組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，而缺血再灌注+rTMS組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況較缺血再灌注組減輕，見圖3。假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+rTMS組的腦組織細(xì)胞凋亡率分別為0.65(1.33)%，75.45(17.03)%，51.40(18.43)%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=14.360，P=0.001)，其中缺血再灌注組的細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組,而缺血再灌注+rTMS組的細(xì)胞凋亡率低于缺血再灌注組(均P<0.05)。

圖3 3組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

2.5 3組大鼠缺血腦組織中線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況 缺血再灌注組大鼠缺血腦組織的Caspase-9、CytC、Bax的蛋白表達(dá)量均高于假手術(shù)組(均P<0.05)；缺血再灌注+rTMS組大鼠缺血腦組織的CytC、Bax的蛋白表達(dá)量均低于缺血再灌注組(均P<0.05)，但兩組間Caspase-9的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表2。

圖4 3組Caspase-9、CytC、Bax蛋白表達(dá)情況

表2 3組大鼠Caspase-9、CytC、Bax蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

缺血性腦卒中是導(dǎo)致我國中老年人身體殘疾的主要原因，腦卒中后偏癱降低了患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會造成了重大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前康復(fù)治療是治療腦卒中所致神經(jīng)功能障礙的主要方法[7]。本研究采用MCAO法建立缺血再灌注大鼠模型，術(shù)后缺血再灌注組大鼠的mNSS高于假手術(shù)組(P<0.05)，并出現(xiàn)較大的腦缺血梗死面積，這提示建模成功；而與缺血再灌注組相比，缺血再灌注+rTMS組大鼠術(shù)后第7天的mNSS降低(P<0.05)，腦缺血梗死面積減小，組織疏松、細(xì)胞稀疏、腫脹等異常表現(xiàn)減輕，這提示rTMS對腦缺血再灌注損傷具有治療作用，能夠減小腦組織的缺血面積，改善神經(jīng)功能缺損，這與既往針對慢性腦卒中患者的研究結(jié)果[5]相似。

發(fā)生缺血再灌注損傷時，線粒體是細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，線粒體功能障礙可通過各種分子機(jī)制加重缺血性神經(jīng)元損傷，因此靶向干預(yù)線粒體可能是治療缺血再灌注損傷的有效方案[8]。Andrabi等[9]給予缺血再灌注損傷大鼠普拉克索進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可通過抑制CytC從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，從而抑制線粒體膜通透性，從而促進(jìn)缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。已有研究報告，rTMS可通過增強(qiáng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/原肌球蛋白相關(guān)激酶B信號通路的表達(dá)，以及抗凋亡機(jī)制，促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)[10-11]。本研究從線粒體凋亡途徑探討rTMS治療腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制，結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠腦缺血周圍皮層組織中的細(xì)胞凋亡率升高，大部分線粒體腫脹伴低致密基質(zhì)，結(jié)構(gòu)破壞明顯，數(shù)目顯著減少,棘突排列紊亂,線粒體膜破損嚴(yán)重，呈現(xiàn)線粒體空泡化的趨勢，而缺血再灌注+rTMS組大鼠腦缺血周圍皮層組織中的細(xì)胞凋亡率降低，上述異常表現(xiàn)均明顯減輕。這提示rTMS可以逆轉(zhuǎn)缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦組織線粒體結(jié)構(gòu)破壞與凋亡，這為rTMS在缺血性腦卒中的應(yīng)用提供了理論支持。

腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血基本病理過程，其中Caspase-9、CytC、Bax是經(jīng)典的凋亡標(biāo)志分子。B細(xì)胞淋巴瘤(B-cell lymphoma,Bcl)-2蛋白家族成員可調(diào)控蛋白質(zhì)從線粒體內(nèi)外膜間隙釋放到胞質(zhì)。Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax通常定位于胞質(zhì)或松散地附著于線粒體，在缺血時發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致其移位、寡聚并插入線粒體外膜。這些Bcl-2相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bcl-2L1、Bax和Bcl-2拮抗/殺傷因子1)在缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡中調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性,并且刺激線粒體釋放CytC，CytC通過凋亡蛋白酶激活因子-1的多聚化與Caspase-9形成凋亡小體，導(dǎo)致下游胱天蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)[12-13]。本研究通過Western blot發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注可促進(jìn)凋亡蛋白Bax、CytC、Caspases-9的表達(dá)升高，而rTMS可降低CytC、Bax蛋白的表達(dá)(P<0.05)。這進(jìn)一步印證了rTMS可以通過抑制線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)對缺血再灌注損傷的干預(yù)作用。

總之，rTMS能夠改善缺血再灌注引起的大鼠神經(jīng)功能缺損，其可能通過抗線粒體凋亡而發(fā)揮作用，這為rTMS在腦卒中治療中的作用提供了理論依據(jù)。然而，本文只從線粒體凋亡途徑探索其內(nèi)在機(jī)制，而rTMS廣泛刺激顱腦，無特定靶向性[14]，因此rTMS的神經(jīng)保護(hù)作用可能是多機(jī)制共同作用的結(jié)果，后續(xù)研究可以探索更多的潛在治療機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，拓展rTMS在顱腦神經(jīng)損傷方面的應(yīng)用。