耿業(yè)業(yè)，王桂榮，張遠(yuǎn)帆，白鈺，陳瑩，朱成豪，吳繁琦，侯俊玲，孫志蓉（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）是豆科多年生草本植物，以根與根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效，有“十方九草”“國老”的美譽(yù)[1]，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，市場需求量大。目前野生甘草資源逐漸減少，人工栽培甘草成為解決供需矛盾的有效途徑。野生甘草具有根瘤固氮特性[2]，是甘草植株氮營養(yǎng)的重要來源之一，但人工栽培甘草的水肥措施會(huì)減少甘草根部結(jié)瘤量[3]，質(zhì)量不及野生甘草[4]。豆科植物氮素來源有土壤供氮、肥料供氮和根瘤固氮三種。根瘤固氮在花生、大豆等豆科經(jīng)濟(jì)作物的生長中發(fā)揮著重要作用，鄭永美等[5]研究表明，花生的根瘤固氮占總氮量的40%以上，最高可達(dá)50%。人工甘草栽培過程中接種根瘤菌劑，能提高10%～30%的產(chǎn)量[6]。根瘤菌劑施入土壤后，土壤中營養(yǎng)元素的形態(tài)和含量會(huì)對豆科植物結(jié)瘤固氮的效果產(chǎn)生影響[7]，其中氮素和磷素對結(jié)瘤影響較大。已有的根瘤固氮研究多集中在大豆、花生、紫花苜蓿等豆科經(jīng)濟(jì)作物[8-9]。目前甘草根瘤固氮方面根瘤菌分離鑒定、遺傳多樣性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析的研究較多[10]，氮素、磷素對甘草結(jié)瘤以及固氮活力的影響還不清楚。本文以盆栽甘草為研究對象，考察不同濃度的氮素和磷素對施加根瘤菌劑的甘草結(jié)瘤量及根瘤固氮活力的影響，探討營養(yǎng)元素對甘草根瘤固氮作用的影響，為甘草栽培措施選定提供參考。

1 材料

1.1 試藥

甘草種子由中國中藥有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫志蓉教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的種子。根瘤菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，為天山中間根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense.），菌株編號(hào)“1.2546”。酵母粉（Solarbio）、瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；甘露醇（Beijing Lablead Biotech Co.，Ltd）；硫酸銨（福晨化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司）；pH 6.8 磷酸緩沖液（國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心）；牛血紅蛋白（上海源葉生物科技有限公司）；甘草酸（批號(hào)：P24J10F91300）、甘草苷（批號(hào)：Z10J8X39611）對照品（上海源葉生物科技有限公司，均供含量測定用）；乙腈和磷酸（Fisher chemical 美國，均為色譜純）；乙醇（北京化工廠，分析純）；用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

SQP 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈工作臺(tái)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HZQ-QX 全溫振蕩器；BY-R20 醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；UV-2800 型紫外可見分光光度計(jì)（舜宇恒平）；SP-742D 型高速粉碎機(jī)（廣州市兆利電器實(shí)業(yè)有限公司）；YCD-EL 260 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；島津LSM 780 型高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 根瘤菌液培養(yǎng)

2.1.1 根瘤菌活化 將配制的YMA 固體培養(yǎng)基[11]放入滅菌鍋內(nèi)滅菌，在超凈工作臺(tái)中趁熱分裝，每皿25 mL，置于室溫凝固，然后均勻涂布菌液，于常溫培養(yǎng)箱內(nèi)活化。

2.1.2 根瘤菌擴(kuò)繁 將配好的YMA 液體培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，每瓶200 mL，放入滅菌鍋內(nèi)滅菌，移至超凈工作臺(tái)中放至室溫。將活化后的根瘤菌接至液體培養(yǎng)基中，在25℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)，當(dāng)620 nm 下檢測吸光度達(dá)0.6 時(shí)即得到根瘤菌液。

2.2 材料培養(yǎng)

采用圓形塑料盆（33 cm×22 cm×31 cm），每盆裝混勻的河沙15 kg。課題組前期在探索根瘤固氮對甘草根部氮營養(yǎng)吸收的影響時(shí)，每盆施加了1.5 g 硫酸銨，結(jié)果表明此用量下甘草根瘤固氮占比高于土壤供氮占比，肥料供氮最低，說明在此用量下甘草可以正常結(jié)瘤固氮，據(jù)此設(shè)置低、中、高三個(gè)水平探索不同氮素水平對甘草根瘤生長及固氮活力的影響，1.5 g 硫酸銨換算得0.32 g N，以0.32 g 為N2 水平，其0.5 倍量為N1 水平，1.5 倍量為N3 水平；磷素用量參考金燕清[12]的“3414”試驗(yàn)，促進(jìn)一年生甘草生物量和甘草酸、甘草苷含量積累的磷（P2O5）用量為9 g·m-2、18 g·m-2，花盆中裝填基質(zhì)表層直徑測量為28 cm，根據(jù)圓形面積公式計(jì)算表面積，得到對應(yīng)每盆施加P2O5量為0.54 g、1.08 g，以0.54 g 為P1水平，1.08 g 為P3 水平，P2 水平為P1 和P3 水平的均值。另設(shè)不加氮素及磷素的對照組（即0 水平組），不同水平氮素和磷素每盆施肥量見表1。在播種前，每盆施入對應(yīng)量的硫酸銨和磷酸二氫鉀，每盆再施入根瘤菌液90 mL，甘草種子處理后在根瘤菌液中浸泡30 min，于2021年4月25日播種，各重復(fù)3 次。當(dāng)幼苗長至5 ～6 片真葉時(shí)間苗，每盆留苗10 株，于甘草出苗后每隔兩周澆灌1000 mL Hogland 營養(yǎng)液（氮素處理去除氮，磷素處理去除磷），常規(guī)管理。

表1 氮素和磷素的水平Tab 1 N and P level

2.3 生長指標(biāo)測定

于9月25日取樣，將根部沖凈，用濾紙吸干水分，測定根長、蘆頭下1 cm 粗度、根鮮重，結(jié)瘤數(shù)、根瘤鮮重，平行6 次。

2.4 豆血紅蛋白含量測定

精密稱取120.0 mg 牛血紅蛋白，用去離子水溶解并移至10 mL 量瓶定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為12.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。按照表2添加試劑，混合反應(yīng)后，在540 nm 波長下測定吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 牛血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法Tab 2 Method for making standard curve of bovine hemoglobin

取0.2 g 的新鮮根瘤，用去離子水洗凈，濾紙吸干后，加入5 mL pH 6.8 的磷酸緩沖液，在4℃的條件下研磨成勻漿，置于冷凍離心機(jī)中4℃、3000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液，紫外分光光度計(jì)下于540 nm 處測定吸光度，以pH 6.8的磷酸緩沖液作為空白對照，平行測定3 次。

2.5 甘草酸和甘草苷含量測定

2.5.1 甘草供試品溶液的制備 取甘草樣品粉末（干燥，粉碎過40 目篩）約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加入10 mL 70%乙醇，稱重，密塞，100 Hz，40℃超聲提取30 min，冷卻至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜備用，即為供試品溶液。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取1.94 mg 甘草酸、2.85 mg 甘草苷置于10 mL 量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得甘草酸質(zhì)量濃度為0.194 mg·mL-1，甘草苷質(zhì)量濃度為0.285 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液，各取2 mL 于10 mL 量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到混合對照品溶液。

2.5.3 測定條件 參照文獻(xiàn)[13]的方法，以Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-磷酸水為流動(dòng)相，流速0.6 mL·min-1，柱溫30 ℃，按表3中的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量為10 μL，于237 nm 下檢測。

表3 流動(dòng)相梯度條件Tab 3 Gradient elution

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用S-N-K 法進(jìn)行差異顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 氮素和磷素對甘草根系生長的影響

不同水平氮素、磷素處理下甘草的根長、根粗、根鮮重（不含根瘤，下同）測定結(jié)果見圖1。隨著氮、磷水平的增加，甘草各指標(biāo)呈先升后降的趨勢，處理組根鮮重顯著高于對照組，各水平中以N2、P2處理各指標(biāo)最高。N2 根長34 cm、根粗8.06 mm、根鮮重4.13 g，分別為對照組的1.25 倍、2.01 倍和4.73 倍；P2 根長33.6 cm、根粗7.24 mm、根鮮重4.11 g，分別為對照組的1.17 倍、1.85 倍和4.07 倍。

圖1 氮、磷對甘草根系生長指標(biāo)的影響Fig 1 Effect of N and P on roots growth indexes of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

3.2 氮素和磷素對甘草結(jié)瘤量的影響

不同水平氮素、磷素處理下甘草的根瘤單重測定結(jié)果見圖2。隨著氮素、磷素水平的增加，根瘤單重呈先升后降的趨勢，氮素各水平中以N1 處理組最高，根瘤單重0.05 g，為對照組的4.49 倍，N2、N3 處理組高于對照組，但N3 與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；磷素各水平（P1、P2、P3）均顯著高于對照組，其中P1 處理最高，根瘤單重0.04 g，為對照的5.43 倍。

圖2 氮磷對甘草根瘤單重的影響Fig 2 Effect of N and P on the weight of single nodule of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

不同水平氮素、磷素處理下甘草的單株結(jié)瘤數(shù)量測定結(jié)果見圖3。隨著氮素、磷素水平的增加，單株結(jié)瘤數(shù)呈先升后降趨勢，氮素各水平中以N2 處理最高，單株結(jié)瘤18 個(gè)，為對照組的5.35 倍，N1、N3 處理與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；磷素各水平中以P2 處理最高，單株結(jié)瘤9 個(gè)，為對照組的2.14倍，P1、P3 處理與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 氮磷對甘草單株結(jié)瘤數(shù)的影響Fig 3 Effect of N and P on the number of nodulations of Glycyrrhiza uralensis Fisch. per plant

3.3 氮素和磷素對甘草根瘤豆血紅蛋白含量的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中的牛血紅蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，以540 nm 下吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y＝0.1459X-0.0097（R2＝0.9994），牛血紅蛋白在0 ～3.6 mg 內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

將不同氮素、磷素用量下測定的甘草根瘤的豆血紅蛋白吸光度帶入回歸方程，得到對應(yīng)的豆血紅蛋白含量，結(jié)果見圖4。隨著氮素水平的升高，根瘤中豆血紅蛋白含量呈先升后降趨勢，N2 處理組最高，豆血紅蛋白含量18.84 mg·g-1，為對照組的1.96 倍，N2、N3 處理與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨磷肥水平的增加，根瘤中豆血紅蛋白含量呈下降趨勢，P2、P3 處理顯著低于對照組。

圖4 氮磷對甘草根瘤豆血紅蛋白含量的影響Fig 4 Effect of N and P on hemoglobin content of nodules of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

3.4 氮素和磷素對甘草酸和甘草苷含量的影響

取“2.5.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，稀釋成系列濃度，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以各對照品中甘草酸、甘草苷含量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：甘草酸：Y＝9.542×106X+1.422×104（R2＝1.000），線性范圍：0.001 94 ～0.031 04 mg·mL-1，甘草苷：Y＝3.199×107X-3.511×103（R2＝1.000），線性范圍：0.002 85 ～0.0456 mg·mL-1。

不同水平氮素、磷素處理下甘草的甘草酸、甘草苷測定結(jié)果見圖5。隨著氮素濃度的升高，甘草酸、甘草苷含量呈先升后降趨勢，N1、N2、N3 均顯著高于對照組，其中N2 處理組最高，甘草酸含量為2.99 mg·g-1，甘草苷含量為1.27 mg·g-1，分別為對照組的7.77 倍、5.62 倍；隨著磷素濃度的升高，甘草酸、甘草苷含量呈上升趨勢，P1、P2、P3 均顯著高于對照組，其中P3處理最高，但與P2 處理相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甘草酸含量為2.19 mg·g-1，甘草苷含量為0.90 mg·g-1，分別為對照組的2.24 倍、2.64 倍。

圖5 氮素（A）及磷素（B）對甘草中甘草酸、甘草苷含量的影響Fig 5 Effect of N（A）and P（B）on the content of glycyrrhizic acid and liquiritin in Glycyrrhiza uralensis Fisch.

4 討論與結(jié)論

根瘤固氮為豆科植物提供生長所需氮素，豆科植物為根瘤菌提供碳源，兩者互利共生。1947年Virtanen 證明了含有豆血紅蛋白的根瘤具有固氮能力[14]，近年來有研究[15-16]以乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性，然后測定該根瘤中豆血紅蛋白含量，研究結(jié)果表明不同植物和不同部位個(gè)體瘤中，瘤體的固氮酶活性與豆血紅蛋白含量均成正相關(guān)。研究表明外源因素處理通過改變根瘤中豆血紅蛋白含量來改變固氮酶活性[17-18]，因此本文以根瘤中豆血紅蛋白含量評價(jià)根瘤固氮活力，豆血紅蛋白含量越高，結(jié)瘤數(shù)目越多，說明根瘤固氮能力越強(qiáng)。

在不外施根瘤菌劑的條件下，隨著氮素濃度的增加，大豆、花生的生物量、結(jié)瘤量和固氮活性呈先上升后下降的單峰變化趨勢[19-21]，在伴施根瘤菌劑的基礎(chǔ)上，紫花苜蓿的生物量、結(jié)瘤數(shù)量和根瘤重隨氮肥施用量的增加先上升后下降[22]，說明外源施加根瘤菌不會(huì)改變氮素濃度對豆科植物的生長和結(jié)瘤趨勢，但根瘤菌對氮素、磷素敏感，高濃度的氮素、磷素會(huì)抑制結(jié)瘤[23]，所以在外源施加根瘤菌液，增強(qiáng)植株固氮能力的同時(shí)，選擇適合根瘤菌存活及侵染的氮素、磷素濃度至關(guān)重要。本文在施加根瘤菌液的基礎(chǔ)上，施用不同水平的氮素、磷素，發(fā)現(xiàn)在施加根瘤菌劑的基礎(chǔ)上，施用氮素、磷素能夠促進(jìn)甘草根部生物量積累，提高根部結(jié)瘤數(shù)量，增加根瘤單重，以N2、P2 處理組最好，說明適量氮素、磷素會(huì)為甘草植株生長提供養(yǎng)分，促進(jìn)甘草生長，進(jìn)而為根瘤提供養(yǎng)分，促進(jìn)結(jié)瘤。豆血紅蛋白中血紅素的部分由根瘤菌合成，而球蛋白的部分則是由寄主（豆科植物）所合成[24]，在本試驗(yàn)條件下，豆血紅蛋白含量隨氮素施用水平的增加先升后降，與甘草生物量和根瘤數(shù)目的變化趨勢一致；隨磷素施用水平的增加而下降，可能與磷素降低植株根部全鐵含量有關(guān)[25]。隨氮素、磷素水平的增加，甘草酸、甘草苷含量呈上升趨勢，說明在試驗(yàn)條件下的氮素、磷素濃度不會(huì)抑制甘草酸、甘草苷的積累。基于本研究結(jié)果，可以為后續(xù)研究甘草施加根瘤菌劑與肥料提供參考，優(yōu)選施肥用量，既能節(jié)省成本，又能提高甘草固氮能力，促進(jìn)甘草生長和活性成分積累。

綜上所述，在試驗(yàn)條件下，甘草生物量、根瘤單重和結(jié)瘤數(shù)目隨氮素、磷素施用水平的增加先上升后下降，豆血紅蛋白含量、甘草酸和甘草苷含量隨氮素施用水平的增加先上升后下降，隨磷素施用水平的增加豆血紅蛋白含量呈下降的趨勢，甘草酸和甘草苷含量呈上升的趨勢。在施加根瘤菌劑基礎(chǔ)上，每15 kg 河沙施0.32 g N、0.81 g P2O5有利于甘草生物量和活性成分甘草酸、甘草苷的積累，促進(jìn)結(jié)瘤，可為后續(xù)研究外源營養(yǎng)對甘草根瘤固氮的影響提供參考。