徐芳，張海泉，盧春鳳，張振林

（珠海市人民醫(yī)院檢驗科，珠海 519000）

金黃色葡萄球菌是一種普遍存在的人畜共患病病原體，屬革蘭陽性球菌，為院內感染的常見病原菌之一[1]，可引起或誘發(fā)機體多種嚴重感染，如化膿性感染[2]、肺炎[3]、腸炎[4]及感染性心內膜炎[5]等，甚至能導致膿毒血癥的發(fā)生[6]。金黃色葡萄球菌肺炎是最常見的金黃色葡萄球菌介導的疾病之一，且死亡率高。鑒于目前多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株的流行，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株的廣泛存在[7]，使得金黃色葡萄球菌感染的治療變得越來越難。因此，迫切需要對這種病原體造成的疾病的新的治療策略。

醉茄素A（withaferin A，WFA）是南非醉茄的主要生物活性成分之一，具有如抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗腫瘤、抗微生物和促凋亡等廣泛的藥理活性[8-11]。然而，WFA 是否具有抗金黃色葡萄球菌肺炎作用及其具體機制尚不清楚。因此，本研究利用金黃色葡萄球菌肺炎小鼠模型探討WFA對金黃色葡萄球菌肺炎的治療作用及相關機制。

材料與方法

1 動物和菌株

30只C57BL/6小鼠（SPF級，雄性，5～6周齡，體重18～20g）購自珠海百試通生物科技有限公司[SCXK（粵）2020-0051]。小鼠飼養(yǎng)于珠海市人民醫(yī)院動物實驗平臺的溫度（22±2）℃、濕度（60±5）%和12 h/12 h明暗循環(huán)的動物房，5只/籠，每3～5 d 更換籠內墊料1次，自由飲食飲水，適應性飼養(yǎng)5 d后進行實驗。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 主要試劑

WFA（#HY-N2065）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；#HY-Y0320）購自美國MedChemEXpress公司；蘇木精（#H104304）和伊紅（#E196384）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；通用SP檢測試劑盒（#SP0041）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠抗CD177單克隆抗體（#sc-376329）購自美國Santa Cruz公司；DAPI（#D807022）購自上海麥克林生化科技有限公司；FITC標記羊抗小鼠IgG抗體（#BL0901）購自北京百奧萊博科技有限公司；小鼠IFN-γ（#BK0081）、IL-6（#BK0252）、TNF-α（#BK0170）和IL-1β（#BK0095）ELISA試劑盒、兔抗Cleaved Caspase-1抗體（#BS1730）和兔抗凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontain a CARD，ASC）抗體（#BS72573）購自南京巴傲得生物科技有限公司；兔抗含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）抗體（#29125）和HRP偶聯羊抗兔IgG（#L3012）購自美國Signalway antibody公司；BCA蛋白濃度定量分析試劑盒（#LD0174）、兔抗GAPDH抗體（#AF1186）和增強ECL發(fā)光試劑盒（#LD0183）購自廣州賴德生物技術有限公司。

3 動物分組、造模及WFA治療處理

將30只小鼠隨機分為對照組（Con組）、模型組（Model組）及WFA治療組（Model+WFA組），每組10只。用0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，對照組經鼻滴入20 μL生理鹽水，其它兩組均經鼻注入20 μL金黃色葡萄球菌懸液（含菌量為5×106菌落形成單位）[12]。WFA以DMSO助溶，配制成10 mg/mL貯存液，給藥時將貯存液混于生理鹽水，稀釋為200 μg/mL工作液。Model+WFA組小鼠在造模后，每日腹腔注射5 mg/kg WFA ，連續(xù)應用7 d；其余兩組每日注射等量含2% DMSO的無菌生理鹽水，連續(xù)應用7 d。7 d后，麻醉小鼠，打開胸腔，用PBS灌洗支氣管并收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）后，處死小鼠并分離肺。

4 肺組織含水量檢測

取左側肺臟用濾紙吸干表面水分，稱取濕重，然后將其置于烘箱中烘烤72 h至樣本完全脫水，稱取肺臟干重。計算肺組織的濕重與干重比值（wet weight/dry weight，W/D），其比值反映肺組織的含水量，提示肺水腫的程度。

5 蘇木精-伊紅染色

將小鼠右肺組織使用4%的甲醛固定，石蠟包埋，然后切為8 μm厚的連續(xù)切片。選取每組第6層切片行蘇木精- 伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下以40倍物鏡觀察并采集圖像。

6 BALF中細胞計數

BALF以600 r/min離心5 min，將沉淀的細胞懸浮在2 mL PBS中，用細胞計數板對細胞計數。此外，收集上清液以備后續(xù)檢測。

7 BALF中IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β水平檢測

取BALF上清液，根據ELISA試劑盒說明書，對3組大鼠BALF進行IL-1β、IL-6、IL-10以及TNFα測定。

8 免疫組織化學染色

CD177免疫熒光染色：肺組織切片用二甲苯脫蠟和梯度遞減的乙醇復水后，用檸檬酸緩沖液高溫進行抗原修復，用10%羊血清在室溫封閉30 min，然后用中性粒細胞標記物CD177抗體（1:500）在37℃下孵育1 h，PBS洗滌2 min×3次，用FITC標記羊抗小鼠IgG（1:500）在37 ℃下孵育30 min，再次洗滌切片，DAPI（5 μg/mL）染核2 min，并在熒光顯微鏡下以20倍物鏡觀察并采集圖像。CD177陽性細胞數提示中性粒細胞浸潤數量。

NLRP3 SP法染色：根據SP試劑盒說明書，肺組織切片用二甲苯脫蠟和梯度遞減的乙醇復水后，3%H2O2室溫處理10 min，用檸檬酸緩沖液高溫進行抗原修復，用10%正常羊血清在室溫封閉30 min，然后用抗NLRP3抗體（1:400）在37 ℃下孵育1.5 h，PBS洗滌2 min×3次，生物素化羊抗兔IgG（1:400）37℃下孵育30 min，PBS洗滌2 min×3次，用鏈霉親和素過氧化物酶（1:1000）在37 ℃下孵育30 min，PBS洗滌2 min×3次，DAB顯色5 min，蘇木精復染。在光學顯微鏡下以40倍物鏡觀察并采集圖像。

9 Western blot

RIPA裂解液提取小鼠肺臟組織的蛋白并用BCA蛋白濃度定量分析試劑盒定量蛋白濃度。每個樣品取20 μg蛋白加入上樣緩沖液后置于沸水中變性3 min，然后進行10% SDS-PAGE電泳。將電泳分離的蛋白以濕法電轉（電流：200 mA，電轉時間：90 min）至PVDF膜。用5%脫脂牛奶進行非特異性結合位點封閉（室溫30 min），1:1000稀釋的抗NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和1:5000稀釋的抗GAPDH一抗4 ℃分別孵育過夜。以TBST洗滌5 min×3次后，室溫孵育1:1000稀釋的HRP偶聯羊抗兔IgG 1 h，以TBST洗滌5 min×3次后，ECL發(fā)光液中顯影，并利用Chemi Scope 3300 Mini型化學發(fā)光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）采集條帶圖像和分析條帶光密度值。蛋白相對表達水平以目的蛋白條帶光密度值/GAPDH光密度值×100%表示。

10 統計學分析

采用SPSS21.0軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示，用單因素方差分析事后檢驗對組間均數進行兩兩比較，P<0.05認為有統計學意義

結果

1 WFA減輕金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織形態(tài)改變、肺含水量和BALF中細胞數的增加

HE染色觀察顯示，模型組小鼠肺組織出現肺泡壁增厚、肺泡和間質炎性細胞浸潤、出血和肺泡滲出液，而WFA治療組小鼠上述病理表現明顯減輕（圖1A）。對肺組織的W/D比率測定顯示，模型組小鼠W/D比率較對照組明顯增高，而WFA治療組小鼠肺組織W/D比率較模型組明顯下降，但仍高于對照組（圖1B）。對BALF中細胞計數顯示，模型組小鼠BALF中的細胞總數顯著高于對照組，而WFA治療組小鼠BALF中的細胞總數較模型組相比顯著下降，但仍高于對照組（圖1C）。

圖1 WFA對金黃色葡萄球菌肺炎小鼠的肺組織形態(tài)學改變、肺含水量以及BALF中細胞數的影響。A，肺組織HE染色代表性圖像（比例尺，100μm）；B，肺組織W/D比率統計學分析；C，BALF中細胞數量統計學分析。與Con組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與Model組相比，**P<0.01；n=10Fig. 1 Effect of WFA on the histopathological change of lung tissues, lung water content and cell amount in the Staphylococcus aureus pneumonia mice BALF. A, representative images of HE staining of lung tissues (scale bar, 100μm); B, statistical analysis of lung tissue W/D ratios; C, statistical analysis of cell amount in BALF. Compared with Con group: #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001; compared with Model group: **P<0.01; n=10

2 WFA降低金黃色葡萄球菌肺炎小鼠BALF中促炎細胞因子

對3組小鼠BALF中炎癥因子IFN-γ、IL-6、TNFα和IL-1β進行測定，結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠BALF中IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β顯著升高，而與模型組相比，WFA治療組BALF中上述炎癥因子顯著降低，但仍高于對照組（圖2）。

圖2 小鼠BALF中炎癥因子IFN-γ（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）和IL-1β（D）水平的統計學分析。與Con組 相 比，##P<0.01，###P<0.001；與Model組 相 比，*P <0.05, **P<0.01；n=10Fig. 2 Statistical analysis of the level of inflammatory cytokines IFN-γ (A), IL-6(B), TNF-α (C) and IL-1β (D) in mice BALF. Compared with Con group: ##P<0.01, ###P<0.001; compared with Model group: *P <0.05, **P<0.01; n=10

3 WFA減輕金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中性粒細胞浸潤

用中性粒細胞標志物CD177對3組小鼠肺組織中性粒細胞浸潤程度進行檢測。結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中CD177陽性細胞明顯增多，而WFA治療組小鼠CD177陽性細胞較模型組顯著減少，但仍高于對照組（圖3），表明WFA治療組小鼠肺組織中性粒細胞募集受到一定程度的抑制。

圖3 WFA對金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中性粒細胞募集的影響。A，小鼠肺組織中性粒細胞募集的代表性CD177免疫熒光染色檢測（例尺，100 μm）；B，CD177陽性細胞數量統計學分析；與Con組相比，##P<0.01，###P<0.001；與Model組相比，**P<0.01；n=8Fig. 3 Effect of WFA on neutrophil recruitment in the lung tissues of Staphylococcus aureus pneumonia mice. A, representative CD177 immunofluorescence staining of neutrophil recruitment in lung tissues (scale bar, 100 μm); B, statistical analysis of the number of CD177-positive cells in lung tissues; compared with Con group: ##P<0.01, ###P<0.001; compared with Model group: **P<0.01; n=8

4 WFA抑制金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體通路活化

對3組小鼠肺組織NLRP3進行免疫組織化學檢測（NLRP3陽性顯示為棕色顆粒）顯示，對照組僅少量著色且染色淺，模型組呈現大面積NLRP3陽性染色且染色深，而WFA治療組小鼠肺組織中陽性信號較模型組低（圖4A）；Western blot檢測肺組織中NLRP3炎癥小體的主要成員NLRP3、ASC、cleaved caspase-1水平顯示，與模型組相比，WFA治療組小鼠肺組織中NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達水平明顯降低，但仍高于對照組（圖4B—E），說明WFA可抑制金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體激活。

圖4 WFA抑制金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體激活。A，小鼠肺組織NLRP3表達的代表性免疫組織化學檢測（比例尺，100 μm）。B—E，小鼠肺組織中NLRP3、ASC和cleaved Caspase-1水平的Western blot檢測與統計學分析；與Con組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與Model組相比，**P<0.01；n=6Fig. 4 WFA inhibited NLRP3 inflammasome activation in the lung tissues of Staphylococcus aureus pneumonia mice. A, representative immunohistochemical staining of NLRP3 expression in lung tissues (scale bar, 100 μm); B to E, Western blot detection and statistical analysis of the level of NLRP3, ASC and cleaved Caspase-1 in lung tissues; compared with Con group: #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001; compared with Model group: **P<0.01; n=6

討論

金黃色葡萄球菌肺炎屬于肺炎中較重的一種，盡管目前醫(yī)療技術不斷發(fā)展，但其仍具有較高的死亡率和發(fā)病率，抗炎及改善免疫是治療金黃色葡萄球菌肺炎最核心的手段。WFA從藥用植物南非醉茄的葉子、漿果和根莖中分離提取得到的甾體內酯，已被證實具有顯著抗炎和調節(jié)免疫作用[9]。本實驗結果提示WFA對金黃色葡萄球菌肺炎小鼠有很好的抗炎作用并改善金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織病理形態(tài)學改變，提示WFA可能也是潛在的金黃色葡萄球菌肺炎的治療藥物。

肺炎通常伴隨著免疫系統的過度激活，其特征是在肺泡腔中炎性細胞和蛋白質液體增加[13]。肺泡毛細血管屏障急性損傷可使其通透性增加，導致富含蛋白質的滲出性水腫[14]。此外，IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β是多功能細胞因子，在局部和全身水平上參與炎癥和免疫反應[15]。這些促炎細胞因子可導致嚴重的金黃色葡萄球菌肺炎的肺損傷[16]。WFA治療后的金黃色葡萄球菌肺炎小鼠BALF中細胞數目及促炎細胞因子均減少并且肺組織中中性粒細胞浸潤程度減輕，這表明WFA可抑制炎癥免疫反應過度激活。

NLRP3炎癥小體在炎癥和先天免疫中具有重要和突出的作用[17]。已有研究[18-20]表明，金黃色葡萄球菌肺炎的肺組織中伴隨NLRP3炎癥小體的過度激活，且NLRP3炎癥小體的過度激活能加重肺損傷，而減弱NLRP3炎癥小體活性能降低肺損傷。在本研究中，WFA治療后金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體激活受到顯著抑制。

綜上所述，WFA可改善金黃色葡萄球菌肺炎小鼠的癥狀并降低炎癥反應和NLRP3炎癥小體活化。