韓坤宸，朱雯君，趙海燕，何潛祖，馬金克，于曉涵，張欽任，李全陽,

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)醫(yī)院，廣西南寧 530004）

作為系統(tǒng)生物學(xué)的下游，代謝組學(xué)能夠準(zhǔn)確捕捉機(jī)體狀態(tài)的變化，識(shí)別可能的信號(hào)或生物標(biāo)志物，已成為了解機(jī)體健康機(jī)制的重要手段。Ke 等[1]通過血清代謝組學(xué)鑒定出了中國高度近視老年人的血清生物標(biāo)志物，并研究了與高度近視相關(guān)的代謝改變；Floegel 等[2]使用靶向代謝組學(xué)鑒定了與2 型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的血清代謝標(biāo)志物。核磁共振氫譜（Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H NMR）因具有對(duì)樣品的非侵入性、非破壞性且重現(xiàn)性高等特點(diǎn)，在代謝組學(xué)研究中被廣泛使用[3]。Rawat 等[4]通過1H NMR 血清代謝分析揭示了罹患糖尿病及糖尿病相關(guān)并發(fā)癥患者的生物標(biāo)志物；Zhang 等[3]通過1H NMR 代謝組學(xué)揭示了無癥狀性高尿酸血癥（HUA）和痛風(fēng)患者的代謝特征，并確定了從HUA 到痛風(fēng)的潛在病理。報(bào)道顯示更多的研究著重于將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于某些具體病例中代謝標(biāo)志物的判定，而用代謝組學(xué)技術(shù)來揭示飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體健康狀況的改善及代謝物特征變化的研究相對(duì)較少。

飲食是影響人體健康的重要因素[5]。通過整體的飲食模式而非單一食物或營養(yǎng)素干預(yù)被認(rèn)為是改善機(jī)體健康狀態(tài)更有效的方法[6]，美國心臟協(xié)會(huì)對(duì)健康飲食的定義也側(cè)重于整體的飲食模式[7]。健康的飲食模式可以有效延長壽命，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，減緩與年齡相關(guān)的慢性疾病的發(fā)生[8?9]。然而，飲食如何影響健康長壽是極其復(fù)雜的。過去的研究側(cè)重于從飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體生理生化指標(biāo)，或者某種針對(duì)性病癥的改善狀況來判定飲食對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用[10?11]。從代謝組學(xué)的角度來判斷飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體相關(guān)代謝的生物標(biāo)志物和代謝途徑，從而剖析飲食對(duì)機(jī)體的營養(yǎng)治療影響的研究并不常見。此外，短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）在調(diào)節(jié)宿主健康狀態(tài)，改善機(jī)體罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素中發(fā)揮著重要作用[12]。SCFAs 作為微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，其主要產(chǎn)生在腸道。故本研究使用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）靶向檢測(cè)了糞便中SCFAs的變化，以更好地分析所構(gòu)建飲食模式對(duì)機(jī)體代謝的影響。

基于團(tuán)隊(duì)前期成果，本研究試圖從人體試驗(yàn)的角度，分析所構(gòu)建的廣西長壽飲食模式對(duì)機(jī)體代謝物的影響，探究飲食引起的血清代謝組學(xué)與糞便SCFAs 的變化，進(jìn)一步分析二者共同影響的潛在通路和對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)的有益作用，評(píng)估廣西長壽飲食模式作為改善機(jī)體健康狀況、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的飲食的適宜性，也為進(jìn)一步闡明用飲食促健康的生理生化機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氘代重水（純度≥99.9%）、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、偏磷酸、氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所需新鮮食材 當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買。

Bruker Avance 500 MHz 核磁共振光譜儀 德國Bruker 光譜儀器公司；7890B 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀美國安捷倫公司；Pico17 低溫冷凍離心機(jī) 美國Thermo 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廣西長壽飲食模式食譜的凝煉 通過團(tuán)隊(duì)前期對(duì)廣西長壽地區(qū)高壽人群隊(duì)列的飲食及代謝物特征、腸道菌群等方面研究后，得知長壽地區(qū)老人飲食以粥類、粗雜糧類、深色蔬菜類食物為主，具有高膳食纖維、高VA、低能量、低脂肪、低蛋白、低膽固醇的特征[13]。據(jù)此，本團(tuán)隊(duì)用D-半乳糖致衰小鼠、自然衰老小鼠等對(duì)長壽老人飲食中的特征營養(yǎng)素進(jìn)行探究，主要強(qiáng)調(diào)了膳食纖維和能量的攝入量，同時(shí)結(jié)合一定的維生素、微量元素等優(yōu)化設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在10%能量限制，且包含較高水平膳食纖維攝入的組別中所構(gòu)建的飲食模式降低炎癥，抵抗衰老的效果最好[14?15]。

本研究所設(shè)計(jì)的廣西長壽飲食模式主要基于團(tuán)隊(duì)前期調(diào)研所得的百歲老人飲食特征以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《中國居民膳食指南2016 版》和《中國老年人膳食指南2010》中各營養(yǎng)素推薦量，在能量、脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維上對(duì)廣西長壽飲食模式進(jìn)行了設(shè)計(jì)和優(yōu)化。其中，能量攝入以膳食指南推薦量為基礎(chǔ)，結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果（10%能量限制）計(jì)算得出[14]。膳食纖維攝入量根據(jù)小鼠實(shí)驗(yàn)中的最佳劑量，結(jié)合對(duì)百歲老人的飲食調(diào)查結(jié)果計(jì)算得出[13?15]。脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物的攝入量均基于百歲老人飲食特點(diǎn)[13]，結(jié)合膳食指南推薦量?jī)?yōu)化設(shè)計(jì)而得，符合膳食指南推薦范圍。以年齡60～70 歲，BMI=21.25（18.5～24.0 的中位數(shù)）的輕體力活動(dòng)男性志愿者為例，設(shè)計(jì)其平均每日所需營養(yǎng)素?cái)z入量如下：能量（1710±38）kcal/day、蛋白質(zhì)15%、脂肪25%、碳水化合物60%、膳食纖維攝入量為（32.91±0.73）g/day。該模式實(shí)施過程中，首先根據(jù)對(duì)志愿者進(jìn)行調(diào)查和測(cè)量得到的性別、體重、每日勞動(dòng)強(qiáng)度等信息，對(duì)志愿者的營養(yǎng)素?cái)z入量進(jìn)行針對(duì)性的設(shè)計(jì)。菜單是根據(jù)所設(shè)計(jì)的營養(yǎng)素?cái)z入量，結(jié)合廣西長壽地區(qū)高壽人群隊(duì)列飲食的偏好及廣西長壽地區(qū)的特色食物設(shè)定的。飲食中包括當(dāng)?shù)胤N植的季節(jié)性水果、蔬菜和谷物，而肉類攝入較少。志愿者的飲食在符合要求的特定地點(diǎn)準(zhǔn)備和供應(yīng)，所有食物都經(jīng)過精確計(jì)量。

1.2.2 研究設(shè)計(jì) 本研究是一項(xiàng)為期4 周的單臂研究，參與者作為自己的對(duì)照。于2020 年10 月8 日至2020 年12 月1 日通過傳單、電子郵件和個(gè)人交流等方式招募志愿者。志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡50～75 歲；身體狀態(tài)穩(wěn)定；未長期服用且實(shí)驗(yàn)前一個(gè)月未服用影響免疫系統(tǒng)的藥物及抗生素；試驗(yàn)前兩周未補(bǔ)充益生元、益生菌或維生素；對(duì)本研究涉及的試驗(yàn)不出現(xiàn)過敏現(xiàn)象。在篩選過程中，參與者被告知試驗(yàn)中涉及的內(nèi)容和潛在風(fēng)險(xiǎn)，并簽署書面知情同意書。研究方案已獲得廣西大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.GXU-2020-136）。

為排除其他因素的影響，在試驗(yàn)過程中，志愿者被要求先進(jìn)行兩周穩(wěn)定的習(xí)慣性飲食，然后接受為期2 周的高依從性廣西長壽飲食干預(yù)，并在基線（Day 1:習(xí)慣性飲食開始前）、第2 周結(jié)束（Day 15:習(xí)慣性飲食結(jié)束/廣西長壽飲食開始）和第4 周結(jié)束（Day 29:飲食干預(yù)結(jié)束后）采集志愿者的糞便樣品和禁食一夜后的血液樣品（圖1）。在習(xí)慣性飲食階段，志愿者可自由進(jìn)食，但被要求保持穩(wěn)定的飲食；在廣西長壽飲食干預(yù)期間，志愿者需食用課題組提供的食物，包括早餐、中餐、晚餐、水果和堅(jiān)果。且要求其除自由飲水外，不再食用其他食物。此外，所有志愿者都被要求在參與試驗(yàn)期間保持穩(wěn)定的身體活動(dòng)量。

圖1 樣品采集時(shí)間序列圖示Fig.1 Illustration of sample collection time series

1.2.3 血清樣本的制備 用靜脈穿刺抽取法采集志愿者的空腹血液樣品，在室溫（25 ℃）下靜置30 min，然后在4 ℃、3000 r/min 下離心15 min 以分離血清，并將分離好的血清樣品儲(chǔ)存在?80 °C 冰柜。在核磁共振試驗(yàn)前，將血清樣本在室溫（25 ℃）下解凍后，準(zhǔn)確吸取200 μL 血清樣品至2 mL 無菌離心管中，加入400 μL 含重水的磷酸鹽緩沖溶液（100%D2O，0.9% NaCl，50 mmol/L 磷酸鹽，pH7.4），混勻后于4 ℃、12000 ×g 下離心10 min，取550 μL 上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR 管中進(jìn)行1H NMR 光譜分析。

1.2.4 血清1H NMR 的測(cè)定及代謝標(biāo)志物分析 所有血清樣品在298 K 下用核磁共振光譜儀進(jìn)行分析，工作的1H 共振頻率為500.13 MHz。使用標(biāo)準(zhǔn)Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列[RD-90o-（t-180o-t）n-ACQ]采集一維光譜，同時(shí)采用預(yù)飽和法抑制水峰。采集參數(shù)為：掃描次數(shù)NS=64，采樣點(diǎn)數(shù)TD=65536，譜寬SWH=10000 Hz，馳豫延遲RD=2 s。使 用MestReNova 14.0軟件（Mestrelab Research,Spain）對(duì)1H 核磁共振波譜進(jìn)行相位和基線校正。以α-葡萄糖左鋒的化學(xué)位移5.233 ppm 定標(biāo)，同時(shí)對(duì)化學(xué)位移區(qū)間δ0.00～9.00 ppm 的區(qū)域以δ0.004 ppm 進(jìn)行分段積分，排除水共振區(qū)δ4.70～5.10 ppm 以消除水信號(hào)的影響，最后將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化處理。

使用SIMCA-P 13.0 （Umetrics,Sweden） 軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。用無監(jiān)督的主成分分析（principal components analysis，PCA）評(píng)價(jià)志愿者血清代謝物的內(nèi)在聚類。為了最大限度地實(shí)現(xiàn)兩組之間代謝物的分離，使用了正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。使用置換檢驗(yàn)（permutation tests,重復(fù)次數(shù)n=200 次）來驗(yàn)證模型的有效性。根據(jù)變量投影重要度（variable importance for projection，VIP）>1 初步篩選出差異代謝物，再進(jìn)一步采用配對(duì)t檢驗(yàn)或者配對(duì)Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)，選擇VIP>1 且P<0.05 的代謝物作為具有顯著性差異的代謝標(biāo)志物。

1.2.5 糞便樣品的制備及其短鏈脂肪酸的測(cè)定 在測(cè)定SCFAs 之前，參照祁波等[16]的方法，稍作修改。將乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯配制為梯度混合溶液，進(jìn)行GC-MS 分析，計(jì)算并繪制各SCFAs 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。志愿者需根據(jù)培訓(xùn)要求規(guī)范收集新鮮的糞便樣本。糞便立即放進(jìn)冰盒并盡快轉(zhuǎn)存在?80 ℃冰柜等待分析。取0.2 g糞便樣品加入2 mL 超純水中，渦旋2 min，然后以10000×g 離心15 min。取1 mL 上清液加入250 μL的25%偏磷酸溶液酸化，混勻后加入2 mL 乙酸乙酯萃取，于4 ℃，12000×g 離心5 min，取上層有機(jī)相用0.22 μm 微孔膜過濾并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，用于GCMS 分析。

GC-MS 分析采用DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，柱溫：初溫110 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至160 ℃，再以4 ℃/min 升至240 ℃，保持1 min，進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣流速：3 mL/min；分流比：18:1；離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：250 ℃。質(zhì)譜：EI 源轟擊電壓：70 eV，單離子掃描模式：定量離子60、73。

1.2.6 代謝途徑分析 在MetaboAnalyst 5.0 平臺(tái)上，利用代謝組學(xué)途徑分析（MetPA）軟件結(jié)合京都基因與基因組百科全書（KEGG；http://www.genome.jp/kegg/）構(gòu)建和富集分析代謝途徑，以可視化代謝物網(wǎng)絡(luò)，并確認(rèn)飲食干預(yù)對(duì)機(jī)體代謝物影響所涉及的靶向代謝通路。

1.3 樣本量計(jì)算

因未曾有用本飲食模式做過類似的人體研究，故本研究參考Brons 等[17]的方式，使用R 語言進(jìn)行“事后功率”計(jì)算。已有研究證明血液乳酸水平可作為代謝健康狀態(tài)的重要標(biāo)志物，故選取乳酸作為主要的預(yù)后指標(biāo)[18]。根據(jù)本研究的結(jié)果，設(shè)置顯著性水平為0.05，平均差差值為1.53，標(biāo)準(zhǔn)偏差差值為1.07，本研究計(jì)算出12 名受試者即可滿足90%的統(tǒng)計(jì)功效。因此，本研究中14 名志愿者能夠滿足試驗(yàn)需要。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表示為±s。對(duì)于志愿者代謝物的差異變化，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)的Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。使用Heatmapper 進(jìn)行代謝標(biāo)志物聚類分析，志愿者代謝標(biāo)志物特征曲線分析（receiver operating characteristic curve，ROC）使用R 語言進(jìn)行，以評(píng)估所篩選代謝物的性能和準(zhǔn)確性。使用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試者基礎(chǔ)特征

經(jīng)過初步篩查，14 名受試者符合納入標(biāo)準(zhǔn)且完成了實(shí)驗(yàn)。受試者基礎(chǔ)特征指標(biāo)如表1 所示。

表1 基線時(shí)志愿者臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征Table 1 Clinical and demographic characteristics of volunteers at baseline

2.2 廣西長壽飲食模式對(duì)志愿者血清代謝物的影響

圖2 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食階段和廣西長壽飲食階段血清樣本代表性的500 MHz1H-NMR 光譜圖。根據(jù)每種代謝物的化學(xué)位移和信號(hào)多樣性，結(jié)合先前文獻(xiàn)[4,19?20]和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB；http://www.hmdb.ca/）鑒定并量化了33 種不同的代謝物。

圖2 志愿者習(xí)慣性飲食階段和廣西長壽飲食階段的代表性CPMG 1H NMR 血清光譜Fig.2 Typical 500 MHz 1H NMR spectra of serum extracts for the volunteer with habitual diet and Guangxi longevity dietary

為了辨析廣西長壽飲食模式對(duì)血清代謝物的影響，對(duì)結(jié)果進(jìn)行了PCA 分析。圖3A 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食前和廣西長壽飲食前的PC1 與PC2 得分圖，經(jīng)過PCA 分析得到了4 個(gè)主成分，R2X=0.596，血清代謝物的分布并未表現(xiàn)出顯著差異。為了凸顯志愿者習(xí)慣性飲食前和廣西長壽飲食前血清代謝物的組間差異，使用OPLS-DA 來可視化代謝物差異。經(jīng)過OPLS-DA 分析，R2Y=0.17，Q2=0.069，同時(shí)，模型CV-ANOVA 測(cè)試得分為P=0.409，因Q2<0.4且P>0.05，故OPLS-DA 模型無效，表明志愿者的習(xí)慣性飲食前期和廣西長壽飲食前期的血清代謝物之間無顯著差異。圖3B 顯示了志愿者習(xí)慣性飲食后和廣西長壽飲食干預(yù)后的PC1 與PC2 得分圖，經(jīng)過PCA 分析得到了5 個(gè)主成分，R2X=0.662，進(jìn)一步使用OPLS-DA 分析來可視化代謝物差異（圖3C）。所得參數(shù)為：R2Y=0.792，Q2=0.603，模型CV-ANOVA測(cè)試得分為P=0.002，因Q2>0.4 且P<0.05，故表明該模型可靠，即該模型對(duì)志愿者的血清代謝物分離有很好的效果。對(duì)此進(jìn)行置換檢驗(yàn)（200 次），以進(jìn)一步評(píng)估模型的穩(wěn)健性，因置換檢驗(yàn)中的R2和Q2值均低于相應(yīng)的原始值，Q2的回歸線具有負(fù)截距（圖3D），該結(jié)果表明構(gòu)建的模型具有良好的擬合性和高可預(yù)測(cè)性，并可用于進(jìn)一步篩選習(xí)慣性飲食后和廣西長壽飲食干預(yù)后志愿者血清的差異性代謝物。

圖3 血清1H NMR 數(shù)據(jù)的多元分析Fig.3 Multivariate data analysis of serum 1H NMR data

2.3 血清差異代謝物的篩選

根據(jù)OPLS-DA 評(píng)分圖中的VIP 值（VIP>1），結(jié)合P<0.05，篩選出明顯不同的代謝物譜，并將其選為潛在的代謝標(biāo)志物，以確定與習(xí)慣性飲食相比，廣西長壽飲食模式對(duì)于血清代謝物的本質(zhì)影響。共有6 種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中，組氨酸、甘油、α-葡萄糖、β-葡萄糖相對(duì)豐度顯著增加，膽堿和乳酸的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）（見表2）。

表2 血清中主要代謝物的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 2 Statistical analysis results of the main metabolite in serum

2.4 糞便短鏈脂肪酸的變化

SCFAs 主要通過腸道微生物發(fā)酵不可消化的碳水化合物產(chǎn)生。已有研究證明SCFAs 的升高對(duì)健康有著諸多裨益，如改善血糖和血脂、降低機(jī)體炎癥等[21]。研究表明，短期的飲食即可迅速改變腸道微生物群的組成和活性，從而影響SCFAs 的產(chǎn)生[22?23]。因此，本研究同步檢測(cè)了糞便SCFAs 的變化，以探究廣西長壽飲食模式對(duì)機(jī)體代謝的影響。結(jié)果表明，志愿者在習(xí)慣性飲食階段的糞便SCFAs 無顯著變化（P?0.05），而在廣西長壽飲食干預(yù)后，乙酸鹽和丁酸鹽有了顯著提高（P<0.05）。比較而言，丙酸鹽、戊酸鹽、異丁酸鹽和異戊酸鹽也有所升高，但是這種趨勢(shì)并不顯著（P?0.05）（見表3）。

表3 糞便SCFAs 的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis results of the main SCFAs in feces

2.5 關(guān)鍵代謝物的聚類分析和性能評(píng)估

為了更好地可視化廣西長壽飲食模式對(duì)所篩選血液代謝標(biāo)志物和有關(guān)糞便SCFAs 的影響，將Euclidean 算法用于距離測(cè)量，結(jié)合Average Linkage 算法進(jìn)行了聚類分析（圖4A）。圖中縱坐標(biāo)代表8 種代謝標(biāo)志物，橫坐標(biāo)代表習(xí)慣性飲食和廣西長壽飲食干預(yù)的志愿者樣本。顏色表示代謝物值，其中紫色最低，紅色最高?？梢钥闯?，與習(xí)慣性飲食相比，在廣西長壽飲食干預(yù)后，8 種代謝標(biāo)志物有著相對(duì)明顯的表達(dá)差異。同時(shí)，采用蒙特卡羅交叉驗(yàn)證（Monte Carlo Cross Validation）和線性支持向量機(jī)（Support Vector Machine）的方法生成ROC 曲線，以進(jìn)一步評(píng)估所篩選的代謝標(biāo)志物差異性（圖4B）。結(jié)果表明，這8 種代謝標(biāo)志物曲線下的面積（area under curve，AUC）分別為：α-葡萄糖=0.7347；β-葡萄糖=0.7245；組氨酸=0.6939；膽堿=0.7500；甘油=0.7194；乳酸=0.6837；乙酸鹽=0.7704；丁酸鹽=0.8469。參考文獻(xiàn)[24?25]的方法，認(rèn)為AUC 值大于0.6 時(shí)，則模型預(yù)測(cè)有效，由圖4B 可知本研究中8 種代謝標(biāo)志物的AUC 值均大于0.6[25?26]，故認(rèn)為上述8 種成分均可用于后續(xù)分析（圖4B）。

圖4 代謝標(biāo)志物的聚類分析及ROC 分析Fig.4 Cluster analysis and ROC analysis of potential biomarkers

2.6 代謝途徑分析

為了解志愿者的代謝物變化是否反映了其代謝途徑的協(xié)同變化，使用MetaboAnalyst 5.0 結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫將血液代謝標(biāo)志物和有顯著變化的糞便SCFAs 分析結(jié)果用于代謝物組富集分析和途徑分析（圖5A 和5B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3 種潛在的代謝途徑可能對(duì)改善機(jī)體健康狀態(tài)有關(guān)鍵作用[24?25,27]。分別為：a.糖酵解/糖異生途徑；b.丙酮酸代謝；c.半乳糖代謝。結(jié)果表明，本飲食模式對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)的影響與不同的代謝途徑有關(guān)，且這些代謝途徑可能在改善機(jī)體健康狀態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 代謝標(biāo)志物路徑富集分析和拓?fù)浞治鯢ig.5 Metabolic marker pathway enrichment analysis and topology analysis

3 討論

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的廣西長壽飲食模式對(duì)小鼠具有良好的抗衰老作用[14?15]。本研究則發(fā)現(xiàn)短期的廣西長壽飲食模式干預(yù)后，志愿者血清代謝物中甘油、組氨酸、α-葡萄糖和β-葡萄糖相對(duì)豐度顯著增加（P<0.05），膽堿和乳酸的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05），同時(shí)，糞便中的乙酸鹽和丁酸鹽含量也顯著上升（P<0.05）。還發(fā)現(xiàn)代謝物的變化與3 條途徑密切相關(guān)。

甘油作為甘油三酯的骨架成分，是連接糖代謝和脂肪酸代謝的關(guān)鍵。研究表明，甘油在體內(nèi)可被轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮進(jìn)入糖酵解過程，為機(jī)體提供能量[28]。本研究發(fā)現(xiàn)在兩周高依從性的飲食干預(yù)之后，志愿者血清甘油的含量略有上升，這或許存在如下原因：廣西長壽飲食模式中富含水果、蔬菜，而肉類含量較少，故總體能量攝入較志愿者習(xí)慣性飲食階段相比較低，從而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪分解增加，引起甘油濃度增加，以參與糖酵解過程。亦有研究證明，甘油含量的升高對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥有著積極作用[29]。故志愿者甘油水平的升高，可能對(duì)調(diào)節(jié)血脂水平發(fā)揮著一定的作用。

已有研究證明組氨酸作為人體必需氨基酸，其血清含量與機(jī)體健康衰老密切相關(guān)[30]。同時(shí)，血液組氨酸濃度已被證明與機(jī)體炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激水平相關(guān)。研究表明，組氨酸可通過與二價(jià)金屬離子螯合，清除羥基自由基和單線態(tài)氧，從而改善機(jī)體的抗氧化水平，組氨酸的抗炎作用則可通過調(diào)控機(jī)體NFkB 通路實(shí)現(xiàn)[31]。組氨酸在體內(nèi)還可通過甲氨基谷氨酸在依賴四氫葉酸的途徑中轉(zhuǎn)化為谷氨酸，故研究表明，葉酸攝入不足會(huì)導(dǎo)致組氨酸的排泄增加，從而引起血液中組氨酸濃度降低[32]。Hefni 等[33]通過對(duì)健康志愿者進(jìn)行富含葉酸的飲食干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)其血液中組氨酸豐度升高。廣西長壽飲食模式中包含高水平的深色蔬菜類、水果類食物，且注重對(duì)豆類食物的攝入，故飲食中葉酸含量相對(duì)較高，飲食干預(yù)后組氨酸的豐度增高可能與此相關(guān)。此外，高水平的組氨酸還被證明可以有效改善胰島素敏感性，對(duì)機(jī)體代謝紊亂起到良好的調(diào)節(jié)作用[34]。因此，本次研究結(jié)束后，志愿者血清代謝物中組氨酸水平的顯著升高，可能對(duì)改善機(jī)體炎癥和健康狀態(tài)，提高機(jī)體抗氧化水平具有重要作用。

志愿者血清中的乳酸水平在本次飲食干預(yù)后有了顯著下降（P<0.05），這可能也是志愿者健康狀態(tài)改善的標(biāo)志。研究證明乳酸水平與胰島素敏感性之間存在著顯著的反比關(guān)系[35]。當(dāng)胰島素敏感性受損時(shí)，會(huì)降低機(jī)體內(nèi)以糖原形式儲(chǔ)存葡萄糖的能力，將攝入的碳水化合物更多的轉(zhuǎn)化為乳酸，從而導(dǎo)致血液中乳酸水平升高[36]。故飲食干預(yù)后乳酸水平的降低和葡萄糖水平的升高可能反映了廣西長壽飲食模式對(duì)胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，Xu 等[37]的研究表明高脂肪飲食會(huì)使血液乳酸水平升高，亦有研究表明低蛋白飲食可以有效降低乳酸水平[38]。在廣西長壽飲食干預(yù)期間，志愿者攝入脂肪和蛋白質(zhì)相比其習(xí)慣性飲食期間較少，這可能與乳酸水平降低有關(guān)。此外，乳酸水平的變化可能對(duì)丙酮酸代謝途徑有著一定的影響。在體內(nèi)，乳酸可通過乳酸脫氫酶生成丙酮酸，用于糖異生過程。且神經(jīng)元代謝所需的能量是由乳酸作為代謝底物轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生的[39]。還有研究表明，機(jī)體衰老會(huì)影響丙酮酸代謝過程，并通過降低檸檬酸循環(huán)中的丙酮酸流量造成乳酸水平的增加[40]。結(jié)合這些報(bào)道分析本研究所得結(jié)果，認(rèn)為飲食干預(yù)后志愿者乳酸水平的下降或許對(duì)調(diào)節(jié)胰島素敏感性，維持機(jī)體健康狀態(tài)，延緩衰老具有積極作用。

飲食干預(yù)后，志愿者血清中的膽堿豐度也有了顯著降低。已有研究證明，膽堿與甘油三酯、血糖等心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)顯著正相關(guān)[41]，還有報(bào)道高水平的血清膽堿濃度也被認(rèn)為與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[42]。Heianza 等[43]的研究表明低熱量飲食干預(yù)會(huì)使志愿者血液中膽堿水平降低，這可能是飲食干預(yù)后志愿者膽堿豐度降低的原因。此外，在機(jī)體內(nèi)，膽堿是生成氧化三甲胺的關(guān)鍵底物，氧化三甲胺被證明是與心血管疾病如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的預(yù)測(cè)因子[44]。Abbasalizad 等[45]的薈萃分析結(jié)果也表明，氧化三甲胺濃度與高血壓風(fēng)險(xiǎn)之間呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)聯(lián)，并與HDL-C 等心血管代謝風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)相關(guān)。故飲食干預(yù)后血清膽堿水平的顯著降低，表明了廣西長壽飲食模式對(duì)降低志愿者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、改善機(jī)體健康狀況密切相關(guān)。

乙酸鹽和丁酸鹽作為代表性的SCFAs，在本次飲食干預(yù)后有了顯著升高（P<0.05）。研究表明，乙酸鹽和丁酸鹽因可以有效防止β細(xì)胞凋亡，使胰島細(xì)胞具抗氧化作用，故在控制糖尿病方面具有積極影響[46]。同時(shí)，丁酸鹽可有效改善機(jī)體血壓狀況，通過下調(diào)膽固醇生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)來改善機(jī)體血脂水平[47]，且在維持腸道上皮細(xì)胞完整性方面也有積極作用[48]。在飲食干預(yù)后，志愿者糞便中乙酸鹽和丁酸鹽水平顯著升高，潛在原因可能是飲食中高水平的谷物、水果和蔬菜有效增加了可降解纖維的細(xì)菌數(shù)量所致[49]。Quercia 等[50]的研究也表明，富含高纖維的飲食模式可有效增加腸道菌群產(chǎn)生的SCFAs，這與本研究結(jié)果一致。因此，廣西長壽飲食干預(yù)后志愿者糞便中乙酸鹽和丁酸鹽的顯著升高可能對(duì)改善血糖，血壓和血脂水平，預(yù)防機(jī)體罹患心血管疾病發(fā)揮重要作用。

Jee 等[51]的研究表明了低水平葡萄糖濃度對(duì)機(jī)體健康的有益作用，本次試驗(yàn)的志愿者血清中的葡萄糖水平有所升高，這種現(xiàn)象或許可以這樣理解：當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí)，免疫細(xì)胞會(huì)優(yōu)先使用糖酵解供能，從而加速機(jī)體糖酵解過程，致使機(jī)體葡萄糖水平降低[52]。適當(dāng)范圍的血清葡萄糖增加可能代表著機(jī)體炎癥狀況的改善。同時(shí)，半乳糖是葡萄糖產(chǎn)生的前體，在體內(nèi)可通過轉(zhuǎn)化為葡萄糖1-磷酸參與葡萄糖代謝過程。研究表明，過量的半乳糖積累會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[53]。因此，血液葡萄糖水平的升高可能與半乳糖代謝途徑相關(guān)。此外，葡萄糖水平的升高也可能與糖酵解/糖異生途徑相關(guān)。乳酸在體內(nèi)參與糖異生途徑可以產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖，糖異生途徑可在機(jī)體血糖水平低時(shí)，通過非糖前體物質(zhì)合成葡萄糖，為大腦等組織提供能量，保證機(jī)體需求，本研究發(fā)現(xiàn)的志愿者機(jī)體乳酸鹽的顯著降低也應(yīng)該能夠?yàn)檫@一判斷提供支持，但要下結(jié)論則仍需要結(jié)合志愿者狀態(tài)進(jìn)行更多的研究。

4 結(jié)論

本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)探究了廣西長壽飲食模式對(duì)志愿者代謝物的影響。結(jié)果表明：與習(xí)慣性飲食相比，廣西長壽飲食模式對(duì)志愿者血清代謝物和糞便SCFAs 有著明顯的改變，經(jīng)過分析共篩選出8 種具有顯著差異的代謝物，分別為組氨酸、甘油、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、乳酸、乙酸鹽和丁酸鹽（P<0.05）。這些差異代謝物主要涉及糖酵解/糖異生途徑、丙酮酸代謝和半乳糖代謝3 條代謝途徑，其含量變化趨勢(shì)從代謝組學(xué)的角度說明了廣西長壽飲食模式可能在一定程度上對(duì)降低炎癥和罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，提高機(jī)體抗氧化能力，延緩衰老進(jìn)程具有積極作用。本研究為通過飲食干預(yù)改善機(jī)體代謝狀況、維持機(jī)體健康狀態(tài)提供了新的策略，也從代謝組學(xué)的角度對(duì)廣西長壽飲食模式益生效果的作用機(jī)制進(jìn)行了一定的闡釋。