肖玉軍 孔令家 黃中華 楊 梅 唐莉靜 柳成益
(攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院,四川攀枝花 617001)
側(cè)耳屬真菌分布非常廣泛,是世界上主要人工栽培的食用菌之一,具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。泡囊側(cè)耳Pleurotus cystidiosus,又名鮑魚菇、臺(tái)灣平菇、櫟側(cè)耳等,隸屬于擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、傘菌目Agaricales、口蘑科Tricholomataceae、側(cè)耳屬Pleurotus[2],是一種食藥兼用的珍稀菌類之一。泡囊側(cè)耳是中高溫木腐型食用菌,主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū),中國(guó)主要分布于臺(tái)灣地區(qū)、福建省、浙江省等[3]。研究表明,泡囊側(cè)耳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[4-6]和多種生物活性物質(zhì),具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8-9],抑菌[10]和降血糖[11]等功效,具有較高的藥用價(jià)值。
目前,對(duì)泡囊側(cè)耳的研究主要集中于栽培技術(shù)和栽培料配方,營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)、藥理功效等方面及野生種質(zhì)資源收集馴化方面研究報(bào)道較少[3]。由于野生泡囊側(cè)耳種質(zhì)資源稀缺,產(chǎn)量低,致使可供人工栽培的品種少,一定程度上制約了其產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化發(fā)展,無法滿足市場(chǎng)需求。因此,挖掘和開發(fā)利用泡囊側(cè)耳優(yōu)質(zhì)野生資源是解決該問題的主要途徑之一。筆者對(duì)采自四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果種質(zhì)資源圃的一株野生側(cè)耳菌株,進(jìn)行形態(tài)特征和ITS 基因測(cè)序分析分類鑒定;同時(shí)對(duì)該菌株的生物學(xué)特性開展研究,為該菌株進(jìn)一步馴化栽培提供理論依據(jù)。
(1)供試菌株
供試野生側(cè)耳子實(shí)體采自四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果種質(zhì)資源圃,組織分離法[12]分離培養(yǎng)得純化菌株。
(2)供試培養(yǎng)基
綜合PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨 3 g,磷酸二氫鉀 2 g,硫酸鎂 1 g,瓊脂18 g,水1 L,pH自然。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨2 g,磷酸二氫鉀1.5 g,硫酸鎂0.75 g,瓊脂18 g,水1 L,pH自然。
1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定
參照真菌圖譜等工具書,對(duì)新鮮子實(shí)體的形狀、顏色、菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長(zhǎng)度和菌柄直徑等進(jìn)行觀察、測(cè)量和拍照,初步鑒定其分類地位。
1.2.2 分子生物學(xué)鑒定
將分離的菌株進(jìn)行純培養(yǎng),待菌絲將要長(zhǎng)滿時(shí)進(jìn)行DNA 提取,DNA 提取參照柴海云的方法[13]。以提取的基因組DNA 為模板,以真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG- 3')和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3')為 引 物[14],進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照張妍等[15]方法,PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。
登陸GenBank,將測(cè)定的序列經(jīng)BLAST比對(duì),對(duì)菌株進(jìn)行同源性比較分析,在GenBank 中下載相似性較高的序列,用MEGA X 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹構(gòu)建,以Schizophyllum、Tricholoma為外群,用N-J 法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建分子進(jìn)化樹,進(jìn)行1 000次自展抽值檢驗(yàn)分子進(jìn)化樹可靠性。
1.2.3 生物學(xué)特性研究
1.2.3.1 培養(yǎng)基碳源試驗(yàn)
分別用等質(zhì)量的半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、木糖、羧基纖維素鈉、甘露醇、山梨醇和肌醇來代替供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖,每個(gè)處理5 次重復(fù)。培養(yǎng)基接種供試菌株后,于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。參照高陽等[16]的方法,每天觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì),測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。
菌絲平均生長(zhǎng)速度(mm/d)=(平均菌落直徑-5)/菌絲生長(zhǎng)時(shí)間。
1.2.3.2 培養(yǎng)基氮源試驗(yàn)
分別用等質(zhì)量牛肉粉、大豆蛋白胨、麥芽浸粉、甘氨酸、酵母粉和胰蛋白胨來代替供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨,每個(gè)處理5 次重復(fù)。培養(yǎng)基接種供試菌株后,于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。
1.2.3.3 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)
采用綜合PDA 培養(yǎng)基。試驗(yàn)培養(yǎng)溫度設(shè)置為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃共8 個(gè)溫度處理,接種后于恒溫箱暗光培養(yǎng)菌絲。每個(gè)處理5次重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。
1.2.3.4 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)
用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將綜合PDA 培養(yǎng)基初始pH 調(diào)為5、6、7、8、9、10,每個(gè)處理5次重復(fù)。接種后于25 ℃恒溫箱暗光培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)觀察方法同1.2.3.1。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 22.0 分析處理,并采用單因素方差分析多重比較,采用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)各處理間的差異性。
2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定
該野生菌株子實(shí)體(圖1)中等,單生,扇形,菌蓋米白色,寬8~12 cm,長(zhǎng)5~7 cm,厚0.6~1.1 cm;菌肉白色,緊實(shí);菌柄短、硬、粗,側(cè)生,菌柄長(zhǎng)3 cm、粗0.3~1.8 cm;菌蓋邊緣呈不規(guī)則波浪形。菌褶從菌柄部呈輻射狀延生,白色,密度中等,不等長(zhǎng),在菌蓋邊緣處縱裂出許多小菌褶,無菌環(huán)、菌托。
圖1 野生泡囊側(cè)耳子實(shí)體和菌落形態(tài)
PDA 培養(yǎng)基上,菌落邊緣整齊,菌絲潔白,粗壯,密度中等,菌絲中央形成分生孢子并冒黑色分泌物。這些特征符合《中國(guó)大型真菌》[17]中關(guān)于泡囊側(cè)耳的描述,將該菌初步鑒定為泡囊側(cè)耳,暫名為Pc-1。
2.1.2 ITS分析
rDNA ITS 基因測(cè)序結(jié)果:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為689 bp。測(cè)序結(jié)果在Genbank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 搜索,與登錄號(hào) MW947482.1、MW947480.1菌株覆蓋率高達(dá)100%,相似性達(dá)100%。得到序列相似性為96%~100%,全部為側(cè)耳屬的不同種。下載相似性最高的ITS 序列,以MH483677.1、JX193694.1 為外群,利用 MEGA X 軟件采用 N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,Pc-1與側(cè)耳屬的Pleurotus cystidiosus聚為一支,結(jié)合形態(tài)特征,可以判定Pc-1菌株為泡囊側(cè)耳。
圖2 Pc-1 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.1 培養(yǎng)基碳源試驗(yàn)結(jié)果
由表1 可知,泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲在供試碳源培養(yǎng)基上均能萌發(fā)并生長(zhǎng)。供試碳源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)存在差異,其中含肌醇培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快,平均長(zhǎng)速為3.297 mm/d,但與山梨醇(3.221 mm/d)、甘露醇(3.197 mm/d)的平均長(zhǎng)速差異不顯著,之后依次是羧基纖維素鈉(3.016 mm/d)、淀 粉(2.989 mm/d)、木 糖(2.912 mm/d)、蔗 糖(2.891 mm/d)、麥 芽 糖(2.863 mm/d)、果 糖(2.485 mm/d)、乳 糖(2.381 mm/d)、半 乳 糖(2.343 mm/d)、葡萄糖(2.312 mm/d)。其中葡萄糖、半乳糖、乳糖培養(yǎng)基間,麥芽糖、蔗糖、木糖培養(yǎng)基間菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異,其他之間均存在顯著差異,部分存在極顯著差異。菌絲密度和菌絲長(zhǎng)勢(shì),甘露醇、淀粉、蔗糖、麥芽糖為碳源時(shí)菌絲濃密,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,肌醇、山梨醇、羧基纖維素鈉、木糖,果糖、葡萄糖次之,最差為含乳糖或半乳糖培養(yǎng)基。綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度,泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲生長(zhǎng)最適碳源為甘露醇,其次為淀粉。
表1 供試碳源培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況
2.2.2 培養(yǎng)基氮源試驗(yàn)結(jié)果
由表2 可知,泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲在供試氮源培養(yǎng)基上均能萌發(fā)并生長(zhǎng)。供試氮源培養(yǎng)基上菌絲平均生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)存在差異,以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快,菌絲長(zhǎng)速為2.523 mm/d,然后依次是胰蛋白胨(2.477 mm/d),大豆蛋白胨(2.452 mm/d),蛋白胨(2.221 mm/d),牛肉粉(2.111 mm/d),麥芽浸粉(1.997 mm/d),最慢為含甘氨酸培養(yǎng)基,只有1.698 mm/d。酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨培養(yǎng)基間菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異,與其他供試氮源培養(yǎng)基存在極顯著差異;蛋白胨、牛肉粉、麥芽浸粉、甘氨酸培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度差異極顯著。菌絲密度和菌絲長(zhǎng)勢(shì),酵母粉、胰蛋白胨為氮源時(shí)菌絲濃密,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,牛肉粉、大豆蛋白胨次之,蛋白胨再次之,最差為甘氨酸、麥芽浸粉。綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度,酵母粉、胰蛋白胨為泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲生長(zhǎng)的最適氮源。
表2 供試氮源培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況
2.2.3 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果
由表3 可知,培養(yǎng)溫度為15~33 ℃泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲均能生長(zhǎng),溫度對(duì)泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲生長(zhǎng)有顯著影響,試驗(yàn)溫度之間菌絲生長(zhǎng)速度差異極顯著。溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響由大到小依次是 30 ℃、27 ℃、24 ℃、21 ℃、33 ℃、18 ℃、15 ℃、36 ℃。培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快,達(dá)4.061 mm/d。30 ℃、33 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度快速下降,36 ℃菌絲不萌發(fā)。溫度低于18 ℃時(shí),菌絲生長(zhǎng)緩慢,菌絲稀疏。因此,泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為27~30 ℃,最適溫度為30 ℃。
表3 試驗(yàn)溫度條件下Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況
2.2.4 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)結(jié)果
由表4 可知,培養(yǎng)基初始pH 為5~10 時(shí)泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲均能生長(zhǎng),其在中性及弱堿性培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較好。當(dāng)培養(yǎng)基pH為5時(shí),菌絲生長(zhǎng)最慢,長(zhǎng)速為2.908 mm/d,長(zhǎng)勢(shì)較旺盛,菌絲較濃密。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為10 時(shí),菌絲生長(zhǎng)最快,長(zhǎng)速為4.100 mm/d,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,菌絲濃密。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為6~10 時(shí),菌絲生長(zhǎng)速度隨著培養(yǎng)基pH 的上升而加快,菌絲長(zhǎng)勢(shì)也越來越旺盛,其中pH6、pH7 間菌絲長(zhǎng)速無顯著差異,但兩者與其他處理差異達(dá)極顯著。因此,泡囊側(cè)耳(Pc-1)菌絲生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基pH為8~10,最適pH為10。
表4 不同pH的培養(yǎng)基上Pc-1菌株菌絲生長(zhǎng)情況
真菌傳統(tǒng)的分類依據(jù)主要是考察形態(tài)結(jié)構(gòu),但形態(tài)特征易受到環(huán)境、基因和地域等因素影響,造成形態(tài)多樣性,致使菌物鑒定存在偏差,不能做出準(zhǔn)確的鑒定。與傳統(tǒng)分類比較,分子生物學(xué)技術(shù)鑒定方法更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠。內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔期(ITS)位于 rRNA 編碼基因 18 S,5.8 S 和 28 S 之間的小基因片段,長(zhǎng)度為600~800 bp,具有較高的保守性,表現(xiàn)為種類相對(duì)保守,種間差異較為明顯[18],已被廣泛用于真菌鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。試驗(yàn)綜合子實(shí)體特征和ITS 序列分析,鑒定該野生菌株(PC-1)為側(cè)耳屬,泡囊側(cè)耳。進(jìn)一步對(duì)泡囊側(cè)耳(Pc-1)生物學(xué)特性研究結(jié)果表明,Pc-1 菌絲培養(yǎng)階段最適碳源為甘露醇,其次是淀粉,該結(jié)果與李蝶等[19]研究結(jié)果基本一致,與趙彥杰[20]和黃春燕等[21]結(jié)果存在差異;最適氮源是酵母粉、胰蛋白胨,該結(jié)果與目前有關(guān)囊泡惻然的報(bào)道基本相同。菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為27~30 ℃,最適溫度為30 ℃,溫度高于36 ℃菌絲基本不萌發(fā);菌絲在初始pH5~10 培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng),喜好中性及偏堿性培養(yǎng)環(huán)境,最適pH 為10,這一結(jié)果與大部分泡囊側(cè)耳菌株不一致。因此,泡囊側(cè)耳不同菌株間的生物學(xué)特性存在一定的差異性。試驗(yàn)只是進(jìn)行泡囊側(cè)耳(Pc-1)生物學(xué)特性的初步研究,對(duì)各因素之間有無交互作用、出菇特性及生物活性等還需進(jìn)一步研究。