徐 丹，杜 紅，易 鑫，張國華，白世平，舒 剛*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)所，成都 611130）

現(xiàn)今集約化養(yǎng)殖環(huán)境下，各種有害環(huán)境因素損害著動物機體的健康。氨氣是一種具有強烈刺激氣味的有毒有害氣體[1-2]，作為畜舍中危害最大的有害氣體之一，給畜禽帶來嚴重的應激反應，損害動物健康，給畜牧業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。家養(yǎng)畜禽中，禽類對氨氣最為敏感，因此，高濃度的氨氣嚴重制約了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和利益。

雞的腸道定植著大量的微生物菌落，它們是維持機體正常消化、代謝和促進免疫機能的基礎，對禽類的整體健康和性能起著重要作用[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，菌群受環(huán)境因素的影響很大，遠遠比宿主因素更重要[5-6]。空氣污染物會誘導腸道菌群紊亂，更重要的是，腸道微生物群紊亂參與了空氣污染誘導的許多病理生理過程[7-8]。高濃度氨氣會導致肉雞胃腸道微生態(tài)平衡遭到破壞，為有害細菌在機體內(nèi)定植感染提供有利條件，從而影響動物機體健康，間接降低其生產(chǎn)性能，損害畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益[9]。

神經(jīng)系統(tǒng)也是氨氣應激損害機體的另外一個靶點。應激還能影響機體神經(jīng)系統(tǒng)的功能及神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，進而影響動物機體各個組織臟器及生長發(fā)育。氨氣作為一種環(huán)境應激源，能通過抑制肉雞腦神經(jīng)細胞的新陳代謝，導致肉雞氨中毒，進而抑制肉雞的采食中樞[10]。應激過程中對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可能是緩解機體應激反應的重要作用靶點。

柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效活性成分，具有解熱[11]、抗氧化[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]、抗炎[14]以及鎮(zhèn)靜[15]等藥理作用，對動物應激有很好的緩解作用。據(jù)此我們推測柴胡皂苷通過調(diào)節(jié)雛雞神經(jīng)系統(tǒng)及腸道菌群以達到抵抗氨氣應激的作用。

基于此，本試驗旨在研究柴胡皂苷作對氨氣暴露下雛雞盲腸微生物群落的調(diào)節(jié)作用及對雛雞神經(jīng)系統(tǒng)的平衡維持作用，擬闡明有害氣體氨氣影響雛雞健康的機理，同時，為柴胡皂苷在緩解養(yǎng)禽業(yè)中由氨氣應激引發(fā)的腸道損傷和維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)的運用提供理論依據(jù)，豐富環(huán)境毒理學的研究資料，為氨氣中毒的診斷和臨床防治及柴胡皂苷在抗應激方面的研發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

柴胡皂苷，純度在99%以上，主要成分為柴胡皂苷a 32.1%，柴胡皂苷c 11.8%，柴胡皂苷d 43.9%，柴胡皂苷e 4.7%，柴胡皂苷f 7.5%（浙江盛世生物技術有限公司，批號201903131）；五羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）Elisa試劑盒（酶免，批號20190709）。

1.2 實驗動物飼養(yǎng)及管理

選用480只1日齡初始體重為(38.83±3.45)g的健康AA肉雞（四川農(nóng)業(yè)大學家禽養(yǎng)殖場提供）開展試驗，試驗雞均飼養(yǎng)在環(huán)境控制艙中(4 500 mm×3 000 mm× 2 500 mm;長×寬×高，30只/艙)，環(huán)境控制艙外接氨氣瓶，通過氨氣流量計調(diào)節(jié)控制艙內(nèi)的氨氣供給，同時，飼養(yǎng)過程中使用Lumassense光聲場氣體監(jiān)測儀Innova-1412（美國加利福尼亞州圣克拉拉）實時監(jiān)測艙內(nèi)的氨氣濃度。自由采食與飲水，雞舍內(nèi)保持空氣濕度在65%±5%，溫度在1日齡時保持在35℃左右，2～7日齡保持在32～35℃。1～2日齡每天光照時間為24 h，3～7日齡每天光照時間為16 h，管理方式同常規(guī)育雛。

1.3 試驗分組及設計

將試驗雞隨機分為4組，每組4個重復，每個重復30只，具體分組見表1。試驗組雞只除使用試驗藥物外，其余各種飼養(yǎng)條件均與空白對照組相同。試驗雞出殼后適應性飼養(yǎng)1 d，試驗從雛雞2日齡開始，至其8日齡結束，共計7 d。

表1 分組及試驗處理Table 1 Groups and Treatment Methods of the Experiment

雛雞日糧根據(jù)中國雞飼養(yǎng)標準結合肉雞營養(yǎng)需要標準配制[20]，飼料配方及營養(yǎng)水平見表2。

表2 飼糧組成及其營養(yǎng)水平Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets %

1.4 樣品采集

試驗期間每日觀察并記錄雛雞的精神、活動、采食量、飲水、健康狀況以及拍照。試驗結束后，每組每個重復隨機抽取2只雛雞剖殺后，無菌手術結扎線截取盲腸頭端，后在超凈工作臺中，將盲腸內(nèi)容物快速擠壓到滅菌凍存管中，液氮速凍，放入-80℃冰箱待測。解剖后取腦部，在冰袋上剖取腦部組織海馬區(qū)，-80℃環(huán)境下冷凍保存?zhèn)溆?。將腦組織按照1∶9加入無菌生理鹽水，制備組織勻漿，收集上清液用于后續(xù)NE、DA及5-HT測定。

1.5 生長性能

稱量記錄每組雛雞初始重量以及試驗終重量，計算平均日增重；記錄每日采食量，計算采食量與料肉比。

平均日增重/(g·d-1)=(終末體重-初始體重)/天數(shù)

料肉比=消耗飼料總量/增重總量

1.6 盲腸總菌群16S rRNA Illumina擴增子測序

1.6.1 DNA的提取與Illumina擴增子測序

使用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法提取32只雞盲腸菌群基因組DNA，采用NanoDrop-2000檢測樣本DNA濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性[21]。合格樣品用細菌通用引物515F/806R進行16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴增(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;R:5′-GACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)，擴增后產(chǎn)物質(zhì)檢、純化，構建合格文庫后，北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成Illumina HiSeq平臺測序。

1.6.2 生物信息學分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)，進一步獲取干凈序列并去除嵌合體數(shù)據(jù)得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和物種分類分析。通過軟件對OTU代表序列做物種注釋，獲取對應的各分類水平（門、科、屬水平）的組成和豐度分布情況[22]。

1.7 行為學觀察

在整個試驗周期內(nèi)，從每個重復中隨機選取8只雞進行標記，采取16個攝像頭同時攝錄4個處理組（16個重復）雛雞的行為學表征，每天兩次，分別于09:30和14:30開始，每次持續(xù)60 min，按照表3項目記錄。頻次指單位時間內(nèi)，單只肉雞各行為發(fā)生的平均次數(shù)[23]。各種行為頻次的異常提示肉雞的應激狀態(tài)，肉雞福利受到損害。

表3 雛雞主要行為學變量及其描述Table 3 Main behavioral variables of broilers and relevant descriptions

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)分布正態(tài)和方差檢驗后，用SPSS 22.0（spssinc，美國）進行Tukey HSD多重比較檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差（Mean±SE）表示。

2 結果與分析

2.1 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞臨床表現(xiàn)及生長性能的影響

試驗期間，CON和CSP雛雞精神狀態(tài)良好，糞便成形，喜趴臥，生長發(fā)育良好；與CON相比，NH和NSP雛雞食欲下降，流淚、結膜潮紅，肺部有啰音，異常興奮，站立走動次數(shù)增多，生長發(fā)育緩慢，體型明顯小于CON和CSP（圖1）。生長性能結果如圖2所示，與空白組相比，氨氣環(huán)境下雛雞的平均日增重、平均日耗料和平均終體重均顯著降低(P＜0.05)，分別降低了21.31%、6.95%和14.61%，料肉比增加了17.14%(P＜0.05)；柴胡皂苷能顯著提高雛雞平均日增重和平均終體重(P＜0.05)。

圖1 各組雛雞外觀Figure 1 Photos of broliers in each group

圖2 各組雛雞生長性能指標Figure 2 Growth performance in each group

2.2 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞盲腸菌群的影響

2.2.1 盲腸菌群序列樣品深度分析

用Illumina HiSeq測序平臺，對細菌16s rRNA的V3-V4區(qū)進行擴增、測序，序列長度均分布在兩個區(qū)域，符合本試驗目的測序區(qū)域。Specaccum累計曲線達到平臺期，測序數(shù)據(jù)量滿足試驗需要。每個樣本平均能獲得78 039條高質(zhì)量有效測序數(shù)據(jù)，平均讀長為403 bp，測序深度和樣本數(shù)量滿足分析要求。

2.2.2 盲腸菌群Alpha(α)多樣性分析

α多樣性分析采用Observed-OTU指數(shù)來預測腸道菌群中的多樣性與豐富度，采用Pielouevenness指數(shù)來預測腸道菌群群落豐富度和群落均勻度。結果表明（圖3），4個組Observed-OTU和Pielou-evenness指數(shù)均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)。

圖3 α多樣性分析Figure 3 α diversity analysis

2.2.3 盲腸菌群Beta(β)多樣性分析

β多樣性分析通過Unweighted UniFrac PCoA、Weighted UniFrac PCoA、Bray-curtis PCoA和Jaccard PCoA進行展示。Unweighted UniFrac PCoA（圖4A）和Weighted UniFrac PCoA（圖4B）結果一致，分析顯示，氨氣處理組和正常環(huán)境下的處理組樣本在三維象限內(nèi)可以明顯區(qū)分，而相同環(huán)境下的處理組的樣本不能很好地區(qū)分。Bray-curtis（加權）和Jaccard（非加權）指數(shù)（圖4C、4D）結果同樣表明，正常環(huán)境下的處理組的樣本可以和高濃度氨氣環(huán)境下的處理組的樣本明顯在三維空間中區(qū)分開來。不同處理組中雛雞盲腸菌群β多樣性結果如表4所示，結果表明雛雞的盲腸菌群β多樣性受到氨氣應激的影響，呈現(xiàn)出與正常環(huán)境下健康對照雛雞不同的群落組成和分布。

表4 各組盲腸菌群β多樣性Table 4 The β diversity of cecal flora in each group

圖4 β多樣性PCoA分析Figure 4 β diversity of PCoA analysis

2.2.4 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞盲腸菌群各分類水平組成的影響

2.2.4.1 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞盲腸菌群門水平的影響

根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定，不同處理組中雛雞盲腸菌群在門水平的組成如圖5所示，在門水平上的盲腸菌群優(yōu)勢菌門主要由厚壁菌門(Firmicutes)、柔膜菌門(Tenericutes)和變形菌門(Proteobacteria)組成。各組厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度均無明顯差異(P＞0.05)。對于柔膜菌門(Tenericutes)的相對豐度，NH顯著高于CON(P＜0.05)，同時CSP和NSP顯著低于NH(P＜0.05)（表5）。

表5 盲腸菌群門水平優(yōu)勢物種相對豐度Table 5 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at phyla level %

2.2.4.2 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞盲腸菌群科水平的影響

由圖6所示，在科水平上（至少一個組中平均相對豐度大于0.5%），CON中的優(yōu)勢菌群有9個，約占組內(nèi)總菌群的56.25%；CSP中的優(yōu)勢菌群有6個，約占組內(nèi)總菌群的37.5%；NH中的優(yōu)勢菌群有6個，約占組內(nèi)總菌群的37.5%；NSP中的優(yōu)勢菌群有6個，約占組內(nèi)總菌群的37.5%。相較于CON，CSP減少了3個優(yōu)勢菌群：厭氧支原體科(Anaeroplasma?taceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌門下一個未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)；NH也減少3個優(yōu)勢菌群：乳酸細菌科(Lactobacillaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌門下一個未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)。相較于NH，CSP增加了1個優(yōu)勢菌群：乳酸細菌科(Lactobacillaceae)，減少1個優(yōu)勢菌群：厭氧支原體科(Anaeroplasmataceae)。NSP和氨氣組在科水平上具有相同的優(yōu)勢菌群。

2.2.4.3 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞盲腸菌群屬水平的影響

由表6可知，試驗雛雞在屬水平上有31個屬的優(yōu)勢菌群（至少一個組中平均相對豐度大于0.5%）。在屬水平上，CON中共有25個優(yōu)勢菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢菌屬的80.65%。CSP中共有26個優(yōu)勢菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢菌屬的83.87%。NH中共有26個優(yōu)勢菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢菌屬的83.87%，相較于CON，增加4個優(yōu)勢菌屬：uncultured Firmicutes bacte?rium、Intestinimonas、Ruminiclostridium和Ruminococ?caceae UCG-005，減少 3個優(yōu)勢菌屬：GCA-900066575、Ruminococcaceae UCG-013和 Lachnospi?raceae NK4A136 group。NSP中共有24個優(yōu)勢菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢菌屬的77.42%，相較于NH，NSP中的優(yōu)勢菌屬結構差異很大，增加2個優(yōu)勢菌屬：gut metagenome和Ruminococcaceae UCG-013，減少4個優(yōu)勢菌屬：Lactobacillus、uncultured Firmicutes bacte?rium、Ruminiclostridium和Ruminococcaceae UCG-005。

表6 盲腸菌群屬水平優(yōu)勢物種相對豐度Table 6 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at genus level

與CON相比，NH中的uncultured Firmicutes bac?terium、Flavonifractor、Ruminiclostridium 9、Rumino?coccaceae UCG-005和5__uncultured相對豐度顯著增加(P＜0.05)，Eisenbergiella、[Ruminococcus]torques group和Ruminococcaceae UCG-013的相對豐度顯著減少(P＜0.05)。

2.3 柴胡皂苷對氨氣應激雛雞行為及神經(jīng)遞質(zhì)的影響

由表7可知，相對于CON，NH組雛肉雞梳羽、抖身、展翅和走動的頻次顯著增加(P＜0.05)，趴臥的頻次顯著降低(P＜0.05)。相對于NH，CSP組雛肉雞梳羽的頻次顯著降低(P＜0.05)。各組雛肉雞飲水、采食和撓頭的頻次無顯著差異(P＞0.05)。

表7 單位時間內(nèi)各組肉雞日常行為頻次Table 7 Daily behavior frequency of broilers in each group in unit time

各組雛雞腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量見表8。結果表明，相較于CON，CSP腦部海馬區(qū)NE含量顯著降低(P＜0.05)，NH腦部海馬區(qū)NE含量顯著增加(P＜0.05)。相較于NH，NSP的NE含量顯著降低(P＜0.05)。NH腦部海馬區(qū)DA的含量顯著低于CON和CSP(P＜0.05)。對于腦部海馬區(qū)五羥色胺的含量，NH顯著高于CON和CSP(P＜0.05)。

表8 雛雞腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量Table 8 The content of neurotransmitters in hippocampus of NH3-stress broilers

3 討論

氨氣是危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的有毒有害氣體之一，給畜禽帶來嚴重的應激反應，損害動物健康，損害養(yǎng)殖者乃至整個畜牧行業(yè)的利益。本研究中，100 mg/m3濃度的氨氣環(huán)境下，雛肉雞異常興奮躁動、趴臥次數(shù)減少。雛肉雞難以維持正常生理功能，最終表現(xiàn)為生長性能下降。

動物機體腸道平衡的菌群在機體能量攝取、代謝以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生命活動中發(fā)揮了重要作用[24]，且盲腸是禽類微生物的主要活性位點[25]。本文利用Illumina Hiseq高通量測序平臺，探索氨氣暴露及柴胡皂苷干預對雛肉雞盲腸菌群的影響。微生物群落的整體結構和功能受到區(qū)系多樣性與豐富度的調(diào)控，一旦失衡，腸道菌群將發(fā)生紊亂，從而誘發(fā)更多并發(fā)癥。Zhu X.Y.等[26]研究表明，肉雞盲腸微生物菌群的構建大概在6～7周，因此我們推測本試驗中各組雛肉雞盲腸菌群α多樣性無顯著性差異可能與試驗肉雞日齡及試驗因素作用時間太短相關。β多樣性則更注重對不同樣本微生物群落構成進行差異分析，是外界環(huán)境對生物體改變程度的一個度量[27]。本試驗中，氨氣環(huán)境是影響雛雞盲腸菌群β多樣性的一個重要因素，柴胡皂苷的添加與否對雛雞盲腸菌群β多樣性的影響并不明顯。

厚壁菌門是多種動物的腸道或糞便中主要的一種菌門，與畜禽的粗飼料轉(zhuǎn)化率有關[28]，家禽的飼料配方中有谷物等粗飼料，厚壁菌門對其營養(yǎng)消化吸收有幫助作用。環(huán)境中高濃度氨氣通過增加雛肉雞盲腸中柔膜菌門含量，阻礙厚壁菌門在盲腸的定植，降低雛肉雞對粗飼料的消化吸收能力，從而導致雛肉雞生長發(fā)育遲緩。柴胡皂苷在飼料中的添加能在一定程度上維持腸道菌群的平衡，以抵抗氨氣應激。

腸球菌科在宿主抵抗外界環(huán)境輻射中發(fā)揮重要作用，能夠保護造血系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)[29]。乳酸細菌科為常見益生菌科，具有改善胃腸道功能、提高食物消化率、控制內(nèi)毒素、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長等作用[30]。在科水平上，環(huán)境中高濃度氨氣通過減少盲腸菌群中益生菌（乳酸細菌科、腸球菌科及厚壁菌門下一個未知科）的數(shù)量，打破微生物平衡，降低機體對外界應激源的抵抗力，損傷機體。

此外，環(huán)境中高濃度氨氣還導致雛肉雞盲腸菌群中有益菌屬（瘤胃菌屬和毛螺菌屬）豐度減少，導致一些潛在的致病菌豐度相對增加，打破雛肉雞腸道菌群平衡，從而對雛肉雞機體造成損傷。瘤胃球菌屬是雞糞便中常見的菌，具有降解黏蛋白為動物提供碳和能量的功能[28]，氨氣應激通過抑制該菌屬的定植減少雛肉雞對蛋白質(zhì)的消化吸收，以抑制雛肉雞生長。通過上述分析，氨氣柴胡組微生物樣本豐度更接近空白組，表明柴胡皂苷對環(huán)境高濃度氨氣造成的腸道菌群紊亂有一定緩解作用。

“刺激-反應”理論是解釋動物行為學變化最簡單的理論，動物某些非正常行為的出現(xiàn)可能暗示了消極環(huán)境因素的存在。研究表明，現(xiàn)代育種技術的革新，經(jīng)選育的商品肉雞在整個生長過程中休息（趴臥）更多，以期通過減少活動量及能量消耗達到快速生長[31-32]。本試驗中，高濃度氨氣環(huán)境下肉雞的趴臥頻次顯著減少，梳羽、抖身、展翅和走動的頻次顯著增加，表現(xiàn)為躁動不安，異常興奮。從動物福利的角度，結果表明肉雞在適應高濃度氨氣環(huán)境遇到困難，使得肉雞的品種特性行為不能正常發(fā)揮，嚴重降低了肉雞的動物福利，不利于動物健康和生存。前人研究結果與本試驗一致，雞舍內(nèi)高濃度的氨氣阻礙肉雞正常行為的表達，臨床表現(xiàn)為好動、焦躁[31,33]。柴胡皂苷能在一定程度輔助肉雞抵抗惡劣環(huán)境的應激，對保障肉雞動物福利方面具有積極的作用。

神經(jīng)生物學研究表明，大腦結構中，海馬區(qū)既是應激反應的高級調(diào)節(jié)中樞，也是應激損傷靶區(qū)[34-35]。神經(jīng)遞質(zhì)主要由神經(jīng)系統(tǒng)分泌和釋放，能反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動和疾病狀態(tài)[36]。DA被認為與腦組織興奮和警覺性的保持相關。G.P.Chrousos研究表明，應激大鼠越興奮，腦內(nèi)DA釋放量越多，應激初期達到峰值，隨著時間的推移或者應激超負荷時，其功能下降[37]。5-HT主要參與情緒和沖動控制，前額葉皮質(zhì)、海馬等腦區(qū)5-HT在急性和慢性應激均被發(fā)現(xiàn)增加[38]。本試驗中，高濃度氨氣通過紊亂DA和5-HT系統(tǒng)功能危害雛肉雞神經(jīng)系統(tǒng)，雛肉雞難以通過自身調(diào)節(jié)適應應激，表現(xiàn)出異常興奮、驚恐癥狀[39]，進一步影響雛肉雞正常生理生命活動，抑制其生長性能。柴胡皂苷的干預能在一定程度平衡神經(jīng)系統(tǒng)的應激狀態(tài)，改善雛肉雞應激癥狀，抵抗氨氣應激，推測與其鎮(zhèn)靜作用密切相關。

4 結論

①環(huán)境高濃度氨氣通過影響腸道菌群β多樣性，并在門、科及屬水平上造成差異，進而打破腸道菌群的平衡，損害肉雞健康。柴胡皂苷的干預能在一定程度調(diào)節(jié)并維持氨氣應激下雛雞腸道菌群的平衡，抵抗氨氣對雛雞造成的應激損傷。

②環(huán)境高濃度氨氣通過引起雛肉雞腦部海馬區(qū)NE和5-HT激增，DA顯著性降低，從而損害雛肉雞的神經(jīng)系統(tǒng)，異常興奮、驚恐，表現(xiàn)為行為學好動焦躁，進一步影響雛肉雞正常的生理活動，損害雛肉雞的健康。柴胡皂苷的干預能對高濃度氨氣引起的去甲腎上腺素激增有一定的緩解作用，通過發(fā)揮其鎮(zhèn)靜作用促使雛肉雞抵抗氨氣應激。