肖玉軍 孔令家 黃中華 楊 梅 唐莉靜 柳成益

（攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川攀枝花 617001）

側(cè)耳屬真菌分布非常廣泛，是世界上主要人工栽培的食用菌之一，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。泡囊側(cè)耳Pleurotus cystidiosus，又名鮑魚菇、臺(tái)灣平菇、櫟側(cè)耳等，隸屬于擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、傘菌目Agaricales、口蘑科Tricholomataceae、側(cè)耳屬Pleurotus[2]，是一種食藥兼用的珍稀菌類之一。泡囊側(cè)耳是中高溫木腐型食用菌，主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū)，中國(guó)主要分布于臺(tái)灣地區(qū)、福建省、浙江省等[3]。研究表明，泡囊側(cè)耳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[4-6]和多種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8-9]，抑菌[10]和降血糖[11]等功效，具有較高的藥用價(jià)值。

目前，對(duì)泡囊側(cè)耳的研究主要集中于栽培技術(shù)和栽培料配方，營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)、藥理功效等方面及野生種質(zhì)資源收集馴化方面研究報(bào)道較少[3]。由于野生泡囊側(cè)耳種質(zhì)資源稀缺，產(chǎn)量低，致使可供人工栽培的品種少，一定程度上制約了其產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化發(fā)展，無法滿足市場(chǎng)需求。因此，挖掘和開發(fā)利用泡囊側(cè)耳優(yōu)質(zhì)野生資源是解決該問題的主要途徑之一。筆者對(duì)采自四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果種質(zhì)資源圃的一株野生側(cè)耳菌株，進(jìn)行形態(tài)特征和ITS 基因測(cè)序分析分類鑒定；同時(shí)對(duì)該菌株的生物學(xué)特性開展研究，為該菌株進(jìn)一步馴化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試菌株

供試野生側(cè)耳子實(shí)體采自四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果種質(zhì)資源圃，組織分離法[12]分離培養(yǎng)得純化菌株。

（2）供試培養(yǎng)基

綜合PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂 1 g，瓊脂18 g，水1 L，pH自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1.5 g，硫酸鎂0.75 g，瓊脂18 g，水1 L，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

參照真菌圖譜等工具書，對(duì)新鮮子實(shí)體的形狀、顏色、菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長(zhǎng)度和菌柄直徑等進(jìn)行觀察、測(cè)量和拍照，初步鑒定其分類地位。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將分離的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，待菌絲將要長(zhǎng)滿時(shí)進(jìn)行DNA 提取，DNA 提取參照柴海云的方法[13]。以提取的基因組DNA 為模板，以真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG- 3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'）為 引 物[14]，進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照張妍等[15]方法，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

登陸GenBank，將測(cè)定的序列經(jīng)BLAST比對(duì)，對(duì)菌株進(jìn)行同源性比較分析，在GenBank 中下載相似性較高的序列，用MEGA X 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹構(gòu)建，以Schizophyllum、Tricholoma為外群，用N-J 法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建分子進(jìn)化樹，進(jìn)行1 000次自展抽值檢驗(yàn)分子進(jìn)化樹可靠性。

1.2.3 生物學(xué)特性研究

1.2.3.1 培養(yǎng)基碳源試驗(yàn)

分別用等質(zhì)量的半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、木糖、羧基纖維素鈉、甘露醇、山梨醇和肌醇來代替供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，每個(gè)處理5 次重復(fù)。培養(yǎng)基接種供試菌株后，于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。參照高陽等[16]的方法，每天觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

菌絲平均生長(zhǎng)速度（mm/d）=（平均菌落直徑-5）/菌絲生長(zhǎng)時(shí)間。

1.2.3.2 培養(yǎng)基氮源試驗(yàn)

分別用等質(zhì)量牛肉粉、大豆蛋白胨、麥芽浸粉、甘氨酸、酵母粉和胰蛋白胨來代替供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，每個(gè)處理5 次重復(fù)。培養(yǎng)基接種供試菌株后，于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

采用綜合PDA 培養(yǎng)基。試驗(yàn)培養(yǎng)溫度設(shè)置為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃共8 個(gè)溫度處理，接種后于恒溫箱暗光培養(yǎng)菌絲。每個(gè)處理5次重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)

用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將綜合PDA 培養(yǎng)基初始pH 調(diào)為5、6、7、8、9、10，每個(gè)處理5次重復(fù)。接種后于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 22.0 分析處理，并采用單因素方差分析多重比較，采用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)各處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

該野生菌株子實(shí)體（圖1）中等，單生，扇形，菌蓋米白色，寬8~12 cm，長(zhǎng)5~7 cm，厚0.6~1.1 cm；菌肉白色，緊實(shí)；菌柄短、硬、粗，側(cè)生，菌柄長(zhǎng)3 cm、粗0.3~1.8 cm；菌蓋邊緣呈不規(guī)則波浪形。菌褶從菌柄部呈輻射狀延生，白色，密度中等，不等長(zhǎng)，在菌蓋邊緣處縱裂出許多小菌褶，無菌環(huán)、菌托。

圖1 野生泡囊側(cè)耳子實(shí)體和菌落形態(tài)

PDA 培養(yǎng)基上，菌落邊緣整齊，菌絲潔白，粗壯，密度中等，菌絲中央形成分生孢子并冒黑色分泌物。這些特征符合《中國(guó)大型真菌》[17]中關(guān)于泡囊側(cè)耳的描述，將該菌初步鑒定為泡囊側(cè)耳，暫名為Pc-1。

2.1.2 ITS分析

rDNA ITS 基因測(cè)序結(jié)果：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為689 bp。測(cè)序結(jié)果在Genbank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 搜索，與登錄號(hào) MW947482.1、MW947480.1菌株覆蓋率高達(dá)100%，相似性達(dá)100%。得到序列相似性為96%~100%，全部為側(cè)耳屬的不同種。下載相似性最高的ITS 序列，以MH483677.1、JX193694.1 為外群，利用 MEGA X 軟件采用 N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，Pc-1與側(cè)耳屬的Pleurotus cystidiosus聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征，可以判定Pc-1菌株為泡囊側(cè)耳。

圖2 Pc-1 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌絲生物學(xué)特性

2.2.1 培養(yǎng)基碳源試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲在供試碳源培養(yǎng)基上均能萌發(fā)并生長(zhǎng)。供試碳源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)存在差異，其中含肌醇培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，平均長(zhǎng)速為3.297 mm/d，但與山梨醇（3.221 mm/d）、甘露醇（3.197 mm/d）的平均長(zhǎng)速差異不顯著，之后依次是羧基纖維素鈉（3.016 mm/d）、淀 粉（2.989 mm/d）、木 糖（2.912 mm/d）、蔗 糖（2.891 mm/d）、麥 芽 糖（2.863 mm/d）、果 糖（2.485 mm/d）、乳 糖（2.381 mm/d）、半 乳 糖（2.343 mm/d）、葡萄糖（2.312 mm/d）。其中葡萄糖、半乳糖、乳糖培養(yǎng)基間，麥芽糖、蔗糖、木糖培養(yǎng)基間菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異，其他之間均存在顯著差異，部分存在極顯著差異。菌絲密度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，甘露醇、淀粉、蔗糖、麥芽糖為碳源時(shí)菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，肌醇、山梨醇、羧基纖維素鈉、木糖，果糖、葡萄糖次之，最差為含乳糖或半乳糖培養(yǎng)基。綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度，泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲生長(zhǎng)最適碳源為甘露醇，其次為淀粉。

表1 供試碳源培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況

2.2.2 培養(yǎng)基氮源試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲在供試氮源培養(yǎng)基上均能萌發(fā)并生長(zhǎng)。供試氮源培養(yǎng)基上菌絲平均生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)存在差異，以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲長(zhǎng)速為2.523 mm/d，然后依次是胰蛋白胨（2.477 mm/d），大豆蛋白胨（2.452 mm/d），蛋白胨（2.221 mm/d），牛肉粉（2.111 mm/d），麥芽浸粉（1.997 mm/d），最慢為含甘氨酸培養(yǎng)基，只有1.698 mm/d。酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨培養(yǎng)基間菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異，與其他供試氮源培養(yǎng)基存在極顯著差異；蛋白胨、牛肉粉、麥芽浸粉、甘氨酸培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度差異極顯著。菌絲密度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，酵母粉、胰蛋白胨為氮源時(shí)菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，牛肉粉、大豆蛋白胨次之，蛋白胨再次之，最差為甘氨酸、麥芽浸粉。綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度，酵母粉、胰蛋白胨為泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲生長(zhǎng)的最適氮源。

表2 供試氮源培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況

2.2.3 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，培養(yǎng)溫度為15~33 ℃泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲均能生長(zhǎng)，溫度對(duì)泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲生長(zhǎng)有顯著影響，試驗(yàn)溫度之間菌絲生長(zhǎng)速度差異極顯著。溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響由大到小依次是 30 ℃、27 ℃、24 ℃、21 ℃、33 ℃、18 ℃、15 ℃、36 ℃。培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，達(dá)4.061 mm/d。30 ℃、33 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度快速下降，36 ℃菌絲不萌發(fā)。溫度低于18 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲稀疏。因此，泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為27~30 ℃，最適溫度為30 ℃。

表3 試驗(yàn)溫度條件下Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況

2.2.4 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，培養(yǎng)基初始pH 為5~10 時(shí)泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲均能生長(zhǎng)，其在中性及弱堿性培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較好。當(dāng)培養(yǎng)基pH為5時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最慢，長(zhǎng)速為2.908 mm/d，長(zhǎng)勢(shì)較旺盛，菌絲較濃密。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為10 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最快，長(zhǎng)速為4.100 mm/d，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，菌絲濃密。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為6~10 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度隨著培養(yǎng)基pH 的上升而加快，菌絲長(zhǎng)勢(shì)也越來越旺盛，其中pH6、pH7 間菌絲長(zhǎng)速無顯著差異，但兩者與其他處理差異達(dá)極顯著。因此，泡囊側(cè)耳（Pc-1）菌絲生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基pH為8~10，最適pH為10。

表4 不同pH的培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況

3 小結(jié)與討論

真菌傳統(tǒng)的分類依據(jù)主要是考察形態(tài)結(jié)構(gòu)，但形態(tài)特征易受到環(huán)境、基因和地域等因素影響，造成形態(tài)多樣性，致使菌物鑒定存在偏差，不能做出準(zhǔn)確的鑒定。與傳統(tǒng)分類比較，分子生物學(xué)技術(shù)鑒定方法更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠。內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔期（ITS）位于 rRNA 編碼基因 18 S，5.8 S 和 28 S 之間的小基因片段，長(zhǎng)度為600~800 bp，具有較高的保守性，表現(xiàn)為種類相對(duì)保守，種間差異較為明顯[18]，已被廣泛用于真菌鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。試驗(yàn)綜合子實(shí)體特征和ITS 序列分析，鑒定該野生菌株（PC-1）為側(cè)耳屬，泡囊側(cè)耳。進(jìn)一步對(duì)泡囊側(cè)耳（Pc-1）生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，Pc-1 菌絲培養(yǎng)階段最適碳源為甘露醇，其次是淀粉，該結(jié)果與李蝶等[19]研究結(jié)果基本一致，與趙彥杰[20]和黃春燕等[21]結(jié)果存在差異；最適氮源是酵母粉、胰蛋白胨，該結(jié)果與目前有關(guān)囊泡惻然的報(bào)道基本相同。菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為27~30 ℃，最適溫度為30 ℃，溫度高于36 ℃菌絲基本不萌發(fā)；菌絲在初始pH5~10 培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，喜好中性及偏堿性培養(yǎng)環(huán)境，最適pH 為10，這一結(jié)果與大部分泡囊側(cè)耳菌株不一致。因此，泡囊側(cè)耳不同菌株間的生物學(xué)特性存在一定的差異性。試驗(yàn)只是進(jìn)行泡囊側(cè)耳（Pc-1）生物學(xué)特性的初步研究，對(duì)各因素之間有無交互作用、出菇特性及生物活性等還需進(jìn)一步研究。