胡景濤，李彥杰，段艷艷，阮 宇，顧 欣，肖國(guó)生

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404100）

作為一種固著生物，植物的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)刻受到各種外界環(huán)境條件的影響。面對(duì)各種逆境脅迫，植物已經(jīng)進(jìn)化出包括形態(tài)、細(xì)胞、分子及生理生化水平在內(nèi)的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制予以應(yīng)答[1-3]。作為一種調(diào)節(jié)蛋白，轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）通過調(diào)控目的基因的表達(dá)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

HD-Zip （homeodomain leucine zipper）蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能差異可以進(jìn)一步將其分為4個(gè)亞家族（HD-Zip I～I(xiàn)V）[6]。植物HD-Zip I蛋白僅包含C-端的同源異型結(jié)構(gòu)域（Homeodomain,HD）和緊密相連的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（leucine zipper，LZ），它們廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物脅迫應(yīng)答等過程[7]。研究人員已經(jīng)對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativa L.）、番茄（Solanum lycopersicum Mill.）、向日葵（Helianthus annuus L.）等植物中的HD-Zip I蛋白進(jìn)行了家族成員鑒定及相關(guān)基因的功能研究[8-11]。擬南芥ATHB12和ATHB7都受到ABA和干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且ATHB12的異源表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)NaCl的耐受能力[12-13]。水稻Oshox22基因影響內(nèi)源ABA的合成，并通過依賴ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控水稻的干旱和鹽脅迫耐受能力[14]。向日葵Hahb-4基因受干旱和外源ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)該基因的擬南芥植株對(duì)缺水脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受能力[4]。向日葵HaHB1基因的異源表達(dá)可提高擬南芥對(duì)低溫的耐受能力，并上調(diào)轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)抗凍相關(guān)基因的表達(dá)[15]。番茄SlHB2基因的下調(diào)表達(dá)則可誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)并提高植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受能力[7]。玉米HD-Zip I亞家族成員Zmhdz10的表達(dá)受外源ABA和鹽脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，該基因的過表達(dá)可明顯提高水稻和擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫耐受能力[16]。綜上可見,植物HD-ZIP I亞家族蛋白在激素響應(yīng)及應(yīng)對(duì)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，桑樹（Morus notabilis L.）在我國(guó)已有幾千年的栽種歷史。桑葉可養(yǎng)蠶，桑樹皮可作造紙?jiān)希９瓤甚r食也可以加工成果酒、果汁和果醬，桑樹的根、莖、葉和桑果還具備一定的藥用價(jià)值。此外，桑樹對(duì)干旱、鹽堿及水淹等逆境脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力，是木本植物抗逆境研究的優(yōu)良材料。本研究從基因組水平對(duì)桑樹HD-ZIP I亞家族基因進(jìn)行了鑒定和分析，對(duì)家族蛋白的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系及基因結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析。利用 RNA-seq數(shù)據(jù)研究了HD-ZIP I亞家族基因的組織表達(dá)模式，通過qPCR檢測(cè)了該家族基因在激素及非生物脅迫處理后的表達(dá)情況。為進(jìn)一步闡明桑樹HD-ZIP I亞家族基因的生物學(xué)功能和抗逆基因的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桑樹HD-Zip I亞家族成員的鑒定與分析

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/tools/index.jsp）獲取擬南芥HD-Zip I蛋白序列[17]，并以此作為查詢序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）及桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://morus.swu.edu.cn/morusdb/）進(jìn)行Blast同源搜索，下載桑樹HD-Zip I亞家族的基因及氨基酸序列。所有序列均通過InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）、NCBI CDD （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART （http://smart.embl-heidelberg.de）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用MEME Version 5.4.1（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)蛋白保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，基序數(shù)量設(shè)為10，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。桑樹HD-Zip I蛋白的多序列分析由ClustalW及DNAMAN 9軟件完成，系統(tǒng)進(jìn)化分析采用鄰接法（Neighbor-joining method,NJ）由MEGA 7.0完成，bootstrap值設(shè)置為1 000[18]。蛋白分子量、等電點(diǎn)等均由在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算獲得[19]。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析在WoLFPsort（https://wolfpsort.hgc.jp/）網(wǎng)站中進(jìn)行?；虻膬?nèi)含子與外顯子分布由Tbtool （windows-x64_1_068）軟件繪制，并利用Tbtool軟件從桑樹基因組數(shù)據(jù)中獲取HD-Zip I基因起始密碼子（ATG）上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，在plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用Tbtool軟件進(jìn)行可視化[20]。

1.2 RNA-seq分析

利用桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中根、枝條、冬芽、雄花和葉的RNA-seq數(shù)據(jù)，分析桑樹HD-Zip I基因的組織表達(dá)模式。相關(guān)基因的RPKM值經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后，通過Tbtool軟件繪制熱圖。

1.3 桑樹HD-Zip I亞家族基因逆境脅迫表達(dá)分析

1.3.1 材料處理及取樣 桑樹品種育711扦插苗于25 ℃溫室條件下（光照16 h，黑暗8 h）生長(zhǎng)45 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的單株進(jìn)行處理。將100 μmol·L?1脫落酸（ABA）溶液均勻噴施于幼苗葉面進(jìn)行激素處理，用 200 mmol·L?1的 NaCl對(duì)樹苗進(jìn)行鹽處理，拔出幼苗并洗掉根上的泥土置于室溫進(jìn)行脫水處理，淹水至樹苗地上部分5 cm處作淹水處理，以正常澆水樹苗為對(duì)照（CK）。對(duì)以上各處理的材料于處理后0、3、6、12、24 h摘取相同發(fā)育時(shí)期的葉片，利用液氮冷凍后置于–80 ℃冰箱備用，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)取3株樹苗葉片。

1.3.2 qRT-PCR分析 RNAiso plus（TaKaRa）用于材料總RNA提取，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega）試劑盒用于合成cDNA。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性定量分析引物，以ACTIN基因作為內(nèi)標(biāo)基因（表1）。定量PCR體系（10 μL）中包含 qPCR Mix（2×GoTaq?,5.0 μL）、引物混合物（10 μmol·L?1,0.5 μL）、模板 cDNA（1.0 μL）、Rnase-free H2O（3.5 μL）。在 eppendorf熒光定量?jī)x上進(jìn)行定量分析（95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40次循環(huán)），3次技術(shù)重復(fù)，采用2???CT公式計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，使用Origin 9.0繪制柱形圖。

表1 桑樹HD-Zip I基因qRT-PCR分析引物Table 1 Primers used in qRT-PCR analysis of HD-Zip I genes in mulberry

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹HD-Zip I亞家族成員的序列獲取及鑒定

經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析并排除冗余序列后，共獲得14個(gè)桑樹HD-Zip I成員，分別命名為MnHDZip 1～MnHD-Zip 14（表2）。從表2可以看出：桑樹HD-Zip I蛋白的氨基酸數(shù)及其分子量變化較大，分別介于173～351 aa和19 927.40～39 913.22；等電點(diǎn)pI則介于4.54～8.88，弱酸性蛋白偏多。平均親水性值則位于?1.040～?0.657之間。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，桑樹HD-Zip I蛋白主要定位于細(xì)胞核。HD-Zip I亞家族蛋白的不同特點(diǎn)及成員間的差異可能預(yù)示著該亞家族轉(zhuǎn)錄因子在桑樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。

表2 桑樹HD-Zip I家族基因及其編碼蛋白信息Table 2 The detailed information of HD-Zip I members of mulberry

2.2 桑樹HD-Zip I亞家族成員的多序列比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系分析

蛋白多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑樹HD-Zip I亞家族成員均含有HD-Zip家族轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域HD（Homeomain）和LZ（leucine zipper）。其中，HD結(jié)構(gòu)域的序列高度保守，LZ結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基則相對(duì)多變（圖1）。

圖1 桑樹 HD-Zip I 蛋白 Homeodomain 及l(fā)eucine zipper 結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignments of Homeodomain and leucine zipper domains

為分析桑樹HD-Zip I亞家族成員的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建了擬南芥和桑樹該家族蛋白的進(jìn)化樹。參考擬南芥該家族成員的進(jìn)化關(guān)系，將桑樹HD-Zip I亞家族成員分為α、β、γ、δ、ε、φ 6個(gè)分枝，其中，MnHD-Zip 3和MnHD-Zip 4屬于α分枝，MnHD-Zip 5、MnHDZip 2、MnHD-Zip 1、MnHD-Zip 7 和MnHD-Zip 6屬于β分枝，MnHD-Zip 8、MnHD-Zip 12和MnHD-Zip 14屬于γ分枝，MnHD-Zip 11和MnHD-Zip 13屬于φ分枝，MnHD-Zip 10和MnHD-Zip 9分別屬于ε和δ分枝（圖2）。

圖2 桑樹與擬南芥 HD-Zip I 家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of HD-Zip I family in mulberry and Arabidopsis

2.3 桑樹HD-Zip I家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白基序分析

蛋白motif分析結(jié)果表明：桑樹HD-Zip I亞家族蛋白檢測(cè)出的10個(gè)基序中，motif 1和motif 2為該家族蛋白共有基序，進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，motif 1主要參與構(gòu)成桑樹MnHD-Zip I蛋白的Homeomain結(jié)構(gòu)域，motif 2則是leucine zipper結(jié)構(gòu)域的主要組成部分。桑樹HD-Zip I家族內(nèi)各成員所含有的motif種類及數(shù)量存在較大差異，如MnHD-Zip 3和MnHD-Zip 4共檢測(cè)出7個(gè)基序，MnHD-Zip 14僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)基序；同一進(jìn)化分枝內(nèi)各轉(zhuǎn)錄因子所含有的基序種類及數(shù)量則表現(xiàn)出較高的相似性，如α分枝的2個(gè)成員均含有7個(gè)相同的motif，φ分枝成員均含有motif 1、motif 2和motif 3（圖3A）。

通過比較MnHD-Zip I基因的mRNA和基因組序列，獲得該家族基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖3B）。從圖3B可以看出：桑樹HD-Zip I家族成員中，同一進(jìn)化分枝成員具有相似的外顯子/內(nèi)含子數(shù)量及分布規(guī)律，其中，β分枝的MnHDZip 1基因獨(dú)具4個(gè)外顯子，該分枝的其余成員則均只含有3個(gè)外顯子；α和δ分枝的所有成員都含有3個(gè)外顯子；γ分枝成員中，MnHD-Zip 14基因有3個(gè)外顯子，其余兩個(gè)成員同ε分枝成員都只含有2個(gè)外顯子；φ分枝成員的外顯子數(shù)量最少，均只含有1個(gè)外顯子。

圖3 桑樹HD-Zip I家族蛋白保守基序（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）分析Fig.3 Analysis of conserved motifs（A）and exon–intron organization（B）of MnHD-Zip I genes

2.4 桑樹HD-Zip I家族基因的啟動(dòng)子元件分析

為了進(jìn)一步明確桑樹HD-Zip I家族基因啟動(dòng)子區(qū)域的相關(guān)順式作用元件，探索該家族基因?qū)に丶澳婢车捻憫?yīng)機(jī)制，利用PlantCARE對(duì)該家族基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析，結(jié)果（表3）表明：桑樹14個(gè)HD-Zip I基因的啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)出參與激素及非生物脅迫響應(yīng)的順式作用元件共計(jì)11種。其中，激素響應(yīng)元件6種，即ABRE（ABA響應(yīng)元件）、P-box（赤霉素響應(yīng)元件）、TCA-element（水楊酸響應(yīng)元件）、CGTCA-motif（茉莉酸響應(yīng)元件）、TGACG-motif（茉莉酸響應(yīng)元件）和AuxRR-core（生長(zhǎng)素響應(yīng)元件）；非生物脅迫響應(yīng)元件5種，即TC-rich repeats（防御和脅迫響應(yīng)元件）、LTR（低溫脅迫響應(yīng)元件）、ARE（厭氧誘導(dǎo)元件）、MBS（干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)）及WUN-motif（損傷反應(yīng)元件）。

表3 桑樹HD-Zip I家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析Table 3 Analysis of cis acting elements in HD-Zip I gene’s promoter region

桑樹HD-Zip I家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類存在明顯差異，但不同分枝成員的元件分布則具有一定的相似性，如β分枝成員啟動(dòng)子均不含有P-box元件，γ和φ分枝成員的啟動(dòng)子區(qū)都沒有MBS元件。從數(shù)量上看，MnHD-Zip 9基因啟動(dòng)子區(qū)擁有的元件數(shù)最多（18個(gè)），MnHD-Zip 2、 MnHD-Zip 4、 MnHD-Zip 6和MnHD-Zip 10的啟動(dòng)子所含元件最少（9個(gè)）。從順式作用元件的種類看，ABRE元件數(shù)量最多，除MnHD-Zip 6外的13個(gè)MnHD-Zip I基因啟動(dòng)子區(qū)共含有36個(gè)ABRE；ARE元件次之，在12個(gè)MnHD-Zip I基因啟動(dòng)子區(qū)中共有31個(gè)；AuxRR-core元件最少，僅在MnHD-Zip 2基因啟動(dòng)子區(qū)中出現(xiàn)1次。以上結(jié)果表明，MnHD-Zip I基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件在數(shù)量和種類方面存在明顯差異，預(yù)示該家族基因可能在激素及非生物脅迫響應(yīng)中具有不同的生物學(xué)功能。

2.5 桑樹HD-Zip I家族基因的組織表達(dá)模式分析

為了解桑樹HD-Zip I家族基因的組織表達(dá)模式，對(duì)桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中根、枝條、冬芽、雄花和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明：從組織特異性方面看，大部分桑樹HD-Zip I家族基因在雄花和枝條中的表達(dá)量相對(duì)較高，根和葉片中大部分基因的表達(dá)量則相對(duì)較低；從進(jìn)化分枝方面看，同一分枝基因具有相似的組織特異性表達(dá)。β分枝的5個(gè)成員中，MnHD-Zip 2和MnHD-Zip 6在根、枝條、冬芽、雄花和葉片中均呈現(xiàn)高水平表達(dá)，MnHD-Zip 5在除葉片外的器官/組織中也有較高水平的表達(dá)，預(yù)示該分枝內(nèi)的基因在桑樹的不同組織/器官生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。α分枝中2個(gè)成員的組織/器官特異性表達(dá)呈現(xiàn)高度的一致性，均在雄花和枝條中高水平表達(dá)；γ分枝中，MnHD-Zip 8和MnHD-Zip 14在雄花和枝條中的轉(zhuǎn)錄水平也都較高，說明α和γ分枝的4個(gè)基因在桑樹雄花發(fā)育及枝條生長(zhǎng)方面具有潛在調(diào)控功能。此外，φ分枝的MnHD-Zip 13基因分別在雄花、根、枝條和δ分枝的MnHD-Zip 9基因分別在雄花、冬芽中也有較高水平的表達(dá)，暗示它們也在桑樹相應(yīng)組織/器官的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。

圖4 桑樹HD-Zip I家族基因的器官特異性表達(dá)Fig.4 Organ specific expression analysis of MnHD-Zip I genes

2.6 激素處理下的基因表達(dá)分析

為了分析桑樹HD-Zip I家族基因?qū)に氐捻憫?yīng)情況，對(duì)桑樹苗進(jìn)行了ABA處理，以正常澆水桑樹苗為對(duì)照，利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了處理0、3、6、12、24 h后葉片中MnHD-Zip I基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖5）表明：多數(shù)桑樹HDZip I基因并未受到ABA的上調(diào)誘導(dǎo)，甚至很多基因的轉(zhuǎn)錄水平被ABA所抑制。β分枝中，MnHDZip 1、MnHD-Zip 2與MnHD-Zip 5的表達(dá)模式相似，MnHD-Zip 6和MnHD-Zip 7則呈現(xiàn)另一種相似的表達(dá)趨勢(shì)；但ABA處理后，β分枝中所有基因的表達(dá)水平都受到不同程度的抑制。α分枝的MnHD-Zip 3和MnHD-Zip 4基因也具有相似的表達(dá)模式，且其轉(zhuǎn)錄都在3、24 h時(shí)間點(diǎn)被ABA顯著抑制。γ分枝中，MnHD-Zip 8和MnHDZip 12的轉(zhuǎn)錄水平在處理12 h后均達(dá)到對(duì)照的2倍以上，但到24 h后，它們的表達(dá)水平又顯著低于對(duì)照；MnHD-Zip 14基因的表達(dá)則在3、24 h時(shí)間點(diǎn)受到ABA的顯著抑制。φ分枝中，MnHD-Zip 11基因的表達(dá)水平在12 h被顯著上調(diào)，隨后快速下降并顯著低于對(duì)照；MnHD-Zip 13則在處理3 h時(shí)便受到ABA的快速上調(diào)誘導(dǎo)，隨后開始降低直至顯著低于對(duì)照。MnHD-Zip 9基因僅在處理 6 h時(shí)被顯著上調(diào)誘導(dǎo)，3、12、24 h則均被顯著抑制。MnHD-Zip 10基因的表達(dá)在6、24 h也受到ABA的抑制。

圖5 桑樹HD-Zip I家族基因激素處理后的差異表達(dá)分析Fig.5 Temporal differential expression of MnHD-Zip I genes under ABA

2.7 非生物脅迫處理下的基因表達(dá)分析

為分析非生物脅迫對(duì)桑樹HD-Zip I家族基因表達(dá)的影響，對(duì)桑樹苗進(jìn)行了淹水、鹽及脫水處理，以正常澆水桑樹苗為對(duì)照，利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了處理0、3、6、12、24 h后葉片中MnHD-Zip I基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖6）表明：桑樹HD-Zip I亞家族基因均受到3種非生物脅迫不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，且多數(shù)基因的表達(dá)水平在處理后12 h上升至峰值。β分枝的5個(gè)成員中，MnHD-Zip 1基因的轉(zhuǎn)錄水平在脫水脅迫處理后3～24 h的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被顯著誘導(dǎo)上調(diào)；在鹽處理后12 h，該基因的表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)約14倍；MnHD-Zip 5和MnHD-Zip 2基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)與MnHD-Zip 1較相似，且這2個(gè)基因在鹽處理后12 h的表達(dá)水平均有10倍以上的上調(diào)；MnHD-Zip 6和MnHD-Zip 7表達(dá)水平的變化呈另一種相似的趨勢(shì)，且都在鹽處理后12 h出現(xiàn)2倍以上的上調(diào)表達(dá)。α分枝的MnHD-Zip 3和MnHD-Zip 4基因的表達(dá)水平都只在鹽處理后12 h有2倍以上的上調(diào)；處理后24 h，2個(gè)基因的表達(dá)水平又同時(shí)下調(diào)至CK以下。γ分枝中，MnHDZip 8基因在鹽和脫水脅迫處理后6～24 h，其表達(dá)水平都出現(xiàn)2倍以上的上調(diào)誘導(dǎo)，在淹水脅迫3 h時(shí)也顯著上調(diào)誘導(dǎo)；MnHD-Zip 12基因在淹水、鹽和脫水處理后6、12 h也被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；MnHD-Zip 14在鹽處理后12 h顯著上調(diào)，在處理后3、24 h該基因的表達(dá)同時(shí)受到3種非生物脅迫不同程度的下調(diào)誘導(dǎo)。φ分枝中，MnHD-Zip 11在鹽脅迫下全程上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá)，淹水處理后12 h該基因的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照；MnHD-Zip 13基因在鹽處理后12 h被顯著誘導(dǎo)上調(diào)。MnHD-Zip 9基因在脫水脅迫處理后3～24 h表達(dá)水平均顯著誘導(dǎo)上調(diào)。MnHD-Zip 10僅在鹽處理后12 h受到顯著的上調(diào)誘導(dǎo)，在非生物脅迫處理后3、6 h，其表達(dá)量顯著低于CK。

圖6 桑樹HD-Zip I家族基因脅迫處理后的差異表達(dá)分析Fig.6 Temporal differential expression of MnHD-Zip I genes under abioticstresses

3 討論

自桑樹基因組測(cè)序工作完成以來[21-22]，PHR、bHLH、Trihelix、bZIP、MYB、ERF等家族的轉(zhuǎn)錄因子已進(jìn)行過相關(guān)的分析與研究[23-25]，但桑樹HD-Zip I亞家族成員的系統(tǒng)鑒定及其對(duì)淹水等非生物脅迫及激素響應(yīng)的研究還未見報(bào)道。本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)分析、順式作用元件預(yù)測(cè)、基因的組織/器官特異性表達(dá)分析、ABA和淹水等非生物脅迫誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)等，對(duì)桑樹HD-Zip I亞家族基因進(jìn)行了鑒定和研究。通過全基因組分析，本研究共鑒定到14個(gè)桑樹HD-Zip I亞家族基因，與擬南芥、水稻和玉米（Zea mays L.）中同一亞家族基因的數(shù)量相似，但明顯少于蘋果（Malus pumila Mill.）和楊樹（Populus L.）[8-9,26-28]。

根據(jù)氨基酸序列的相似性，桑樹HD-Zip I亞家族蛋白可進(jìn)一步被分為6個(gè)分枝，這一研究結(jié)果同擬南芥、水稻、玉米的研究結(jié)果相似[8-9,26]。從成員分布看，桑樹HD-Zip I亞家族中，β分枝有5個(gè)成員，γ分枝有3個(gè)成員，α和φ分枝各有2個(gè)成員，δ和ε分枝各1有個(gè)成員?？梢?，桑樹該亞家族成員相對(duì)集中在β分枝，而δ和ε分枝成員數(shù)偏少，這與擬南芥中各分枝成員相對(duì)均衡的分布規(guī)律不盡一致[8]。

桑樹HD-Zip I亞家族蛋白含有多個(gè)基序，其中，家族成員共有基序motif 1和motif 2分別參與構(gòu)成該家族蛋白的Homeomain結(jié)構(gòu)域和leucine zipper結(jié)構(gòu)域，說明motif 1、motif 2為桑樹HDZip I亞家族蛋白的特征性基序。此外，同一分枝的成員在所含有的基序種類及數(shù)量方面具有高度的相似性。家族基因結(jié)構(gòu)分析也得出類似的結(jié)論，即桑樹HD-Zip I亞家族中屬于同一分枝的基因具有高度相似的外顯子/內(nèi)含子數(shù)量及分布規(guī)律，這一分析結(jié)果進(jìn)一步印證了桑樹HD-Zip I亞家族蛋白進(jìn)化樹分枝關(guān)系的可靠性。

基因啟動(dòng)子區(qū)域中的不同順式作用元件通常暗示該基因具備對(duì)相應(yīng)激素或者脅迫誘導(dǎo)的響應(yīng)能力[29]。研究發(fā)現(xiàn)，桑樹HD-Zip I亞家族基因的啟動(dòng)子區(qū)存在多種參與激素及非生物脅迫響應(yīng)的順式作用元件，如ABRE（ABA響應(yīng)元件）、MBS（干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)）及WUN-motif（損傷反應(yīng)元件）等，這些元件的大量存在表明桑樹HD-Zip I基因在激素及非生物脅迫響應(yīng)及相關(guān)的生長(zhǎng)調(diào)控方面發(fā)揮著潛在的重要作用。后續(xù)的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，桑樹HD-Zip I亞家族基因的表達(dá)都受到激素和非生物脅迫不同程度的誘導(dǎo)，這一結(jié)果很好地證實(shí)了上述順式作用元件分析所得出的結(jié)論。

研究表明，HD-Zip I亞家族基因的表達(dá)具有組織和器官特異性，通常受到包括干旱、極端溫度及滲透脅迫等外界環(huán)境因素的影響[6]。作為一類植物轉(zhuǎn)錄因子，HD-Zip I蛋白廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物脅迫應(yīng)答等生命過程，包括花序發(fā)育及開花時(shí)間調(diào)節(jié)、側(cè)根發(fā)育調(diào)控、抗逆境脅迫調(diào)節(jié)等[15-16,30-32]。本研究對(duì)14個(gè)桑樹HD-Zip I亞家族基因在根、枝條、冬芽、雄花和葉片中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MnHD-Zip I基因在所檢測(cè)的5個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)。從組織特異性上看，該家族基因主要在雄花及枝條中有相對(duì)較高的表達(dá)量，大部分基因在根和葉片中的表達(dá)量則相對(duì)偏低，這與柑橘（Citrus sinensis cv.Valencia）HD-Zip I基因主要在葉片和花中高表達(dá)的結(jié)果不太一致[33]。但桑樹HD-Zip I基因是否具有與水稻HD-Zip I家族基因相同的花發(fā)育調(diào)控功能還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證[34]。從進(jìn)化樹分枝看，處于同一進(jìn)化分枝內(nèi)的基因具有相似的組織/器官表達(dá)特異性，其中，β分枝的成員在多數(shù)組織/器官中都呈現(xiàn)高水平表達(dá)，暗示該分枝成員在桑樹生長(zhǎng)發(fā)育中具有潛在重要功能；同時(shí)，這一結(jié)果與黃瓜（Cucumis sativus L.）的研究結(jié)果較吻合[35]。

激素及非生物脅迫處理后的表達(dá)模式分析結(jié)果表明，ABA處理對(duì)除 MnHD-Zip 8、MnHD-Zip 9、MnHD-Zip 11-13外的桑樹HD-Zip I亞家族基因的表達(dá)沒有顯著上調(diào)誘導(dǎo)作用，不少成員甚至出現(xiàn)下調(diào)誘導(dǎo)，如β分枝及α分枝的所有基因均在處理后24 h受到明顯下調(diào)誘導(dǎo)，這一結(jié)果與擬南芥、黃瓜、水稻、向日葵和玉米中該家族基因的研究結(jié)果不同[4,8,16,35-38]。研究發(fā)現(xiàn)，與MnHD-Zip 8同屬γ分枝的荔枝LcHB2基因受到乙烯處理的上調(diào)誘導(dǎo)，且該基因在果實(shí)離區(qū)高水平表達(dá)。LcHB2蛋白可與LcCEL2 和LcCEL8基因啟動(dòng)子區(qū)的順式元件結(jié)合并激活這2個(gè)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)果實(shí)脫落[39]。棉花γ分枝蛋白GhHB12則可通過抑制下游GhFT、GhFUL和GhSOC1基因的表達(dá)起到調(diào)控棉花開花時(shí)間的作用[40]。MnHD-Zip 8基因也受到ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，且其在桑樹花器官中也呈現(xiàn)高水平表達(dá)，推測(cè)MnHD-Zip 8基因可能也在桑樹花器官發(fā)育中發(fā)揮相應(yīng)的重要功能。植物HD-Zip I亞家族β分枝的基因中，擬南芥ATHB1和ATHB16分別在葉片細(xì)胞的發(fā)育及株高、花序發(fā)育方面具有重要調(diào)控功能[41-42]，番茄LeHB-1基因則參與調(diào)控花發(fā)育及果實(shí)成熟調(diào)控[10]，說明β分枝成員在植物中發(fā)揮著多方面的發(fā)育調(diào)控功能。本研究結(jié)果表明，桑樹中β分枝成員受到鹽和脫水脅迫的顯著誘導(dǎo)表達(dá)，且在各種器官中也有較廣泛的高表達(dá)，因此，推測(cè)這些基因在桑樹生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中均有潛在的調(diào)控作用。γ分枝中，Oshox22基因的沉默轉(zhuǎn)基因株系具有較高的干旱和鹽脅迫耐受能力[14]，向日葵Hahb-4基因過表達(dá)株系也對(duì)缺水脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受能力[4,11,43]，說明該分支成員在植物非生物脅迫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究中，桑樹γ分枝基因MnHD-Zip 8和MnHD-Zip 12受到鹽、淹水及脫水脅迫的顯著誘導(dǎo)，由此推測(cè)，它們?cè)谏鋺?yīng)對(duì)上述逆境脅迫中具有潛在重要功能?？傮w看，桑樹HD-Zip I亞家族基因受到淹水、鹽和脫水處理的誘導(dǎo)表達(dá)，其中，鹽和淹水處理的誘導(dǎo)作用最明顯。鹽和脫水處理后，大部分MnHD-Zip I基因的表達(dá)水平隨時(shí)間的推移呈逐步升高后再降低的趨勢(shì)，且多數(shù)基因在處理后12 h時(shí)達(dá)到峰值，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能與基因表達(dá)的節(jié)律性存在一定聯(lián)系[40]。

4 結(jié)論

本研究從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出14個(gè)HD-Zip I亞家族基因，這些基因可進(jìn)一步被劃分為6個(gè)進(jìn)化分枝?；蚪Y(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析結(jié)果表明，同一進(jìn)化分枝內(nèi)的桑樹HD-Zip I成員具有結(jié)構(gòu)方面的相似性。RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，MnHD-Zip 2和MnHD-Zip 6基因在根、枝條、冬芽、雄花和葉片中均呈現(xiàn)高水平表達(dá)，MnHDZip5、MnHD-Zip1和MnHD-Zip 7也在多數(shù)器官中具有較高的表達(dá)水平。激素處理后的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，除MnHD-Zip 8、MnHD-Zip 9、MnHDZip 11、MnHD-Zip 12和MnHD-Zip 13外，其余MnHD-Zip I基因的表達(dá)水平均受到ABA不同程度的抑制。非生物脅迫處理后的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，桑樹HD-Zip I亞家族基因均受到3種非生物脅迫不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，其中，γ分枝基因MnHDZip 8受到鹽和脫水脅迫誘導(dǎo)后大幅度上調(diào)表達(dá)，MnHD-Zip 12也受到鹽脅迫的強(qiáng)烈上調(diào)誘導(dǎo)。綜合以上結(jié)果推測(cè)，β分枝中的所有基因在桑樹生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中均有潛在的重要調(diào)控作用，γ分枝成員MnHD-Zip 8和MnHD-Zip 12則在桑樹逆境脅迫響應(yīng)中具有潛在重要功能。