樂(lè)文俊 梁新梅

特發(fā)性肺纖維化急性加重(acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis，AE-IPF)在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中是一種常見(jiàn)的疾病，其發(fā)病原因較為復(fù)雜，且具有慢性、進(jìn)行性及不可逆性發(fā)展，又被稱(chēng)為致死性肺疾病[1]。而支氣管癌、肺栓塞是導(dǎo)致特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者主要的死亡原因[2]。有研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是造成肺纖維化主要細(xì)胞因子，是纖維化進(jìn)展及產(chǎn)生的主要原因之一[3]。同時(shí)TGF-β1下游果蠅抗生物皮膚生長(zhǎng)因子蛋白家族(Smads)信號(hào)通路對(duì)大鼠肺纖維化進(jìn)展影響較大[4]。鹽酸氨溴索具有刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞合成的作用，同時(shí)能夠分泌肺表面活性物質(zhì)，可促進(jìn)上皮纖毛的再生，使纖毛功能的恢復(fù)，從而維持氣管黏膜的分泌功能[5]。本文旨在研究鹽酸氨溴索基于AE-IPF TGF-β1/smads信號(hào)通路對(duì)大鼠氣管黏膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取50只SPF級(jí)健康成年雄性大鼠，鼠齡7～9周，體重260～280 g，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，生產(chǎn)許可：SCXK(粵)2019-0048。所有大鼠飼養(yǎng)在溫度：20～24℃，相對(duì)濕度：60%，換氣次數(shù)：10～15次/h，晝夜明暗交替時(shí)間：12/12 h，自由活動(dòng)及飲食。

1.2 方法

1.2.1 AE-IPF模型建立：50只大鼠中隨機(jī)選取10只為正常組，其余40只參考臧凝子等[6]報(bào)道的AE-IPF模型建立方法，具體操作：采用0.3 ml/100 g劑量的10%水合氯醛在大鼠腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥的方式放在鼠板上，固定大鼠的頭與四肢且使其頸部暴露完全。使用剪刀剔除大鼠頸部毛發(fā)，并且采用碘伏對(duì)大鼠進(jìn)行常規(guī)消毒，使用手術(shù)剪將大鼠頸部皮膚縱向剪開(kāi)1 cm，隨后采用鑷子和止血鉗逐層剝離大鼠的皮下組織，將大鼠氣管暴露。根據(jù)大鼠的體重以0.2 ml/100 g的劑量，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠氣管內(nèi)注入10 mg/ml博來(lái)霉素注射液，注射完畢后，左手直立持固定大鼠的鼠板且右手輕輕按住大鼠的身體，緩慢傾斜，左右搖晃3 min左右，使博來(lái)霉素迅速擴(kuò)散到實(shí)驗(yàn)大鼠肺內(nèi)，建造AE-IPF模型。

1.2.2 分組：造模成功后，隨機(jī)分為模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組，每組10只。次日，分別將鹽酸氨溴索(鹽酸氨溴索注射液，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20041473)10、20、40 mg/kg對(duì)鹽酸氨溴索低、中、高劑量組大鼠進(jìn)行注射，隨后對(duì)正常組和模型組大鼠注射等體積的0.9%氯化鈉溶液，對(duì)各組大鼠均干預(yù)14 d。

1.2.3 病理學(xué)觀察：所有大鼠麻醉后進(jìn)行脫頸處死，隨后剖取大鼠氣管組織，采用3%的戊二醛和10%甲醛固定24 h，將其垂直在氣道上進(jìn)行取材，隨后采用磷酸緩沖液進(jìn)行沖洗，剪取氣管后1/3腹側(cè)段，經(jīng)鋨酸沖洗、固定、醋酸異戊酯置換及乙醇脫水、石蠟包埋后，制作5 μm氣管組織進(jìn)行HE染色。

1.2.4 支氣管黏膜受損面積、平滑肌厚度：采用JSM-6510型掃描電鏡(上海百賀儀器科技有限公司)對(duì)氣管組織進(jìn)行拍照，觀察并記錄支氣管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化，采用Image-pro Plus 6，0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算支氣管黏膜受損面積及大鼠支氣管平滑肌厚度。

1.2.5 MMP-2、TIMP-1表達(dá)水平檢測(cè)：采集大鼠右肺組織20 mg，加入210 μl 0.9%氯化鈉溶液后，低溫勻漿1 min進(jìn)行離心，分離2次后，提取出上層勻漿液備用。采用ELISA法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP-2)、組織金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitorof metallo proteinase-1，TIMP-1)水平：采用碳酸鹽包被緩沖液稀釋標(biāo)本，在聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中分別加入0.2 ml標(biāo)本，5℃處理24 h，甩去孔內(nèi)液體，浸泡2 min；加入0.2 ml稀釋好的抗體，37℃處理24 h，隨后加陰性和陽(yáng)性對(duì)照血清；加入0.2 ml稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃處理0.5 h；加入0.2 ml臨時(shí)配制的TMB底物溶液，37℃處理15 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止液，放置在白色的背景下，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，顏色就越深，陰性為極淺或無(wú)色，顏色深淺以“+”、“-”來(lái)表示。

1.2.6 ZO-1、MRP1、TGF-β1、smads蛋白檢測(cè)：取出大鼠右肺組織，采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，在4℃環(huán)境下進(jìn)行離心處理，提取出上清液。采用Western-blotting法對(duì)緊密連接蛋白(Zonula occludens-1，ZO-1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、TGF-β1、smads蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，將緩沖溶液加入到組織裂解提取液中，在95℃下對(duì)其進(jìn)行5 min滅活，對(duì)蛋白質(zhì)采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離，在印跡膜上放入電泳分離出的蛋白質(zhì)，在室溫中，將其放置到含量為5%的脫脂奶粉中進(jìn)行封閉，2 h后，將相應(yīng)蛋白以1∶500稀釋后的一抗抗體和PVDF膜進(jìn)行孵育；處理24 h，采用PBST洗滌液進(jìn)行清洗，在室溫下將1∶2 000稀釋后的二抗抗體進(jìn)行孵育；避光處理30 min，采用PBST洗滌液進(jìn)行清洗，將PVDF膜和ELC增強(qiáng)的顯色底物共同放置，1 min后，采用X射線對(duì)其進(jìn)行曝光顯影處理，應(yīng)用Bio-Rad image分析系統(tǒng)對(duì)顯影后圖片進(jìn)行查看，內(nèi)部基準(zhǔn)電壓測(cè)量采用肌動(dòng)蛋白抗體作為對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次并且進(jìn)行系統(tǒng)性的分析，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠氣管組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠氣管黏膜及氣管平滑肌厚度正常；與正常組相比，模型組大鼠氣管黏膜受損面積明顯增加，氣管平滑肌厚度加大；與模型組相比，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組大鼠氣管黏膜受損面積明顯減輕，氣管平滑肌厚度減少，其中鹽酸氨溴索高劑量組大鼠效果最為明顯。見(jiàn)圖1。

正常組模型組鹽酸氨溴索低劑量組鹽酸氨溴索中劑量組鹽酸氨溴索高劑量組

2.2 5組大鼠氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組支氣管平滑肌厚度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度比較

2.3 5組大鼠MMP-2、TIMP-1水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組MMP-2、TIMP-1水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠MMP-2、TIMP-1水平比較

2.4 5組大鼠ZO-1、MRP1蛋白水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 5組大鼠ZO-1、MRPA蛋白比較

2.5 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 5組大鼠ZO-1、MRPA蛋白水平比較(WB圖);A 模型組；B 鹽酸氨溴索低劑量組；C 鹽酸氨溴索中劑量組；D 鹽酸氨溴索高劑量組；E 正常組

與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖3。

表4 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較

圖3 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較(WB圖);A 模型組；B 鹽酸氨溴索低劑量組；C 鹽酸氨溴索中劑量組；D 鹽酸氨溴索高劑量組；E 正常組

3 討論

AE-IPF是一種纖維化性間質(zhì)性肺炎的疾病，臨床表現(xiàn)主要有頑固性干咳、發(fā)紺、勞力性呼吸困難，其作用機(jī)制不明確，是目前急需解決肺系疑難病癥之一[7]。AE-IPF主要由于多因素造成的肺間質(zhì)性疾病，其病理特征主要為細(xì)胞外基質(zhì)沉積、成纖維細(xì)胞增殖、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)肺功能發(fā)生進(jìn)行性降低或呼吸衰竭[3,8]。

近年來(lái)，隨著大氣污染及環(huán)境惡化等，AE-IPF發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高，嚴(yán)重威脅人們的生命安全[9]。肺最基本的功能是呼吸，而空氣中許多的異物顆粒及微生物會(huì)隨著氣體交換進(jìn)出機(jī)體的呼吸道，呼吸系統(tǒng)與外界接觸是最為頻繁的，其中氣管黏膜纖毛系統(tǒng)是呼吸系統(tǒng)最為重要的一道防御屏障[10]。本文研究顯示，鹽酸氨溴索能夠減少AE-IPF大鼠支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度，有效改善大鼠呼吸功能，其中高濃度作用明顯。其作用機(jī)制可能為：鹽酸氨溴索主要是一種黏液溶解劑，其具有促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的合成、抗氧化、抗炎的作用，同時(shí)還具有與抗生素協(xié)同作用，防止肺不張及肺泡萎陷，進(jìn)而協(xié)助無(wú)纖毛區(qū)痰液的運(yùn)送，使黏膜纖毛的運(yùn)動(dòng)加速，維持上呼吸道自?xún)舻墓π?，阻礙有害因素的損傷，從而改善氣管黏膜的正常分泌[11,12]。

目前有大量的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶/抗蛋白酶的失衡以及蛋白酶活性增強(qiáng)是肺纖維化性主要發(fā)病因素[13]。MMP-2是一種彈性基質(zhì)分解活性的酶類(lèi)，具有降解肺泡壁的纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白多糖、彈性纖維、膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分[14]。TIMPs是一種MMPs的內(nèi)源性天然抑制因子，其與MMPs結(jié)合具有抑制其活性的作用，而TIMP-1在活性中是最強(qiáng)的一種，能夠使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解，其是一種氣道纖維化的標(biāo)志，從而能夠反映出氣道修復(fù)重塑的過(guò)程[15]。本文研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸氨溴索能夠降低AE-IPF大鼠MMP-2、TIMP-1水平，從而有效改善大鼠氣道損傷，其中高濃度改善作用顯著。

MRP1在肺支氣管上皮中具有較強(qiáng)的表達(dá)，其主要作用于內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)毒物、藥物以及代謝產(chǎn)物濃度的作用，其主要通過(guò)作用于內(nèi)源性代謝物，能夠調(diào)節(jié)肺組織氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少異物對(duì)機(jī)體損傷的作用[16]。此外，上皮連接功能喪失或者減弱是氣道上皮損傷的主要原因之一，而ZO-1在上皮屏障功能中是一種重要細(xì)胞間連接蛋白，其能夠構(gòu)成緊密連接蛋白復(fù)合物，其在肺纖維化大鼠中表達(dá)下調(diào)[17]。本文研究表明，鹽酸氨溴索能夠升高AE-IPF大鼠ZO-1、MRP1蛋白水平，表明鹽酸氨溴索通過(guò)調(diào)節(jié)ZO-1和MRP1表達(dá)能夠?qū)E-IPF大鼠的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起到保護(hù)作用，其中高濃度保護(hù)作用最為明顯。

TGF-β1是導(dǎo)致機(jī)體纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子，細(xì)胞膜表面受體與TGF-β1進(jìn)行結(jié)合，將其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，TGF-β1能夠誘導(dǎo)Smad相關(guān)蛋白的磷酸化，Smads家族蛋白主要是從細(xì)胞膜中將信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中，而相關(guān)靶基因與進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化[18,19]。正常情況下，TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)主要以無(wú)活性存在，TGF-β1型信號(hào)傳遞或者表達(dá)需要對(duì)應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑實(shí)現(xiàn)，其中Smads路徑具有重要的影響，Smads3、Smads4及Smads7是TGF-β1/smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑內(nèi)主要信號(hào)蛋白，共同調(diào)控肺纖維化[20]。本文研究結(jié)果顯示，鹽酸氨溴索能夠降低AE-IPF大鼠TGF-β1、smads蛋白水平，從而抑制肺纖維化的發(fā)生，其中高濃度抑制效果最為顯著。

綜上所述，鹽酸氨溴索能夠減少AE-IPF大鼠支氣管平滑肌厚度及支氣管黏膜受損面積，通過(guò)降低MMP-2、TIMP-1水平，從而改善大鼠氣管損傷，通過(guò)調(diào)控TGF-β1、smads信號(hào)通路蛋白水平，從而抑制模型大鼠肺纖維化的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)氣管黏膜起到保護(hù)作用，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)。