劉東生，高成業(yè)，張寶書，翟菊敏，李廣鑫

（邯鄲市第一醫(yī)院普外五科，河北 邯鄲 056002）

原發(fā)性肝癌（HCC）是指發(fā)生于機(jī)體肝臟內(nèi)的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者超過60萬人，其發(fā)病率排惡性腫瘤的第5位，死亡率排第3，僅次于胃癌和食道癌[1,2]。臨床上針對(duì)HCC的治療，一般采用手術(shù)與放化療相結(jié)合的方法。雖然目前針對(duì)HCC的多種手術(shù)和化療等治療手段在不斷提高，但因?yàn)镠CC具有侵襲性強(qiáng)、生長快和易轉(zhuǎn)移等臨床特性，臨床HCC的治愈率及治療效果仍然不佳[3]。并且，因?yàn)榕R床上治療HCC的化療藥不多、選擇面單一，長期單一化療藥物的臨床使用往往導(dǎo)致患者耐藥性的發(fā)生，從而使患者預(yù)后不佳。故而，繼續(xù)開發(fā)新的HCC治療藥物和尋找新的HCC治療靶點(diǎn)仍然是臨床上HCC治療亟待解決的問題。

近年來，中醫(yī)中藥在腫瘤疾病治療方面的研究已經(jīng)日趨廣泛，相比于傳統(tǒng)的化療藥物，中藥及其提取物可以作用于腫瘤細(xì)胞生長的各個(gè)階段，具有靶點(diǎn)多、副作用小及抗耐藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)[4,5]。目前，已經(jīng)有許多中藥及其提取物在抗肝癌方面的研究[6]。研究表明蟾毒靈可通過干預(yù)不同信號(hào)途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]；姜黃素衍生物C086和苦參堿可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]；小檗堿可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移等[9]。七葉皂苷是一種天然植物藥，七葉皂苷鈉（AS）是經(jīng)七葉樹科植物成熟種子提取得到的皂苷鈉鹽，具有抗炎、抗腫瘤作用[10]。之前的研究表明七葉皂苷鈉可通過激活細(xì)胞內(nèi)CARMA3/NF-B信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖[11]。但是有關(guān)七葉皂苷鈉的體內(nèi)抗肝癌作用及其對(duì)肝癌細(xì)胞中氧化應(yīng)激調(diào)控的作用機(jī)制仍然不清楚。

本研究以HepG2肝癌細(xì)胞為體外載體，Nude無胸腺裸鼠為體內(nèi)載體，探究了七葉皂苷鈉對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和體內(nèi)成瘤的調(diào)控作用，并進(jìn)一步探究其中的潛在作用機(jī)制。

1 材料方法

1.1 材料

動(dòng)物40只SPF級(jí)Nude無胸腺裸鼠（18.2±0.5）g購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（浙）2021-0040。

試劑 七葉皂苷鈉（E1378）、二甲基亞砜（D5879）（DMSO，純度≥98%）購自美國Sigma公司。450 Y-P（HY-P0175）購自美國MCE公司。胎牛血清（10100147）和DMEM培養(yǎng)基（A4192101）購自美國Gibco公司；甲醇（AR，純度≥99%）（M116115）、乙醇（AR，純度≥99%）（E298791）和吐溫20（Tween 20）（T274277）購自上海阿拉丁試劑有限公司。LDH試劑盒（A020-2-2）、活性氧（ROS）（E004-1-1）、丙二醛（MAD）（A003-1-2）、超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3-2）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）（A005-1-2）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

儀器CX23光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；生物安全柜（蘇州云凈公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) 40只Nude無胸腺裸鼠被隨機(jī)分為4組（n=10）：模型組（Model）、七葉皂苷鈉低劑量組、七葉皂苷鈉中劑量組及七葉皂苷鈉高劑量組。將5 106個(gè)人肝癌細(xì)胞株HepG2消化、離心，溶于0.1 mL DMEM培養(yǎng)基中，皮下接種無胸腺裸鼠4周，建立腫瘤模型。隨后，Model組腹腔注射生理鹽水，低、中、高劑量七葉皂苷鈉組分別腹腔注射1 mg/kg、2.5 mg/kg及5mg/kg的七葉皂苷鈉。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的恒溫恒濕環(huán)境，孵育在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.3 CCK8法檢測七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活力影響 1 104個(gè)人肝癌細(xì)胞HepG2接種在96孔板中（n=6），共36孔，用不同濃度的七葉皂苷鈉（0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL）處理HepG2細(xì)胞24 h，并在收樣前1 h每孔加入10L的CCK8溶液，并繼續(xù)于37℃孵育1 h，孵育結(jié)束后，震蕩30 s，再用酶標(biāo)儀在490 nm處測量每孔的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞中LDH釋放影響 為了檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，將1 104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中。用不同濃度的七葉皂苷鈉（0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL）處理HepG2細(xì)胞24 h。孵育結(jié)束后將細(xì)胞培養(yǎng)基收集到試管中并在4℃、12 000 r/min離心15 min。收集上清液并儲(chǔ)存在 20℃中。使用LDH標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測HepG2細(xì)胞中LDH的釋放。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 對(duì)七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠肝臟及HepG2細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR基因表達(dá)影響1 105個(gè)HepG2細(xì)胞接種在12孔板中，使用0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL濃度梯度的七葉皂苷鈉處理HepG2細(xì)胞24 h。隨后用預(yù)冷的PBS洗滌處理細(xì)胞3次。細(xì)胞內(nèi)總RNA使用RNAiso Plus試劑盒按照說明書提取。用1 000 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用ABI Prism Step One Plus檢測系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，檢測Nude無胸腺裸鼠肝臟及HepG2細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR基因的表達(dá)量。引物由南京擎科生物公司合成，見表1。

表1 人源引物序列Table 1 primer sequences of homo

表2 鼠源引物序列Table 2 primer sequences of mouse

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)作圖以均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）形式表現(xiàn)，使用SPSS（22.0版本）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖片制作。使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，*P＜0.05，#P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01，##P＜0.01表示差異極顯著，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)最少3次。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)成瘤的影響

七葉皂苷是一種天然植物藥，七葉皂苷鈉（AS）是由七葉樹科植物種子提取得到的皂苷鈉鹽。為探究七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)成瘤的影響，通過對(duì)Nude無胸腺裸鼠皮下接種人肝癌細(xì)胞HepG2建立Nude無胸腺裸鼠皮下腫瘤模型；通過腹腔注射1 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的七葉皂苷鈉探究七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。結(jié)果如表1所示，與模型組相比，七葉皂苷鈉處理組顯著降低Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)瘤重及增加Nude無胸腺裸鼠體重（P＜0.05），且2.5 mg/kg的七葉皂苷鈉治療組有最好的治療效果。以上結(jié)果表明，七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)成瘤有顯著抑制作用。

表3 不同濃度的七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠體內(nèi)成瘤的影響（n=10）Table 3 Effects of different concentrations of AS on tumorigenesis in mice(n=10)

2.2 七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠肝臟內(nèi)PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是機(jī)體在生長、代謝過程中發(fā)揮重要功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在機(jī)體的各個(gè)生命活動(dòng)中都發(fā)揮重要作用，尤其是在腫瘤信號(hào)的傳導(dǎo)過程中。為探究七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠肝臟內(nèi)PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響，我們在處死Nude無胸腺裸鼠后，分離小鼠的肝臟并提取肝臟中的總RNA，通過熒光定量PCR法探究七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠肝臟內(nèi)PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響。結(jié)果見圖1，七葉皂苷鈉顯著降低了Nude無胸腺裸鼠肝臟內(nèi)PI3K/AKT/mTOR通路基因的表達(dá)（P＜0.05）。且2.5 mg/kg的七葉皂苷鈉給藥組與5 mg/kg的七葉皂苷鈉給藥組有相似的基因表達(dá)，進(jìn)一步證明了2.5 mg/kg的七葉皂苷鈉可能是治療Nude無胸腺裸鼠皮下腫瘤的最佳藥物濃度。

圖1 不同濃度的七葉皂苷鈉對(duì)Nude無胸腺裸鼠肝臟內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different concentration of AS on gene expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in mice

2.3 七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞活力的影響

為探究七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞活力的影響，用0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL濃度的七葉皂苷鈉處理HepG2細(xì)胞24 h，隨后用CCK8法測定細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響呈濃度依賴性，20～50g/mL的七葉皂苷鈉處理顯著降低了HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖2A），增加HepG2細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）釋放（圖2B）。應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算得七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制率（IC50）為29.08g/mL。以上述結(jié)果表明，七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活力均有明顯抑制作用（P＜0.05），且呈濃度依賴性。依據(jù)CCK8及LDH試驗(yàn)的濃度篩選，0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL濃度的七葉皂苷鈉被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentration AS on the cell viability of HepG2 cells

2.4 七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2氧化損傷的影響

氧化損傷是指機(jī)體內(nèi)活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產(chǎn)生過多，機(jī)體無法及時(shí)清除而引起機(jī)體中蛋白質(zhì)產(chǎn)生損傷的現(xiàn)象。依據(jù)CCK8及LDH對(duì)七葉皂苷鈉藥物的濃度篩選的試驗(yàn)結(jié)果，0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL濃度的七葉皂苷鈉被用于測試七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2氧化損傷的影響，結(jié)果表明七葉皂苷鈉顯著誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生氧化損傷，表現(xiàn)為HepG2細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）水平及超氧化物歧化酶（SOD）水平顯著下降，而HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平及丙二醛（MAD）水平顯著上升P＜0.05，且呈濃度依賴性。以上結(jié)果表明七葉皂苷鈉誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生氧化損傷。

圖3 不同濃度的七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中氧化損傷的影響Fig.3 Effect of oxidative damage of different concentration AS on HepG2 cells

2.5 七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響

為七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響，通過抽取HepG2細(xì)胞中的總RNA，并用熒光定量PCR的方法檢測了七葉皂苷鈉處理下，HepG2細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)的表達(dá)量。結(jié)果如圖4所示，相比Control組，七葉皂苷鈉處理組呈濃度依賴性的下調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt及mTOR基因的表達(dá)量（P＜0.05）。綜上所述，以上結(jié)果表明七葉皂苷鈉處理抑制人肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)。

圖4 不同濃度的七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響（n=5）Fig.4 Effects of AS on the gene expression ofPI3K/AKT/mTOR signal pathway in HepG2 cells(n=5)

2.6 740Y-P對(duì)HepG2細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響

740 Y-P是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的一種特異性小分子激活劑。740 Y-P被用來探究PI3K/Akt/m TOR信號(hào)通路在七葉皂苷鈉誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2氧化損傷及凋亡中的具體作用。結(jié)果如圖5所示，與Control組相比，20g/mL的七葉皂苷鈉處理顯著降低人肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路基因的表達(dá)（P＜0.05），表現(xiàn)為HepG2細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt及mTOR基因的表達(dá)量顯著下降；與20g/mL的七葉皂苷鈉組相比，740Y-P+七葉皂苷鈉處理組能顯著上調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路基因的表達(dá)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，740Y-P處理重新激活了HepG2細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。

圖5 激活劑740 Y-P對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響（n=5）Fig.5 Effects of 740 Y-P on the gene expression of PI3K/AKT/mTOR signal pathway in HepG2 cells(n=5)

2.7 PI3K/AKT/mTOR通路在七葉皂苷鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷中的作用

進(jìn)一步，我們測試了利用740 Y-P重新激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路時(shí)，HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化因子表達(dá)的情況。結(jié)果如圖6所示，與Control組相比，20g/mL的七葉皂苷鈉處理顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MAD表達(dá)水平（P＜0.05），下調(diào)細(xì)胞內(nèi)SOD水平及GSH-px表達(dá)水平。而在使用740Y-P激活劑重新激活HepG2細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路后，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MAD的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且細(xì)胞內(nèi)SOD及GSH-px的表達(dá)水平表現(xiàn)了相同的作用趨勢。綜上所述，以上結(jié)果表明，激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路降低七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷。

圖6 激活劑740 Y-P對(duì)HepG2細(xì)胞中氧化損傷的影響Fig.6 Effects of 740 Y-P on the oxidative damage in HepG2 cells

3 討論

HCC是發(fā)生在消化系統(tǒng)中的最常見的惡性腫瘤之一，HCC的病因復(fù)雜，具有侵襲性強(qiáng)、生長快、易轉(zhuǎn)移等臨床特性[1]。因?yàn)镠CC的化療藥選擇面窄，且長期單一化療藥物的臨床使用往往導(dǎo)致患者耐藥性的發(fā)生，致使患者HCC的治愈率及治療效果不佳。本研究以HepG2肝癌細(xì)胞為體外研究載體，Nude無胸腺裸鼠為體內(nèi)研究載體，探究了七葉皂苷鈉對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和體內(nèi)成瘤的調(diào)控作用，并進(jìn)一步探究了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在其中的具體作用。

Nude無胸腺裸鼠是查爾斯河實(shí)驗(yàn)室在1985年通過BALB/cABom-nu和BALB/cAnNCrj-nu進(jìn)行雜交和回交從而獲得的，因?yàn)槠涮焐拿庖呷毕荩识１挥糜诮⒛[瘤模型[12]。我們的研究結(jié)果表明，將5 106個(gè)人肝癌細(xì)胞株HepG2接種在Nude無胸腺裸鼠皮下4周后，小鼠顯著成瘤，而在經(jīng)過1 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的七葉皂苷鈉治療后，小鼠腫瘤重量顯著降低，并且2.5 mg/kg的七葉皂苷鈉抗腫瘤效果最佳，從體內(nèi)驗(yàn)證了七葉皂苷鈉的體外抗腫瘤效果。肝癌細(xì)胞HepG2來源于一名15歲的高加索白人男性肝癌標(biāo)本，于1979年由knowles等[13]人建立，是肝癌體外研究中常用的細(xì)胞模型。我們的結(jié)果表明七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活力有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性（圖2），并且七葉皂苷鈉還呈濃度依賴性地誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了七葉皂苷鈉的體外抗腫瘤效果。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞的增殖、代謝過程中發(fā)揮重要作用，并且其在腫瘤信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中同樣發(fā)揮重要作用[14]。之前的研究表明有多種中藥的抗腫瘤靶點(diǎn)是與機(jī)體PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控相關(guān)的，如華良姜素能通過影響細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路基因表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞的增殖，樺木酸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡[15,16]。HepG2細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)的基因未發(fā)生突變，所以可用于研究PI3K/AKT/mTOR通路與肝細(xì)胞癌之間的密切關(guān)系。結(jié)果表明七葉皂苷鈉下調(diào)了Nude無胸腺裸鼠肝臟及HepG2細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR基因的表達(dá)。而在使用PI3K/AKT/mTOR通路的特異性激活劑后，七葉皂苷鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的氧化損傷作用被抑制，PI3K/AKT/mTOR通路在七葉皂苷鈉對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和體內(nèi)成瘤的調(diào)控作用中起關(guān)鍵作用，并且可能是原發(fā)性肝癌的中藥靶點(diǎn)之一。

綜上所述，七葉皂苷鈉能誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞的氧化損傷，并且抑制由HepG2細(xì)胞接種的體內(nèi)成瘤，其可能是通過調(diào)控機(jī)體內(nèi)的PI3K/AKT/mTOR通路來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果表明七葉皂苷鈉對(duì)原發(fā)性肝癌有抑制作用，其有潛力成為一種協(xié)同輔助治療藥物來應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的治療。