楊仕坤，連俊波，霍雙杰，倪璐，宋慧茹，溫俊秀，羅丹，李雙，宋旭東，門秀麗，董麗儒

（華北理工大學附屬醫(yī)院，病理科，唐山 063000）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是當今世界上最嚴重的健康問題之一，2015年全球有4.15億糖尿病患者，保守估計到2040年將達到6.42億，然而幾乎一半（49.7%）的糖尿病患者未得到明確診斷。糖尿病肝損傷（diabetic liver injury, DLI）是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一，胰島素抵抗和肝細胞內脂肪聚集是D2TM的重要特征之一。內質網是肝細胞脂質代謝的主要場所，當機體出現高脂血癥和胰島素抵抗時會破壞肝細胞內質網的穩(wěn)態(tài)，誘導內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。嚴重或長時間ERS可以引起其下游凋亡信號如JNK、CHOP及Caspase介導的凋亡路徑持續(xù)激活，最終引起細胞功能受損或凋亡。內質網應激抑制劑?；敲撗跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid, TUDCA）為結合型膽汁酸，是一種由?；撬岷托苋パ跄懰峤M成的共軛膽汁酸，具有解痙、抗炎、抗驚厥及溶石作用[2]。TUDCA在體外和體內均可作為蛋白質折疊的分子伴侶發(fā)揮作用，但關于TUDCA對DLI的影響機制尚不完全清楚[3]。本研究利用瘦素受體（leptin receptor, LEP-R）基因純合缺失突變（db/db）T2DM模型小鼠（db/m即lean小鼠為正常表型小鼠）[4,5]，檢測TUDCA對自發(fā)性T2DM模型小鼠肝細胞損傷的影響及機制，為預防DLI發(fā)生及發(fā)展提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物

SPF級13周齡成年雌性瘦素受體純合缺陷（db/db） T2DM模型小鼠和表型正常的雌性C57BL db/m（lean）小鼠，即（lepr-/m）小鼠各10只（北京美森生物醫(yī)藥科技有限公司，許可證編號：SCXK京2011-0012），體重分別為37～51 g和18～24 g。將兩種小鼠隨機分成溶劑對照組（Vehicle, VEH組）和TUDCA組，每天早、晚8點各給藥1次，劑量為TUDCA 500 mg/kg，連續(xù)灌胃2周，VEH組采用同樣方法給予同等體積生理鹽水。

2 主要試劑

小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（Linco公司）；即用型免疫組織化學二步法試劑盒、山羊超敏二步法試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔源多克隆抗體和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）兔源重組單克隆抗體（杭州華安生物公司）；甘油明膠封片劑和PAS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；油紅O試劑盒（河北瑞帕特生物科技有限公司）；其余試劑均由華北理工大學附屬醫(yī)院病理科提供。

3 體重與生化指標檢測

連續(xù)測量小鼠體重和空腹血糖的變化，14 d后經眼球取血，處死動物，留取血漿。全自動生化分析儀檢測血漿中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC），血糖快速測定儀檢測口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）水平，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定胰島素水平、速率法測定谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）含量。

4 HE染色

各組小鼠的部分肝組織經10%中性甲醛固定后行石蠟包埋與切片、二甲苯脫蠟、下行酒精入水；蘇木素染液染色3 min，流水沖洗后0.7%鹽酸酒精分化液分化2～5 s，充分流水洗后反藍5～10 min；0.5%～1%伊紅染色20 s后，上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡觀察、拍照。

5 油紅O染色

部分肝組織行冰凍切片后行油紅O染色：切片用甲醛固定10min，蒸餾水洗3次，油紅O稀釋液（按油紅飽和液和稀釋液3:2稀釋，靜置10 min）染色15 min，避光，密封。60%異丙醇分色至無色，蒸餾水洗3次；蘇木精復染細胞核，自來水洗反藍3 min，蒸餾水洗，甘油明膠封片，光鏡觀察、拍照。

6 PAS染色

小鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗2 min，再用蒸餾水浸洗 2次，置于氧化劑（高碘酸）中室溫放置5～8 min；自來水沖洗1次，再用蒸餾水浸洗2次，入雪夫試劑中于室溫暗處浸染10～20 min，自來水沖洗10 min；蘇木素復染細胞核1～2 min，酸性分化液分化2～5 s，自來水沖洗10～15 min后，更換雙蒸水，自來水反藍；酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡觀察與拍照。

7 免疫組織化學染色分析

小鼠肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS浸洗3次，每次3 min；EDTA修復液（1:49）加入高壓鍋加熱沸騰2.5 min。滴加適量的內源性過氧化物酶阻斷劑，孵育15 min，PBS浸洗3次×3 min。正常山羊血清室溫孵育15 min，傾去血清；抗GRP78（1:300）和抗CHOP （1:300）一抗（以PBS代替一抗作為陰性對照）4 ℃孵育過夜；常溫復溫30 min后PBS浸洗3 min×3次；生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗3 min×3次；辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min，PBS浸洗3 min×3次；DAB顯色，蘇木素復染后分化反藍，酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。高倍鏡（40倍物鏡）下每張切片隨機選取5個高倍視野，應用Image-Pro plus 6.0軟件對染色陽性物質表達部位和表達量進行圖像分析。

8 統(tǒng)計學方法

應用SPSS23.0分析軟件，所有計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間均數數據比較以單因素方差分析（analysis of variance，One-way ANOVA），兩樣本均數比較以獨立樣本t檢驗處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 TUDCA處理不影響db/db小鼠體重

對各組小鼠體重動態(tài)監(jiān)測14 d顯示：所有db/db小鼠各個時間點的體重均顯著高于lean小鼠；TUDCA處理對db/db小鼠和lean小鼠的體重均無影響（圖1）。

圖1 TUDCA處理對db/db小鼠體重的影響。db/db+VEH 與 lean+VEH比較，*P < 0.05； db/db+TUD 與 lean+TUD 比較，#P < 0.05；n=5Fig.1 Effect of TUDCA treatment on the body weight of db/db mice. *P < 0.05, compared with lean+VEH; #P < 0.05, compared with lean+TUD; n=5

2 TUDCA減輕db/db 小鼠OGTT及血漿ALT和AST水平升高

生化分析檢測顯示，db/db+VEH組小鼠口服葡萄糖后血糖水平顯著升高，且2 h內血糖未能降至口服葡萄糖前的水平；db/db+TUD組小鼠口服葡萄糖后血糖水平升高但不顯著，2 h內血糖恢復至口服葡萄糖前的水平；lean+VEH組及l(fā)ean+TUD組小鼠口服葡萄糖前后血糖僅有輕度變化，兩組差異無統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2 TUDCA處理2周對db/db小鼠OGTT的影響。與 lean+VEH比較，*P<0.05 ；與db/db+TUD 比較，#P<0.05；n=5Fig. 2 Effect of TUDCA treatment for 2 weeks on OGTT of db/db mice . *P<0.05, compared with lean+VEH; #P<0.05, compared with db/db+TUD; n=5

與lean組相比， db/db+VEH組小鼠血清中TC、TG、ALT和 AST水平明顯升高；與db/db+VEH組相比，db/db+TUD組血清TC、TG無明顯差別，但db/db+TUD組血漿ALT及AST水平明顯降低，但仍高于lean+VEH組和lean+TUD組（圖 3）；給藥前后lean組小鼠血清TC、TG、ALT和AST水平無顯著性差異。

圖3 TUDCA處理對db/db小鼠血清TC、TG、ALT和AST水平的影響。與lean+VEH比較，*P<0.05 ；與db/db+TUD 比較，#P<0.05；n=5Fig. 3 Effect of TUDCA treatment for 2 weeks on serum levels of TC, TG, ALT and AST in db/db mice . *P<0.05, compared with lean+VEH; #P<0.05, compared with db/db+TUD; n=5

3 各組小鼠胰島素水平變化

ELISA檢測顯示，db/db+VEH組小鼠胰島素水平較lean+VEH組明顯升高；以TUDCA（500 mg/kg）處理db/db小鼠2周后，其胰島素水平較db/db+VEH組明顯降低，但仍顯著高于lean+VEH組和lean+TUD組（圖4）。lean+TUD組給藥前后胰島素水平無明顯差別。

圖4 TUDCA處理對db/db小鼠胰島素水平的影響。與 lean+VEH比較，*P<0.05；與db/db+TUD 比較，#P<0.05；n=5Fig. 4 Effect of TUDCA treatment for 2 weeks on serum level of insulin in db/db mice. *P<0.05, compared with lean+VEH; #P<0.05, compared with db/db+TUD; n=5

4 TUDCA處理減輕db/db小鼠肝病理變化

HE染色顯示，lean組小鼠肝細胞肝板間隔一致，肝血竇清晰可見；db/db+VEH組肝內可見散在或小灶狀炎細胞浸潤，肝板間隔不等，細胞排列紊亂，肝血竇受壓變窄，肝細胞內可見互相融合的脂滴；給予TUD處理后肝細胞內脂滴減少，部分區(qū)域肝索結構清晰，肝竇間隙明顯（圖5）。

圖5 TUDCA處理對db/db小鼠肝組織病理學影響的HE染色觀察。db/db+VEH組，紅色箭頭示肝細胞脂肪變性，綠色箭頭示肝細胞核腫脹，藍色箭頭示炎細胞浸潤，黃色箭頭示肝血竇受壓變形；db/db+TUD組，紅色箭頭示肝細胞脂肪變性，黃色箭頭示肝血竇可見，腔內含紅細胞，部分肝索排列清晰，黑色箭頭示肝小葉中央靜脈，白色箭頭示肝細胞水腫；比例尺，50 μmFig.5 HE staining observation on the effect of TUDCA treatment on histopathological changes of the db/db mice liver tissues. In the db/db+VEH group, red arrow shows hepatocyte steatosis, green arrow shows hepatocyte nuclei swelling, blue arrow shows inflammatory cell infiltration, yellow arrow shows extruded hepatic blood sinusoids. In the db/db+TUD group, red arrow shows hepatocyte steatosis, yellow arrow shows hepatic blood sinusoid with red blood cells in the lumen, some hepatocyte cords are clearly arranged, black arrow shows central vein of hepatic lobule, white arrow shows hepatocyte edema; scale bar, 50 μm

PAS染色顯示，lean組可見肝細胞局灶性糖原顆粒少量表達，呈紫紅色。與lean+VEH組比較，db/db+VEH組肝細胞胞漿內糖原顆粒明顯增加，胞質呈紫紅顆粒狀著色，并可見核內糖原空洞形成；與db/db+VEH組相比，db/db+TUD組糖原顆粒減少，核內糖原空洞形成減輕（圖6A）。油紅O染色顯示，lean組小鼠肝細胞內可見散在脂滴。與lean+VEH組相比，db/db+VEH組肝細胞胞至內可見大量紅染小脂滴，呈團塊狀或點狀；與db/db+VEH組相比，db/db+TUD組脂滴有所減少，肝細胞脂肪變性減輕（圖6B）。

圖6 TUDCA處理對db/db小鼠肝組織病理學影響的PAS和油紅O染色觀察。A，代表性PAS染色結果，黃色箭頭示肝脂肪變，綠色箭頭示肝細胞腫脹，紅色箭頭示糖原顆粒貯積。B，代表性油紅O染色結果；白色箭頭示均質紅染的脂質貯積團塊，黃色箭頭示肝脂肪變性，核偏位。比例尺，50 μmFig. 6 PAS and Oil Red A staining observation on the effect of TUDCA treatment on histopathological changes of the db/db mice liver tissues. A, representative PAS staining results; yellow arrows show hepatic steatosis, green arrows show hepatocyte swelling, and red arrows show glycogen granule storage. B, representative Oil Red O staining results; white arrows show homogeneous red-stained lipid storage masses and yellow arrows show hepatic steatosis with nuclear deviation. Scale bar, 50 μm

5 TUDCA處理抑制db/db小鼠肝細胞內GRP78和CHOP表達的上調

免疫組織化學染色顯示，lean小鼠肝內有少數細胞GRP78和CHOP陽性。與lean+VEH組相比，db/db+VEH組肝細胞內GRP78和CHOP陽性細胞明顯增多，GRP78和CHOP免疫反應性明顯增強。與db/db+VEH組比較，db/db+TUD組肝細胞GRP78和CHOP免疫反應性明顯減弱，但仍強于lean+VEH組和lean+TUD組（圖7A、B）。

圖7 A-B TUDCA處理對db/db小鼠肝細胞內GRP78及CHOP表達影響的免疫組織化學檢測。A，GRP78免疫反應性代表性免疫組織化學染色結果與統(tǒng)計學分析；B，CHOP免疫反應性代表性免疫組織化學染色結果與統(tǒng)計學分析；比例尺，20 μm；**P<0.01；n=5Fig. 7 Immunohistochemical examination of GRP78 and CHOP expression in the hepatic tissue of the db/db mice. A, representative immunohistochemical staining results and statistical analysis of GRP78 immunoreactivity; B, representative immunohistochemical staining results and statistical analysis of CHOP; scale bar, 20 μm; **P<0.01; n=5

討論

在2型糖尿病所致肝損傷中，超過90%的T2DM肥胖患者與非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）密切相關。NAFLD以胰島素抵抗和肝臟脂肪聚集為特征[6]。內質網是肝細胞脂質代謝的主要場所，當機體出現如高血糖、高脂血癥和胰島素抵抗時，肝細胞內質網的穩(wěn)態(tài)會被破壞，導致細胞器內質網中錯誤折疊的蛋白質或未折疊的蛋白質增加誘發(fā)ERS。短暫激活ERS具有保護作用，長期激活則會破壞內質網穩(wěn)態(tài)，從而導致肝功能障礙和肝臟疾病的發(fā)生[7]。DLI發(fā)病的機制復雜，涉及遺傳因素、環(huán)境因素和代謝因素等，但主要包括胰島素抵抗、肝細胞損傷及游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)的增加，這些因素都可導致細胞內內質網等細胞器功能受損并影響DLI的發(fā)生與發(fā)展。

大量證據表明內質網應激與胰島素抵抗、脂質沉積和與FFA升高密切相關。慢性高脂血癥和高血糖可導致內質網穩(wěn)態(tài)的紊亂，引起不可逆的未折疊蛋白反應（unfolded protein in response，UPR）激活和細胞死亡，表現為胰島素抵抗或衰竭、脂肪變性、炎癥反應、脂質合成障礙等。因此，內質網應激反應和UPR信號通路可能在DLI發(fā)病機制中起著重要作用。DLI時肝細胞內可出現糖原貯積，肝小葉匯管區(qū)炎細胞的浸潤及肝細胞的脂肪變性甚至纖維化等。TUDCA能作為蛋白質折疊的分子伴侶改善膽汁纖維化、視網膜變性、帕金森病和葡萄糖功能障礙等病變[8-11]。TUDCA通過調節(jié)內質網的功能及穩(wěn)定蛋白構象增強內質網對蛋白折疊的處理能力，減少蛋白質翻譯及促進錯誤蛋白降解，對內質網的應激造成的損傷發(fā)揮保護作用[12]。本研究擬通過TUDCA對自發(fā)性T2DM小鼠模型進行藥物干預，檢測血漿中相關的生化指標、ERS標志物及肝細胞脂質貯積情況，探討T2DM肝細胞損傷引起脂肪變的可能機制。

糖利用障礙引起血中游離脂肪酸FFA的增加不僅干擾胰島素信號系統(tǒng)導致脂肪肝形成，還能增加肝細胞對氧化應激及炎癥反應敏感性，使細胞器受損[13,14]。FFA超過肝臟自我合成脂蛋白的能力，使大量脂肪酸蓄積引起脂肪變性，出現大量脂滴形成，由于高糖狀態(tài)，糖原貯積過多，導致肝糖原貯積增加，這也在本實驗中得到了證實[13]。OGTT實驗和胰島素耐量實驗是檢查胰島素敏感性的有效方法。db/db+VEH組小鼠口服葡萄糖后血糖水平顯著升高，且2 h內血糖未能降至口服葡萄糖前的水平，但胰島素水平顯著升高；db/db+TUD組小鼠口服葡萄糖后血糖水平升高但不顯著，2 h內血糖恢復至口服葡萄糖前的水平，相比于db/db+VEH組小鼠，db/db+TUD組胰島素水平顯示顯著下降，TUDCA表現出能有效降低血糖和改善胰島素敏感性的功能。db/db+VEH組小鼠HE染色及油紅O染色發(fā)現肝細胞胞質內可見大量小脂滴，呈團塊狀或點狀；PAS染色發(fā)現肝細胞胞質內糖原顆粒明顯增加，并可見核內糖原空洞形成，而經過TUDCA處理后的db/db小鼠肝臟脂滴沉積、炎細胞浸潤、糖原空洞形減少及肝細胞損傷減輕，血清TC、TG、AST及ALT下調。研究結果說明TUDCA作為一種分子伴侶，不僅能緩解ERS，還能改善胰島素敏感性，降低血糖水平，減輕高血糖對肝臟內質網的損傷。由此我們推測DLI形成的原因可能與脂代謝障礙、胰島素抵抗、肥胖及肝糖原貯積有關。

GRP78是熱休克蛋白70（HSP70）家族的成員之一，它主要存在于真核細胞的ER膜上[15]。GRP78的功能是作為分子伴侶，它與錯誤折疊的蛋白質和未裝配的復合物結合，并啟動UPR調節(jié)和ERAD降解。CHOP主要介導細胞凋亡。在ERS狀態(tài)下，GRP78和CHOP的表達則明顯上調[15,16]。糖尿病大鼠模型證實肝細胞中GRP78和CHOP表達的均上調[17,18]。在本研究免疫組織化學檢測中，db/db+VEH組肝細胞內GRP78及CHOP免疫反應性明顯增強，說明db/db小鼠出現高血糖能增加小鼠肝臟負荷，導致肝細胞功能受損，脂質貯積增加，FFA升高，加重肝細胞ERS，激活GRP78分解并啟動UPR和激活ERAD；GRP78解離后又可促進eIF2α自身磷酸化激活間接誘導CHOP持續(xù)表達，從而導致肝細胞受損[19]。經過TUDCA處理后肝細胞損傷減輕，GRP78和CHOP表達上調明顯抑制，由此提示TUDCA減輕自發(fā)性T2DM模型小鼠肝細胞損傷其機制可能與抑制內質網應激有關。

綜上所述，本研究證明TUDCA能緩解和改善DLI，其主要機制可能是作為蛋白質折疊分子伴侶的TUDCA能減輕2型糖尿病導致的ERS反應，通過下調GRP78及CHOP表達來改善胰島素分泌，調節(jié)肝臟脂質代謝緩解DLI。內質網應激通路抑制劑TUDCA可能成為治療DLI的新途徑，從而達到預防DLI發(fā)生及發(fā)展的目的。