任毓輝 聶 帥 彭春雪 楊 玲 沈海龍

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040）

紅松（）為松科（Pinaceae）松屬（）高大喬木樹種，是我國長白山和小興安嶺林區(qū)紅松闊葉林的建群種，既是珍貴用材樹種，也是優(yōu)質(zhì)食用堅果生產(chǎn)樹種，是具有很高經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值的珍貴鄉(xiāng)土樹種。紅松良種選育工作已經(jīng)取得一些成績，獲得了一些優(yōu)良種質(zhì)材料，包括雜交育種材料。這些少量的優(yōu)良種質(zhì)材料需要經(jīng)過規(guī)?；瘮U(kuò)繁，才能滿足造林需求，而體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)可以利用少量繁殖材料短時間內(nèi)擴(kuò)繁大量苗木，是實現(xiàn)這個目的的理想途徑。紅松組織培養(yǎng)最早的報道是1962年Lee等的胚培養(yǎng)、1986 年Kim 等獲得愈傷組織、1978 年黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所獲得不定芽，而最早的胚狀體（體胚）是1992年東北林業(yè)大學(xué)所獲得，但只到球形的原始階段，未獲得進(jìn)一步發(fā)育。2005年申曉輝等報道獲得紅松胚性愈傷組織，2017 年高芳等對紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基類型、糖源濃度和植物生長調(diào)節(jié)劑組合及外植體取材部位等進(jìn)行了篩選，隨后科研人員對紅松體胚發(fā)生的外植體及其預(yù)處理技術(shù)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和超低溫保存技術(shù)、體胚成熟促進(jìn)和體胚的生理生化特性等進(jìn)行了系統(tǒng)研究?？傮w來看，目前紅松體胚發(fā)生已經(jīng)取得重大進(jìn)步，但是在胚性愈傷組織增殖過程中的植物生長調(diào)節(jié)劑組合、碳源種類和濃度尚有很大改進(jìn)空間，合適的增殖周期尚未確立，生理生化特性尚不明晰。因此，本研究對紅松胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基中的碳源類型、生長調(diào)節(jié)劑濃度和種類、增殖培養(yǎng)周期以及增殖中的胚性愈傷組織生理變化進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為優(yōu)化紅松體胚發(fā)生體系提供參考。

1 材料與方法

1.1胚性愈傷組織材料及增殖保存方法

以3 月齡的紅松1-100 號細(xì)胞系為試材。增殖基本培養(yǎng)基在方案上微調(diào)：mLV 添加2 mg·L2，4-D，0.5 mg·L6-BA，25 g·L蔗糖，0.5 g·L酸水解絡(luò)蛋白，0.5 g·L-谷氨酰胺，4 g·L結(jié)冷膠。所有培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)節(jié)pH 為5.8，121 ℃高壓滅菌30 min。在（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)，2周繼代1次。

1.2增殖培養(yǎng)的激素濃度效應(yīng)研究

取胚性愈傷組織試材接種到含以下不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中。處理1，2 mg·L2，4-D+0.5 mg·L6-BA；處理2，1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA；處理3，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA；處理4，1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA；處理5，無激素。每個處理重復(fù)5 次。激素外增殖基本培養(yǎng)基其他成分和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)14 d 后收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測定。

1.3增殖培養(yǎng)的碳源效應(yīng)研究

取胚性愈傷組織試材接種到以下4 種不同碳源的增殖培養(yǎng)基上。處理6，25 g·L蔗糖；處理7，25 g·L麥芽糖；處理8，25 g·L果糖；處理9，25 g·L葡萄糖。每個處理重復(fù)5 次。碳源外增殖基本培養(yǎng)基其他成分和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)14 d后收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測定。

1.4增殖培養(yǎng)的增殖周期效應(yīng)研究

取紅松胚性愈傷組織試材接種至增殖培養(yǎng)基中，設(shè)定增殖培養(yǎng)周期為以下2 種：7 d 和14 d。每個處理重復(fù)5 次。增殖基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同1.1。在增殖培養(yǎng)第7和第14天收集材料進(jìn)行體胚分化培養(yǎng)和生理指標(biāo)測定。

1.5體胚分化培養(yǎng)

將經(jīng)過不同增殖培養(yǎng)處理的胚性愈傷組織接種到體胚分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚分化。分化培養(yǎng)基基于Klimaszewska 等的方案：mLV+80 μmol·LABA+1.2%結(jié)冷膠+0.2 mol·L蔗糖，pH=5.8。黑暗中培養(yǎng)8 周后統(tǒng)計發(fā)生的體胚數(shù)量。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計每克胚性愈傷組織鮮質(zhì)量的體胚發(fā)生數(shù)量，計算公式如下：

1.6生理指標(biāo)測定

將經(jīng)過不同增殖培養(yǎng)處理的胚性愈傷組織接種到相應(yīng)類型的增殖培養(yǎng)處理組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取材進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按樣本鮮質(zhì)量計算），采用蒽酮比色法測定可溶性糖及淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按照蛋白濃度計算），采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法測定SOD 活性（按照蛋白濃度計算），愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性（按照蛋白濃度計算），過氧化氫法測定CAT 活性（按照蛋白濃度計算）。每個處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)分別收集0.5 g的材料。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003 進(jìn)行統(tǒng)計處理，利用SPSS19.0 軟件進(jìn)行多重比較（Duncan’s）和方差分析。顯著性差異水平=0.05。最后用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1增殖培養(yǎng)的激素濃度對體胚產(chǎn)量的影響

增殖培養(yǎng)基中不同激素濃度處理下的紅松胚性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)均有體胚發(fā)生，但不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑組合顯著影響紅松體胚產(chǎn)量（<0.05）。其中，在1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA濃度處理下體胚產(chǎn)量最高，為166 個·g，在2 mg·L2，4-D+0.5 mg·L6-BA 濃度濃度下體胚為127 個·g。而激素濃度為0的處理組合中體胚產(chǎn)量最低，為13個·g（見圖1）。

2.2增殖培養(yǎng)的碳源效應(yīng)

增殖培養(yǎng)基中不同碳源處理下紅松胚性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)后，碳源為蔗糖的處理分別與碳源為麥芽糖、果糖、葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量之間差異顯著（<0.05），但是碳源為麥芽糖、果糖和葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量之間差異相互不顯著。其中碳源為蔗糖的處理體胚產(chǎn)量最高為127 個·g，其次是碳源為麥芽糖的處理（80 個·g）。碳源為葡萄糖的處理體胚產(chǎn)量最低為53 個·g。碳源為蔗糖的處理相較于碳源為葡萄糖的處理其體胚產(chǎn)量增加了75 個·g（見圖1）。

2.3增殖培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)周期效應(yīng)

增殖培養(yǎng)中不同增殖培養(yǎng)周期處理下紅松胚性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)后，增殖培養(yǎng)14 d 的處理和增殖培養(yǎng)7 d 的處理其體胚產(chǎn)量之間差異顯著（<0.05）。增殖培養(yǎng)7 d 的處理體胚產(chǎn)量最低為47 個·g。增殖培養(yǎng)14 d 處理的體胚產(chǎn)量遠(yuǎn)高于增殖培養(yǎng)7 d 的處理，約為增殖培養(yǎng)7 d 處理體胚產(chǎn)量的2.7倍（見圖1）。

圖1 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松體胚產(chǎn)量的影響處理1. 2 mg·L-1 2，4-D+0.5 mg·L-1 6-BA、蔗糖、繼代14 d；處理2.1 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-1 6-BA、處理3. 2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA；處理4.1 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 6-BA；處理5.無激素；同一測定指標(biāo)上不同字母代表P<0.05差異顯著；下同F(xiàn)ig.1 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on somatic embryo yield of P.koraiensisTreatment 1. 2 mg·L-1 2，4-D+0.5 mg·L-1 6-BA，sucrose，subculture for 14 d；Treatment 2. 1 mg·L-1 2，4-D+0.25 mg·L-1 6-BA；Treat?ment 3. 2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA；Treatment 4. 1 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 6-BA；Treatment 5. No hormone；Different letters on the same measurement index represent P<0.05，the same as below

2.4不同增殖培養(yǎng)處理方式的生理特性

在紅松愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中，不同增殖培養(yǎng)方式顯著影響紅松胚性愈傷組織細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（<0.05）。在不同激素處理中，無激素處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（1.54 g·g），1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA 處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（2.50 g·g）。在不同的碳源類型中，碳源為蔗糖的處理與其他碳源處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（<0.05）。碳源為葡萄糖的處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為0.77 g·g。在不同增殖培養(yǎng)周期中，增殖培養(yǎng)7 d的處理可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（2.75 g·g）為增殖培養(yǎng)14 d處理的1.14倍。在所有增殖培養(yǎng)類型中，對照處理淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（6.53 g·g）。在不同激素處理中，1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA，1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間差異不顯著。在不同的碳源類型中，碳源為葡萄糖的處理中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（2.05 g·g），約為對照（碳源為蔗糖）處理淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/3（圖2～3）。

圖2 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble sugar mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

圖3 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble starch mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

2.4.2 可溶性蛋白分析

不同的激素處理的紅松胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著（=0.199）。其質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在0.81 mg·g左右。1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為0.67 mg·g左右，與對照的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相似。在不同的碳源類型中，碳源為麥芽糖的處理分別與碳源為蔗糖和果糖的處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，與碳源為葡萄糖的處理差異則不顯著。碳源為麥芽糖的處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為0.96 mg·g（見圖4）。

圖4 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on soluble protein mass fraction in embryogenic callus of P.koraiensis

在紅松愈傷組織增殖過程中，不同增殖培養(yǎng)方式對紅松愈傷組織CAT、POD、SOD 活性差異顯著（<0.05）。在不同激素類型中，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理CAT 活性最高（129.70 μmol·min·g），相較于對照增加了約3 倍（見圖5）。1 mg·L2，4-D+0.25 mg·L6-BA處理POD活性最高（2 157.60 U·mg），其次是2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理POD 活性（1 968.93 U·mg）（見圖6）。SOD 活性與POD 的活性趨勢相似，2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理SOD 活性最高（612.93 U·mg），其次是2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理SOD活性（601.99 U·mg）（見圖7）。在不同的碳源類型中，碳源為蔗糖的處理CAT 活性與其他碳源類型處理差異顯著（<0.05），POD 和SOD 活性與碳源為麥芽糖的處理差異不顯著，與碳源為果糖的處理差異顯著（<0.05）。在不同增殖培養(yǎng)周期中，增殖培養(yǎng)7 d 的處理CAT 活性最高（229.79 μmol·min·g）相較于對照處理增加了6倍。

圖5 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織中CAT活性的影響Fig.5 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on CAT activity in embryogenic callus of P.koraiensis

圖6 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織中POD活性的影響Fig.6 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on POD activity in embryogenic callus of P.koraiensis

圖7 激素、碳源類型和增殖培養(yǎng)周期對紅松胚性愈傷組織中SOD活性的影響Fig.7 Effects of hormones，carbon source types and proliferation culture cycle on SOD activity in embryogenic callus of P.koraiensis

3 討論

3.1增殖培養(yǎng)基中的激素濃度對體胚發(fā)生的影響

在植物組織培養(yǎng)過程中，植物生長素和細(xì)胞分裂素是植物離體培養(yǎng)所必須的激素，生長素和細(xì)胞分裂素的不同比值和類型不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和生長，而且能控制細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生。在長白落葉松（）中研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間過長時，會造成無法正常增殖的現(xiàn)象。在增殖階段應(yīng)該及時去掉或降低2，4-D濃度，這樣既有利于胚性愈傷組織的增殖，也有利于后期更多的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化為胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)。此外，有研究表明，在愈傷組織增殖階段，用NAA 代替2，4-D 更有利于以后體胚的發(fā)生，長時間培養(yǎng)在含2，4-D的培養(yǎng)基上易造成體細(xì)胞胚成熟能力的喪失。本研究在培養(yǎng)基中添加1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理比添加2 mg·LNAA+0.5 mg·L6-BA 處理效果好，同時添加NAA 效果比添加2，4-D 的效果更好，分別印證了這些觀點。我們的研究表明，在1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理組合下獲得最多的體胚產(chǎn)量（166 個·g），同時該處理下愈傷組織中CAT 活性較低，POD 活性較高。有研究指出，在細(xì)胞脫分化和胚的早期發(fā)育過程中，CAT 活性低，而POD 活性高，這可能是不同時期的過氧化氫由不同酶來催化清除，使生物抗氧化系統(tǒng)處在一個動態(tài)平衡中。此外，Marco的研究指出，POD活性與細(xì)胞壁的松動、延伸、和交聯(lián)有關(guān)，它們調(diào)控細(xì)胞壁的可塑性，影響細(xì)胞的伸長生長和細(xì)胞分裂速度。說明1 mg·LNAA+0.25 mg·L6-BA 處理POD 活性促進(jìn)細(xì)胞分裂有助于體胚發(fā)生。這與詹園鳳等在大蒜（）體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)POD 對體胚誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用的報道相似。

3.2增殖培養(yǎng)基中的碳源對體胚發(fā)生的影響

碳源不僅為培養(yǎng)物的生長和發(fā)育代謝提供所需的能量和底物，而且調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透勢。在植物組織培養(yǎng)中，蔗糖是最常用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑。在培養(yǎng)基中添加蔗糖有利于體細(xì)胞胚干物質(zhì)的積累，對促進(jìn)體胚發(fā)生尤其是子葉胚的形成發(fā)揮了重要的作用。在本研究中，碳源為蔗糖的處理體胚產(chǎn)量最高（127 個·g），同時該處理下糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于碳源為葡萄糖、麥芽糖和果糖的處理。說明碳源為蔗糖的處理中積累了體胚發(fā)生所需要的充足能量，為進(jìn)一步的體胚發(fā)生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時，碳源為蔗糖處理中CAT 活性最低相較于其他碳源處理，而POD 活性最高。有報道指出，CAT 活性與植物抗逆性有關(guān)，與植物老化也有一定的關(guān)系，在老化的組織中其活性最強(qiáng)。一般認(rèn)為，CAT 活性與器官代謝強(qiáng)弱有關(guān)，代謝強(qiáng)，產(chǎn)生的過氧化氫副產(chǎn)物就多，CAT 活性相對較高。而本研究中CAT 活性低說明愈傷組織還尚未老化，生長狀態(tài)良好。此外，在愈傷組織細(xì)胞存在活性氧和自由基時，SOD活性會迅速增加消除此類物質(zhì)避免細(xì)胞受到傷害，培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)SOD 活性在體胚發(fā)生早期迅速增加，說明SOD 可能對體胚發(fā)生有促進(jìn)作用。而碳源為蔗糖的處理中SOD 活性相對較高，說明有利于細(xì)胞正常分裂和分化從而促進(jìn)體胚發(fā)生。綜上所述，蔗糖為紅松愈傷組織體胚發(fā)生的最適碳源。

3.3增殖培養(yǎng)周期對體胚發(fā)生的影響

適宜的增殖培養(yǎng)周期，對于保持愈傷組織良好的生長狀態(tài)和促進(jìn)其代謝十分有利。細(xì)胞增殖及代謝物的合成都需要大量能量和營養(yǎng)成分，在培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分沒有完全耗盡的情況下，及時將細(xì)胞轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，為細(xì)胞迅速增殖創(chuàng) 造 條 件。秦 彩 云 等在 青 海 云 杉（）的研究中發(fā)現(xiàn)，增殖培養(yǎng)周期為14 d 的愈傷組織既能保持胚性，又能獲得較大的增殖量，而在海岸松（）的研究中發(fā)現(xiàn)每周1次的繼代培養(yǎng)，使老化效應(yīng)最小化，有利于海岸松體細(xì)胞胚的早期發(fā)育。在本研究中，增殖培養(yǎng)周期為14 d獲得的體胚產(chǎn)量最多（127個·g）。增殖培養(yǎng)周期為7 d 的處理和增殖培養(yǎng)周期為14 d 的處理中淀粉、可溶性糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著，說明其都具有體胚發(fā)生所需要的能量物質(zhì)。Peng 等的研究說明喪失胚性愈傷組織細(xì)胞內(nèi)可能積累過高的HO從而喪失胚性。此外，Cui 等對寧夏枸杞（）體胚發(fā)生的研究中也認(rèn)為，適量的H0濃度對寧夏枸杞體胚發(fā)生有促進(jìn)作用，過高的HO濃度對寧夏枸杞體胚發(fā)生則有抑制作用。本研究中增殖培養(yǎng)7 d 的處理CAT 活性顯著高于增殖培養(yǎng)14 d 的處理中CAT 活性，可能是HO等代謝產(chǎn)物增多，產(chǎn)生毒害作用，從而喪失胚性。由此可以看出增殖培養(yǎng)周期過短，不利于后期體胚的發(fā)育和成熟。與此同時，增殖培養(yǎng)周期過短，提高成本加大了工作量，隨著增殖培養(yǎng)次數(shù)的增加，變異率也會提高，且體胚發(fā)生潛力逐漸下降甚至消失。

4 結(jié)論

在1 mg·LNAA 和0.25 mg·L6-BA 組合下，碳源為蔗糖，增殖培養(yǎng)周期為14 d 所獲得的紅松體胚產(chǎn)量最多（166個·g）。在胚性愈傷組織增殖的過程中，儲藏物質(zhì)為紅松的體胚發(fā)生提供充足的能量來源，為其體胚發(fā)生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；CAT 活性過高不利于愈傷組織體胚發(fā)生，可能是HO等代謝產(chǎn)物增多，產(chǎn)生毒害作用。