林立銘，王琴飛，余厚美，徐 緩，張振文

（中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/國家薯類加工專業(yè)技術研發(fā)分中心，海南儋州 571737）

木薯（Manihot esculentaCrantz.）是重要的熱帶糧食作物，其塊根收獲時的機械損傷會使其在采后72 h 內迅速腐爛。據報道[1]，全球每年因采后腐爛而損失的可達到總產量的10%～30%，已成為制約木薯產業(yè)發(fā)展的重要因素。隨著產業(yè)發(fā)展目標從“工業(yè)化”向“食用化”過渡轉型，貯藏保鮮技術顯得格外重要。冷凍貯藏（?20 ℃）是目前最常用且有效的保鮮方式，在廣西南寧、廣東化州等地廣泛應用，但成本頗高，且極有可能造成風味流失[2]。冰溫技術是指一種在冰點溫度范圍內貯藏果蔬等新鮮食品的貯藏技術，可最大程度地降低果品、生鮮等活體呼吸速率，從而抑制病原微生物滋生，進一步延長果品的貯藏期和保質期[3]。冰點是食品冷藏保鮮加工的重要熱物性參數之一，果蔬冰點的確定對低溫冷卻、凍傷機理以及冷藏冷凍加工的研究具有重要意義[4?6]。然而，目前的研究工作主要圍繞生理生化指標與貯藏效果等展開，關于保持其品質的影響機理鮮見報道，不利于冰溫貯藏技術的廣泛應用。

有研究表明，果蔬冰點與可溶性固形物含量呈顯著或極顯著負相關水平[7?9]，而林向東等[10]的研究結果表明，原料含水量不同，冰點也不相同。王丹等[11]通過研究桑葚凍結特性發(fā)現，個體差異、不同物態(tài)對冰點影響較大；與一般果蔬不同，高淀粉類果蔬的結晶釋放較高潛熱對冰點造成影響[12]。而有關冬棗冰點的研究顯示，其冰點因果實成熟度、含糖量等不同而有所差異[13]?？梢?，關于物料凍結特性的研究不僅需要考慮內含物質的區(qū)別，同時還要兼顧物料表觀特征。

研究顯示，木薯塊根不同部位的營養(yǎng)成分存在極顯著差異[14]。因此，本研究將通過測定食用木薯塊根不同部位隨溫度下降電導率的變化情況，確定其冰點溫度范圍，了解凍結特性，分析塊根含水量、可溶性固形物及淀粉含量與冰點的關系；利用非靶向代謝組學研究代謝產物的變化，為木薯塊根低溫儲藏技術提供理論支撐，也為今后木薯食用化利用技術的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用木薯（指新鮮塊根氫氰酸含量低于50 mg/kg的木薯品種）：華南9 號（South China 9,SC9） 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，種植時間為10 個月；二水合氯化鈣、醋酸、硫酸鋅、氯化亞鐵、無水乙醇、亞鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

CP213 電子天平 中國奧豪斯儀器有限公司；HH-S6 恒溫水浴鍋、XH-C 旋渦混合器 金壇儀器廠；DAX-9053 恒溫干燥箱 上海福碼公司；H3-18 KR 臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；FE38 電導率測試儀 上海右一儀器有限公司；PAL-1 糖度計 上海安儀科學儀器有限公司；WZZ-2B 旋光儀 上海精密儀器儀表公司；HS-S 數顯恒溫油浴鍋 常州隆和儀器制造有限公司；Q Exactive?HF-X 質譜儀、Vanquish UHPLC 色譜儀、色譜柱Hypesil Gold column（100×2.1 mm,1.9 μm） Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯預處理 鮮木薯塊根收獲后，隨機選取無腐爛的薯塊，洗凈去皮。為充分研究塊根營養(yǎng)成分對凍結參數的影響，參照魏艷等[14]的方法將整條薯從頭部、中部和尾部橫切取樣（如圖1），根據電導率儀兩極孔隙大小分別將各部位切成長方體小塊（長、寬、高約2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm），以保證薯塊與電極能夠緊密接觸，長方體小塊用于凍結參數測定，其它樣品置于烘箱中，60 ℃烘干后粉碎過80 目篩，用于其它指標的測定。

圖1 塊根取樣示意圖Fig.1 Sampling for cassava root

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 塊根凍結參數 參考宋麗榮等[15]的方法，將電導率測定儀探頭置于蒸餾水中，打開儀器，預熱5～10 min；將固態(tài)食品物料切成大小適宜的長方體嵌入電導率儀兩極之間，使物料與之緊密接觸，將電極探頭置于?20 ℃的密閉冷凍環(huán)境中，每分鐘記錄1 次溫度值,待溫度和電導率不再發(fā)生變化時可結束測定；將記錄的溫度值和對應的時間數據輸入Excel 表格中，以時間為橫坐標，溫度值為縱坐標，作出點線曲線圖。

1.2.2.2 含水量（Water content,WC） 采用GB 5009.3-2016 《食品中水分的測定》[16]。

1.2.2.3 可溶性固形物（Total soluble substance,TSS）

采用NY/T 2637-2014 《水果、蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》[17]。

1.2.2.4 淀粉含量（Starch content，SC） 采用GB/T 20378-2006 《原淀粉 淀粉含量的測定 旋光法》[18]。

1.2.3 代謝組學分析 樣品處理：參考Kim 等[19]的方法，塊根洗凈去皮，冰水浴處理1 h（經前期實驗得出，塊根冰水浴1 h 時內部溫度已達到冰溫）；然后隨機稱取250 mg 樣品，分裝至2 mL 離心管中，用錫箔紙包裹并標記后，放入液氮中冷凍處理至少15 min。取出后迅速放入自封袋中（每組一袋），在自封袋中放入標簽紙標明樣本信息后迅速放入?80 ℃冰箱凍存待測，標記為C60。以未經冰水浴處理的樣品為對照，標記為C0。

代謝物提?。簠⒖糤ant 等[20]的方法，取100 mg液氮研磨的組織樣本，置于EP 管中，加入500 μL 含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15000 r/min、4 ℃離心10 min，取一定量的上清加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中15000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清，進樣LC-MS 進行分析。

質控（QC）樣本：從每個實驗樣本中取等體積樣本混勻作為QC 樣本。

空白（blank）樣本：含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替實驗樣本，前處理過程與實驗樣本相同。

色譜條件：色譜柱：Hypesil Gold column（C18）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：100 μL；掃描范圍選擇m/z 70～1050；正模式：流動相A：0.1%甲酸，流動相；B：甲醇；負模式：流動相A：5 mmol/L 醋酸銨，pH9.0；流動相 B：甲醇。

1.3 數據處理

實驗操作均重復3 次，結果以平均值±SD 表示。利用Excel 2010 制作圖表，顯著性和相關性分析采用SAS 8.1 進行分析。方差分析中P<0.05 表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義。通過KEGG PATHWAY數據庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB 數據庫（https://hmdb.ca/metabolites）、LIPID MAPS 數據庫（http://www.lipidmaps.org）對鑒定到的代謝物進行注釋。

2 結果與分析

2.1 食用木薯塊根凍結特性曲線

一般地，物料的凍結過程可分為三個階段：冷卻階段-冰晶生成階段-繼續(xù)凍結階段[21]。本研究發(fā)現，SC9 塊根凍結過程表現為凍結溫度隨時間的延長不斷下降，直到到達某一溫度時，溫度變化曲線逐漸平緩，呈現相對穩(wěn)定狀態(tài)，其過冷點與冰點重合，此時的溫度即為塊根的冰點；如圖2 所示，頭部、中部表現為冰點與過冷點重合，溫度分別為?0.6、?1.0、?1.1 ℃；不同部位發(fā)生凍結的時間并不一致，這可能與其內含物成分及比例不同，細胞組織對凍結過程的阻礙作用相關，對于凍結特性的影響仍有待深入研究[11]。

圖2 塊根不同部位凍結曲線Fig.2 The freezing curve type of different parts of cassava root

2.2 塊根凍結特性研究

2.2.1 塊根不同部位成分 物料低溫凍結主要是由其本身水分冷卻凝固造成的，含水量在一定程度上影響物料的凍結特性。果蔬細胞內部TSS 主要包含糖、有機酸、鹽、果膠、多元醇等，其含量高低反映細胞生理生化特性，且與品質密切相關[22]。淀粉是木薯塊根干物質含量占比最大的一種營養(yǎng)成分，因吸水性強，其含量高低影響了塊根中可凍結水分的含量。表1 結果顯示，不同部位成分差異比較發(fā)現，除含水量頭部與中部、尾部呈極顯著差異外（P<0.01），可溶性固形物及淀粉含量均無顯著差異（P>0.05）；塊根含水量表現出頭部<中部<尾部的規(guī)律，亦可說明干物質含量規(guī)律應為頭部>中部>尾部，而可溶性固形物與淀粉含量同樣表現出類似規(guī)律，這與前人研究木薯的結果一致[14]。甘蔗不同部位含糖量的規(guī)律與該結果相近[23?24]，原因可能與運輸蛋白、相關酶活、跨膜運輸等有關，需進行進一步驗證。

表1 塊根不同部位成分差異比較Table 1 Comparison of components for different parts of cassava roots

2.2.2 相關性分析 由表2 可看出，可溶性固形物和含水量呈極顯著負相關（P<0.01），冰點溫度（Freezing Temperature，FT）則與可溶性固形物、含水量呈負相關關系，與淀粉含量呈正相關關系。即可溶性固形物、含水量越高，則冰點溫度越低，但相關性不顯著（P>0.05），這可能與淀粉類果蔬冰點受細胞內冰晶結晶速率的影響，造成可溶性固形物含量發(fā)生變化有關[12]。

表2 冰點影響因素相關分析Table 2 Effects of relative analysis for freezing temperature

2.3 非靶向代謝組學分析

2.3.1 樣品偏最小二乘法判別分析 偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA）是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，通過運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型，來實現對樣品類別的預測[25]。初步的模型構建驗證發(fā)現，R2數據大于Q2數據，且Q2回歸線與Y 軸截距小于0 時，表明模型未“過擬合”（圖3）模型穩(wěn)定可靠。

圖3 兩種離子模式下的PLS-DA 得分圖及驗證圖Fig.3 PLS-DA score diagram and valid diagram under two ion modes

2.3.2 差異代謝物篩選結果 通過KEGG、HMDB、LIPID MAPS 等數據庫對代謝物進行功能和分類注釋，其中，差異代謝物的篩選主要參考VIP、FC 和P值三個參數，VIP 是指PLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（Variable Importance in the Projection）[26]，VIP 值表示代謝物對分組的貢獻；FC 指差異倍數（Fold Change），為每個代謝物在比較組中所有生物重復定量值的均值的比值；P值是通過Ttest 計算得到[27]，表示差異顯著性水平。設定閾值為VIP>1.0，FC>1.2 或FC<0.833 且P<0.05[26,28?29]，共篩選出41 個顯著差異代謝物，包括3 種脂肪酸和共軛物、1 種羥基肉桂酸及其衍生物、2 種苯甲酸及其衍生物、1 種喹啉羧酸、6 種氨基酸、肽和類似物、膽汁酸、醇和衍生物、1 種黃酮苷、1 種嘧啶核苷酸、1 種酮類、1 種黃酮類、1 種吡啶羧酸及其衍生物、1 種線性二芳基庚烷以及22 種未識別物質，其中，31 個表達上調，10 個表達下調。結果見表3。

表3 冰溫處理與常溫對照的差異代謝物Table 3 Differential metabolites between ice temperature treatment and normal temperature control

2.3.3 差異代謝產物富集分析 將篩選出的41 個組間差異代謝物通過KEGG 富集通路分析，繪制出主要的生化代謝和信號轉導途徑富集氣泡圖（圖4）。從圖4 可以看出，P<0.05 的代謝途徑有3 條，分別是苯丙氨酸代謝通路（Phenylalanine metabolism）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）和光合固碳作用（Carbon fixation in photosynthetic organisms）。其中，苯丙氨酸代謝通路的氣泡最大，表示該通路中差異代謝物富集程度最高。說明經冰溫處理后塊根苯丙氨酸通路中差異代謝物數目最多。通過ROC 曲線，可以看出，其差異代謝物ROC 曲線下方的面積（AUC）在0.9 以上（圖5），表明該結果具有較高的準確性。

圖4 KEGG 富集氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment scatterplot

圖5 差異代謝物ROC 曲線圖Fig.5 ROC curve of differential metabolites

2.3.4 關鍵代謝通路分析 與對照相比，冰溫處理下的苯丙氨酸代謝通路如圖6 所示，（圓圈代表代謝物，其中綠色實心圓圈標記為注釋到的代謝物，紅色圓圈標記為上調差異代謝物），通路中共有9 個顯著差異代謝物，其中，作為水楊酸前體的馬尿酸（Hippuric Acid，HA）和苯甲酸（Benzoic acid，BA）兩種產物表達上調，這可能是導致冰點溫度貯藏保鮮效果顯著的主要原因。

圖6 苯丙氨酸代謝通路Fig.6 Phenylalanine metabolism pathway

3 討論與結論

果蔬在凍結過程中，細胞汁液逐漸發(fā)生形態(tài)改變（液態(tài)-固態(tài)），當溫度持續(xù)下降至第一個最低點時，即為過冷點；隨后，細胞通過釋放潛熱，溫度會出現小幅上升，達到某一高點，即為凍結點，此時零度與凍結點之間的溫度范圍稱為冰溫帶[30]。冰溫貯藏保鮮是一種將物料置于冰溫帶中的非凍結保鮮技術，其本質是利用細胞液內蛋白質、氨基酸等物質形成的一定空間網絡結構，能阻礙冰晶生成，保持細胞的完整性，且在該溫度帶內呼吸速率大大降低、酶及微生物極大程度受到抑制，相對于常溫儲藏，可使果品延長2～10 倍的貯藏期[3,31]。

目前，關于木薯塊根保鮮技術的研究匱乏，而多采用耗能和成本頗高的凍藏方式進行貯藏（?20 ℃）。因此，開展冰溫貯藏利用及基因表達情況、代謝產物的差異性分析等研究將為轉變木薯塊根貯藏方式提供可靠依據和有力支撐。王二歡等[32]認為，關玉竹不同部位冰點與水分含量關系有所差異，推測冰點不僅與水分含量及組成有關，而且與植物組織內成核劑（細菌性和非細菌性）、遺傳有一定關系，這可能是冰點與其水分組成之間相關性發(fā)生改變的原因；本試驗發(fā)現，木薯塊根的冰點溫度與可溶性固形物、含水量，淀粉含量分別呈負、正相關關系，但都不顯著，雖然與前人研究結果有出入，一方面這與木薯塊根含有大量淀粉顆粒，在冷凍前期凍結速率較低時，細胞內微細物質會影響冰晶生長。隨著溫度逐步降低，細胞內結晶會釋放潛熱，影響細胞凍結溫度，阻礙冰晶的形成[11]；另一方面木薯作為典型菌根作物，內含微生物類型豐富，使得凍結過程組織內成核，從而造成冰點有所差異有關。

水楊酸（salicylic acid,SA）是植物中普遍存在的一種小分子酚類物質，已有研究人員發(fā)現SA 在植物應對高低溫、鹽、重金屬等非生物脅迫方面扮演著重要角色[33?34]，尤其是在ROS 清除[35]，緩解細胞脫水[36]及與其他信號分子間相互作用[37]等機體響應低溫脅迫的生理機理作用已得到證實。經過科學家多年研究，低溫可促進植物組織中水楊酸的合成已取得共識，其來源途徑主要分為苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）途徑和異分支酸合成酶（isochorismate synthase,ICS）途徑，可能與物種、低溫處理時間及強度等因素有關[38]。本研究發(fā)現，通過冰溫處理后塊根的非靶向代謝組學分析，與對照相比，塊根主要的差異代謝反映在苯丙氨酸代謝通路上，該通路共注釋到9 個具有顯著差異的代謝物，水楊酸的前體物質馬尿酸與苯甲酸二者表達上調，推測水楊酸的差異表達是塊根冰溫貯藏具有良好保鮮效果的關鍵，這與張秋明等[39]研究柑桔內源水楊酸含量變化對耐貯性影響的結論類似。

綜上所述，食用木薯塊根冰點為?0.6～?1.0℃，通過冰點影響因素結合代謝組學分析，實際貯藏溫度建議控制在（?1.0±1）℃間，既能降低低溫貯藏成本，也能有效避免溫度過低而造成冷害發(fā)生。