崔 楠 花仲首 朱小丹 樊 磊

(本溪市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧省本溪市 117000)

卵巢癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增卵巢癌病例31.4萬例，死亡20.7萬例，發(fā)病率和病死率均居女性惡性腫瘤第8位，5年存活率僅為25%～50%[1-2]。卵巢癌是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此了解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、改善患者預(yù)后、延長生存時間，已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展由多種因素、基因介導(dǎo)，miRNA是一類非編碼小RNA，可通過調(diào)控癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生，以及細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[3]。研究顯示，miR-431-5p作為抑癌基因，參與抑制結(jié)腸癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤的增殖、遷移、侵襲[4-5]。驅(qū)動蛋白家族成員11(kinesin family member 11，KIF11)為細(xì)胞分裂驅(qū)動蛋白家族一員，參與細(xì)胞增殖、胞質(zhì)分裂、染色體分離、紡錘體分裂等過程，其過表達(dá)可引起細(xì)胞分裂異常，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。目前尚未明確miR-431-5p、KIF11與卵巢癌的關(guān)系，故本研究探討卵巢癌組織中miR-431-5p、KIF11的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為卵巢癌的診斷和治療提供一種新的策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2016年3月我院收治的113例接受根治性或姑息性切除術(shù)治療的卵巢癌患者，年齡32～84(58.14±8.36)歲；病理類型為漿液性囊腺癌62例，黏液性囊腺癌36例，子宮內(nèi)膜樣癌15例；腫瘤直徑≥3 cm共52例，<3 cm共61例；低分化43例，中高分化70例；國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期[9]為Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期35例；26例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為卵巢癌；(2)初次確診，術(shù)前未接受過任何內(nèi)分泌治療或放化療；(3)臨床資料完整；(4)患者及家屬均對本研究知情同意；(5)可接受并完成隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位腫瘤者；(2)合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；(3)合并血液系統(tǒng)疾病者；(4)合并全身感染性疾病者；(5)妊娠期及哺乳期婦女。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 miR-431-5p和KIF11的檢測方法 取手術(shù)切除的部分癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm)，液氮預(yù)冷后剪碎并反復(fù)研磨，使用TRIzol總RNA提取試劑盒(無錫百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號：RP2401)提取卵巢癌組織和癌旁組織中的總RNA，分別采用紫外分光光度計、凝膠電泳檢測RNA濃度和純度、完整性。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海紅榮微再生物工程技術(shù)有限公司，貨號：RR036A)合成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。miR-431-5p正向引物序列為5′-TGTCTTGCAGGCCGTCATG-3′，反向引物序列為5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；KIF11正向引物序列為5′-CAGAUUGAUGUUUACCGAATT-3′，反向引物序列為5′-GAAACUUACUGAUAAUGGUTT-3′。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2 μL cDNA模板、8.5 μL RNase-free H2O。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。分別以U6(正向引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′)、GAPDH(正向引物序列為5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，反向引物序列：5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′)作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算組織中miR-431-5p、KIF11的相對表達(dá)水平。

1.3 隨訪 在患者出院后，采用門診或電話方式對其隨訪5年，隨訪截止日期為2021年3月，統(tǒng)計術(shù)后5年總生存率，生存時間定義為術(shù)后至癌性死亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)分析指標(biāo)間的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier曲線繪制生存率，組間生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型分析卵巢癌患者預(yù)后不良的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中miR-431-5p、KIF11 mRNA表達(dá)水平的比較 卵巢癌組織中miR-431-5p的表達(dá)水平低于癌旁組織，KIF11 mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織(均P<0.05)。見表1。

表1 卵巢癌組織和癌旁組織中miR-431-5p和KIF11 mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 卵巢癌組織中miR-431-5p與KIF11 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 卵巢癌組織中miR-431-5p表達(dá)水平與KIF11 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.453，P<0.001)。

2.3 卵巢癌組織中miR-431-5p、KIF11 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 與FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者相比，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者卵巢癌組織中的miR-431-5p表達(dá)水平更低，KIF11 mRNA表達(dá)水平更高(均P<0.05)；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者卵巢癌組織中的miR-431-5p表達(dá)水平更低，KIF11 mRNA表達(dá)水平更高(均P<0.05)；不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型、腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度的患者之間miR-431-5p和KIF11 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中miR-431-5p、KIF11 mRNA的表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系(x±s)

2.4 卵巢癌組織中miR-431-5p、KIF11 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 本組病例共隨訪3～60個月，中位隨訪時間為38個月，失訪9例，總生存率為53.98%，見圖1。Kaplan-Meier曲線分析顯示，miR-431-5p表達(dá)水平≥0.49的患者(n=58)術(shù)后5年總生存率為65.52%，高于miR-431-5p表達(dá)水平<0.49的患者(n=55)的41.82%(χ2=7.557，P=0.006)；KIF11 mRNA表達(dá)水平≥1.70的患者(n=59)術(shù)后5年總生存率為40.68%，低于KIF11 mRNA表達(dá)水平<1.70的患者(n=54)的68.52%(χ2=9.903，P=0.002)。見圖2。

圖1 卵巢癌患者生存曲線

圖2 不同miR-431-5p、KIF11 mRNA表達(dá)水平的卵巢癌患者的生存曲線

2.5 卵巢癌患者預(yù)后不良影響因素的Cox回歸分析 以年齡(≥50歲=1，<50歲=0)、絕經(jīng)情況(是=1，否=0)、病理類型(漿液性囊腺癌=1，黏液性囊腺癌=2，子宮內(nèi)膜樣癌=3)、腫瘤直徑(≥3 cm=1，<3 cm=0)、分化程度(低分化=1，中高分化=0)、FIGO分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、miR-431-5p表達(dá)水平(≥0.49=1，<0.49=0)、KIF11 mRNA表達(dá)水平(≥1.70=1，<1.70=0)為自變量，卵巢癌患者的預(yù)后(死亡=1，存活=0)為因變量，納入多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KIF11 mRNA表達(dá)水平≥1.70為卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，miR-431-5p表達(dá)水平≥0.49為獨(dú)立保護(hù)因素(均P<0.05)。見表3。

表3 卵巢癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討 論

卵巢癌是一種病死率極高的婦科腫瘤，目前的治療方法仍以手術(shù)切除為主，化放療為輔。但大多數(shù)患者通常忽略腹圍增加、盆腔或腹部疼痛、腹脹等細(xì)微癥狀和體征，70%的卵巢癌患者確診時腫瘤分期已達(dá)Ⅲ～Ⅳ期，伴盆腔播散或淋巴轉(zhuǎn)移，錯過最佳治療時機(jī)，存活率較低[10]。雖然近年來靶向治療和免疫治療的發(fā)展極大地延長了卵巢癌患者的生存期，但還是無法達(dá)到治愈的效果，且耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重[11]。因此還需要從分子層面進(jìn)一步深入研究其發(fā)生機(jī)制，識別更多的治療靶點(diǎn)。

編碼基因一直是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，人體中95%以上的編碼基因可被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，后者為無需編碼蛋白質(zhì)的RNA，在RNA水平就可發(fā)揮生物學(xué)作用。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平上靶向mRNA的3′非翻譯端，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和凋亡等過程[3]。研究表明，某些miRNA可同時調(diào)控多種促癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與卵巢癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移或耐藥，與卵巢癌患者預(yù)后密切相關(guān)[12-14]。miR-431-5p位于人類染色體14q32上，作為一種與血壓相關(guān)的miRNA，其已被證實(shí)為參與高血壓、血管損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15]。Sun等[16]的研究顯示，miR-431-5p能通過靶向Pannexin 3從而抑制骨肉瘤的發(fā)生。Kong等[17]研究報告，miR-431-5p可靶向調(diào)控UROC28基因來抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中miR-431-5p的表達(dá)水平低于癌旁組織，F(xiàn)IGO分期更高或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者卵巢癌組織中miR-431-5p的表達(dá)水平更低(均P<0.05)，說明miR-431-5p可能在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。Cox回歸分析顯示，miR-431-5p表達(dá)水平≥0.49的患者術(shù)后5年總生存率更高，為卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)，說明miR-431-5p低表達(dá)參與了卵巢癌患者預(yù)后不良的發(fā)生。Zhu等[18]將miR-431-5p轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞(卵巢上皮癌細(xì)胞系CAOV-3、OVCAR-3)后發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的增殖、遷移能力顯著降低，凋亡率顯著增加，這進(jìn)一步佐證了本研究的結(jié)果。

有絲分裂為真核生物進(jìn)行細(xì)胞分裂的主要方式，細(xì)胞分裂時會復(fù)制自身DNA以確保子代細(xì)胞DNA完整，若該過程中DNA損傷或復(fù)制不完整，則會引起癌癥等疾病的發(fā)生[19]。驅(qū)動蛋白在細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮重要作用，其中胞質(zhì)分裂、染色體排列及紡錘體雙極性建立，均依賴于驅(qū)動蛋白的協(xié)同作用[20]。KIF11又稱為驅(qū)動蛋白Eg5，位于人類染色體10q24.1上，研究表明，其活性受到抑制或表達(dá)缺失可促進(jìn)單極紡錘體的形成，阻斷細(xì)胞分裂過程，過表達(dá)則會引起基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[21-22]。KIF11在肝細(xì)胞癌、乳腺癌中均表達(dá)上調(diào)，與癌癥的發(fā)生和預(yù)后不良相關(guān)[23-24]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中KIF11 mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織，F(xiàn)IGO分期更高或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者卵巢癌組織中KIF11 mRNA的表達(dá)水平更高(P<0.05)，說明KIF11可能在卵巢癌中發(fā)揮促癌基因的作用。Cox回歸分析顯示，KIF11 mRNA表達(dá)水平≥1.70的患者的術(shù)后5年總生存率降低，為卵巢癌患者預(yù)后不良獨(dú)立危險因素(P<0.05)，說明KIF11高表達(dá)參與了卵巢癌患者預(yù)后不良的發(fā)生。通過miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，KIF11與miR-431-5p的3′非翻譯端存在潛在結(jié)合位點(diǎn)[25]。本研究結(jié)果也顯示，卵巢癌組織中miR-431-5p表達(dá)水平與KIF11 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說明二者可能共同影響卵巢癌患者的預(yù)后。張洪濤等[25]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)miR-431-5p或敲低KIF11可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，雙熒光素酶基因報告證實(shí)miR-431-5p能負(fù)向調(diào)控KIF11的表達(dá)。上述研究進(jìn)一步佐證了本研究的結(jié)果。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-431-5p表達(dá)下調(diào)，KIF11表達(dá)上調(diào)，二者均與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，可能共同影響卵巢癌患者的預(yù)后。但本研究為單中心研究，且關(guān)于miR-431-5p、KIF11對卵巢癌的影響機(jī)制尚不完全明確，還需進(jìn)一步深入研究。