李昆諭，劉玉芳，陶林，江炎庭，歐陽依娜，儲明星※，洪瓊花※

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056001；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

山羊（Capra hircus）作為人類最早馴養(yǎng)的動物之一，有著10 000多年的馴養(yǎng)歷史，在人類農(nóng)業(yè)文明和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要的作用，為人類提供肉、奶、皮和毛等生活資料[1]。山羊繁殖性狀是一個(gè)復(fù)雜的性狀，受到多種因素的影響，且繁殖性狀遺傳力較低（0.1左右），是一種微效多基因控制的閾性狀[2]。由于山羊世代間隔較長，運(yùn)用傳統(tǒng)育種手段很難達(dá)到快速提高產(chǎn)羔數(shù)的目的[3]。目前影響山羊多羔的主效基因尚未被發(fā)現(xiàn)，為了加快山羊育種工作的進(jìn)程，尋找影響山羊產(chǎn)羔性狀的主效基因勢在必行?；?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀的影響很大，主要表現(xiàn)在對母羊排卵數(shù)的影響上，而影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主要因素之一就是母羊的排卵數(shù)。不同基因?qū)π玛惔x、生理途徑和表型表達(dá)的影響是不同的，具有不同的協(xié)同或拮抗作用。因此，研究影響山羊產(chǎn)羔性狀的候選基因并確定引起性狀變異的原因是至關(guān)重要的。山羊育種改良的研究主要集中于繁殖性狀的重要候選基因上，選擇這些基因的有利等位基因可能有助于高產(chǎn)育種群體的建立，對山羊的選育工作有持續(xù)深遠(yuǎn)的影響。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B）是一種編碼哺乳動物胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化所必需的從頭甲基化酶，DNMT3B定位于山羊第13號染色體，CDS區(qū)由22個(gè)外顯子組成，是DNMT家族中的一個(gè)重要成員[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道DNMT3B功能是特異性地參與重復(fù)DNA序列中CpG二核苷酸的甲基化[5]。DNMT3B存在于真核細(xì)胞染色體的中心衛(wèi)星部分，雖然DNMT3B的主要功能是從頭甲基化，但它也有維持甲基化的作用，DNMT3B也參與了卵母細(xì)胞的發(fā)育和卵子的排出等過程[5]。DNMT3B參與了動物生殖細(xì)胞的發(fā)育，在動物早期胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著一定的作用[4,6,7]。

KHDRBS2定位于山羊第23號染色體上，擁有9個(gè)外顯子。KHDRBS2屬于KHDRBS家族中的一員，是一種RNA結(jié)合蛋白，KHDRBS家族屬于一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及RNA激活超家族，此超家族成員與hnRNP K有同源結(jié)構(gòu)域即KH結(jié)構(gòu)域，均屬于核糖蛋白并在進(jìn)化上高度保守[8]。Salehian-Dehkordi H等[9]研究表明，KHDRBS2的拷貝數(shù)變異（CNV）與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。本研究的候選基因來自實(shí)驗(yàn)室前期基于重測序數(shù)據(jù)，通過GWAS分析（顯著性閾值為0.05）所得在云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊?yàn)槟副尽⑴壬窖驗(yàn)楦副九嘤傻奈覈谝粋€(gè)肉用黑山羊品種[10,11]）全基因組中的正選擇基因（positively selected genes,PSG）發(fā)現(xiàn)，DNMT3B和KHDRBS2共有6個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中DNMT3B為g.61480806G＞A、g.61491787C＞T，KHDRBS2為g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C。我們采用了MassARRAY SNP分型技術(shù)，在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中對候選基因的基因型進(jìn)行檢測，分析其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)性，以期能夠?yàn)樯窖虻母叻敝沉π誀钸x育工作提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)共采集768只山羊（2～5歲）的血液，其中云上黑山羊544只、濟(jì)寧青山羊133只、遼寧絨山羊91只。本實(shí)驗(yàn)將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體（平均產(chǎn)羔率283%），遼寧絨山羊視為低繁殖力群體（平均產(chǎn)羔率115%）[10,11]。所有試驗(yàn)用山羊飼養(yǎng)條件環(huán)境一致，云上黑山羊擁有至少1胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20℃保存。

1.2 血液DNA的提取

試驗(yàn)樣本使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

表1 被測山羊品種及個(gè)體數(shù)量信息Table 1 Information on the breeds of goats tested and the number of individuals

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAY SNP分型技術(shù)對DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢測，相關(guān)引物信息見表2，分型所用樣品為先前提取的基因組DNA，每個(gè)樣品需要量為20uL，DNA濃度為40～80 ng/uL。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primer

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel軟件統(tǒng)計(jì)山羊DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用IBMSPSS Statistics 25軟件中的一般線性模型，多重比較采用LSD法，對云上黑山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNMT3B多態(tài)性分析

利用Sequenom MassARRAY SNP對768只山羊血液DNA進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，DNMT3B g.61480806G＞A和g.61491787C＞T位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中均存在多態(tài)性，其中g(shù).61480806G＞A位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA，g.61491787C＞T位點(diǎn)基因型為CT、TT（圖1）。

圖1 DNMT3B基因位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.1 Results of DNMT3B gene locus typing

對濟(jì)寧青山羊（高繁）和遼寧絨山羊（低繁）山羊品種中DNMT3B 2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（見表3），其中，DNMT3B g.61491787C＞T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；g.61491787C＞T位點(diǎn)在高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢基因型為TT，優(yōu)勢等位基因?yàn)門。

表3 DNMT3B和KHDRBS2 6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在高繁、低繁山羊品種中的基因型和等位基因頻率Table 3 Genotypes and allele frequencies of 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in high-and low-reproduction goats breeds

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，DNMT3Bg.61480806G＞A位點(diǎn)在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；DNMT3B g.61491787C＞T在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，DNMT3B兩個(gè)SNPs位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）（表4）。

2.2 KHDRBS2多態(tài)性分析

對KHDRBS2進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示KHDRBS2 4個(gè)候選位點(diǎn)（g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C）在3個(gè)山羊群體中均存在多態(tài)性（圖2）。其中，KHDRBS2 g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C 3個(gè)位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中存在3種基因型，g.47872502C＞T位點(diǎn)只在云上黑山羊中存在多態(tài)性（見表4）。

圖2 KHDRBS2位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.2 The results of KHDRBS2 locus typing

如表3所示，KHDRBS2 g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但g.48610246G＞C位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異不顯著（P＞0.05）。其中，g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為CC，優(yōu)勢等位基因均為C；g.48610246G＞C位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為GG，優(yōu)勢等位基因均為G。

由表4可知，KHDRBS2 g.48441364C＞T位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），KHDRBS2 g.47872502C＞T、g.48441325T＞C和g.48610246G＞C位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。卡方檢驗(yàn)表明，KHDRBS2g.48610246G＞C位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T 3個(gè)位點(diǎn)在云上黑山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表4 DNMT3B和KHDRBS2 6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在不同山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 4 Population genetic analysis for 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in different goat breeds

2.3 候選SNPs位點(diǎn)與云上黑山羊繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

DNMT3B g.61491787C＞T位點(diǎn)TC型個(gè)體的初生窩重和斷奶窩重顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05）；KHDRBS2 g.47872502C＞T位點(diǎn)CC型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型個(gè)體（P＜0.05），g.48441364C＞T位點(diǎn)CC型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型和TT型個(gè)體（P＜0.05）。其余位點(diǎn)多態(tài)性與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重?zé)o顯著相關(guān)（P＞0.05）（表5）。

表5 DNMT3B和KHDRBS2對云上黑山羊繁殖性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 5 The influence of DNMT3B and KHDRBS2 on the reproduction performance of Yun shang black goats(mean±standard error)

3 討論

3.1 DNMT3B與生殖性狀的關(guān)系

DNMT3B是哺乳動物發(fā)育所必需的一種甲基化酶，參與動物生理活動的多個(gè)方面，有研究表明DNMT3B的缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎的死亡[12-14]。DNMT3B在哺乳動物的繁殖發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中需要DNMT3B進(jìn)行甲基化調(diào)控，以保證卵子正常排出[15,16]?，F(xiàn)階段關(guān)于DNMT3B基因多態(tài)性與山羊繁殖關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3B g.61480806G＞A位點(diǎn)在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），說明這個(gè)群體有較大的遺傳變異程度和較豐富的遺傳多樣性，該位點(diǎn)依然具有可觀的選擇潛能。DNMT3B g.61491787C＞T位點(diǎn)TC型初生窩重和斷奶窩重顯著高于TT型。DNMT3Bg.61491787C＞T位點(diǎn)或可作為云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重選擇的一個(gè)潛在分子標(biāo)記。

3.2 KHDRBS2基因與生殖性狀的關(guān)系

KHDRBS2作為KHDRBS家族蛋白的一員，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA選擇性剪接等多種生物學(xué)進(jìn)程，不僅如此，KHDRBS家族蛋白作為RBP在神經(jīng)突觸功能聯(lián)系、精子發(fā)生、脂肪細(xì)胞分化調(diào)控等一些重要的過程中發(fā)揮一定的作用[17,18]。與其他RNA結(jié)合蛋白類似，KHDRBS家族蛋白在細(xì)胞信號通路中扮演著調(diào)節(jié)點(diǎn)的作用，細(xì)胞內(nèi)外的信號調(diào)控各種激酶對KHDRBS家族蛋白的翻譯后修飾以及KHDRBS家族蛋白與靶標(biāo)RNA的結(jié)合，三者間的動態(tài)平衡對下游基因的表達(dá)有重要影響[19,20]。目前，關(guān)于KHDRBS2與山羊繁殖性狀之間關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，KHDRBS2 g.48441364C＞T位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），說明該基因在多個(gè)群體中有較大的遺傳變異程度和較豐富的遺傳多樣性。KHDRBS2 g.47872502C＞T位點(diǎn)CC型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)高于CT型個(gè)體0.278只，g.48441364 C＞T位點(diǎn)CC型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)分別高于CT型和TT型個(gè)體0.114只和0.12只。KHDRBS2 g.47872502 C＞T和g.48441364C＞T這兩個(gè)突變導(dǎo)致了云上黑山羊產(chǎn)羔性狀表型的變化，可見其對于云上黑山羊母羊的繁殖力是有一定的影響的。因此，KHDRBS2g.47872502C＞T和g.48441364C＞T兩個(gè)位點(diǎn)或可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

綜上所述，DNMT3Bg.61491787C＞T位點(diǎn)與云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊窩重的選擇。KHDRBS2 g.47872502C＞T和g.48441364C＞T位點(diǎn)與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。