楊美英，李建賓，張 瑩，李辛雷＊，劉信凱，鐘乃盛，黎艷玲

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；3.廣州棕科園藝開(kāi)發(fā)有限公司，廣東 廣州 511316）

山茶花（Camellias）是我國(guó)傳統(tǒng)名花，花色為其重要觀賞性狀[1]。花青苷為山茶花花色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，總花青苷及主要花青苷含量決定其花色[2-4]。研究還表明，花青苷具有抑制腫瘤[5-6]、降血糖[7]和抗氧化[8-9]等作用，可用于醫(yī)藥、保健和化妝等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。Li等[10-11]利用核磁共振、質(zhì)譜和紫外可見(jiàn)光譜等技術(shù)研究了山茶花花青苷，分別在滇山茶（Camellia reticulata Lindl.）中鑒定出5種含2-O-β-木糖基及其相應(yīng)不含2-O-β-木糖基的花青苷，滇山茶園藝品種‘大理茶’中鑒定出10種含2-O-β-木糖基花青苷。李辛雷等[2,4]應(yīng)用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)和超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從山茶（C.japonica L.）不同花色品種中鑒定了出7種花青苷，且其花色隨總花青苷及主要花青苷含量增加而加深。

杜鵑紅山茶（C.azalea Wei）四季開(kāi)花，是培育四季茶花的優(yōu)良親本[12]，廣州棕科園藝開(kāi)發(fā)有限公司通過(guò)杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交，已培育出新品種50余個(gè)[13]。已有杜鵑紅山茶研究主要集中于種群結(jié)構(gòu)[14]、生理特性[15]、生物學(xué)特性[16]和繁殖[17-18]等方面，李辛雷等[19]對(duì)其色素成分進(jìn)行了初步研究，但其花青苷從親本到雜交后代的變異特征尚不清楚。鑒于此，本試驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)（HPLC-DAD）和超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCQ-TOF-MS），對(duì)杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代花青苷成分與含量進(jìn)行研究，明確其花青苷變異特征，以期為高花青苷含量山茶花新品種選育提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步為其花青苷功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其35個(gè)雜交F1代。杜鵑紅山茶和山茶‘媚麗’分別標(biāo)記為D和M，以山茶‘媚麗’為母本，杜鵑紅山茶為父本的27個(gè)雜交后代標(biāo)記為MD系列，以杜鵑紅山茶為母本，山茶‘媚麗’為父本的8個(gè)雜交后代標(biāo)記為DM系列。杜鵑紅山茶花色為鮮紅色，單瓣型，山茶‘媚麗’花色為玫瑰紅色，花瓣邊緣帶有白邊，半重瓣型至牡丹型。杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花色深紅至淺紅不等，花型有單瓣型、半重瓣型和托桂型等（圖1）。所有材料采自廣州棕科園藝開(kāi)發(fā)有限公司。選取生長(zhǎng)環(huán)境相同，長(zhǎng)勢(shì)一致的植株5株，對(duì)盛開(kāi)期的花朵進(jìn)行隨機(jī)采樣，每個(gè)植株采3朵，裝入密封袋后置于有保鮮冰袋的保鮮箱中保存。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，?80 ℃冰箱中保存。

圖1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’及代表性雜交后代Fig.1 C.azalea ,C.japonica 'Meili' and their representative hybrids

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花青苷定性分析 使用液氮研磨花瓣，稱取2 g倒入試管中，加入5 mL提取液（三氟醋酸:甲酸:水:甲醇，體積比1:2:27:70），搖勻，封口膜封口，常溫下浸提24 h。浸提結(jié)束后，經(jīng)脫脂棉和0.22 μm的濾膜依次過(guò)濾，濾液倒入2 mL棕色進(jìn)樣瓶中密封保存，最后置于?20 ℃冰箱中備用[20-21]。

應(yīng)用Waters（Waters Alliance 2 695，USA）的高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)（HPLCDAD）分析系統(tǒng)進(jìn)行色素分析。色譜柱為TSK gel ODS-100Z（150 mm×4.6 mm，柱內(nèi)直徑為5 μm，Tosoh，Japan）。分析條件：柱溫40 ℃，流速1 mL·min?1，進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 525 nm。流動(dòng)相A為水:磷酸（體積比98.5:1.5）；流動(dòng)相B為水:乙腈:甲酸:四氫呋喃:磷酸（體積比48.5:25:20:5:1.5），配制的溶液在減壓條件下用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣后備用。梯度洗脫程序：0～15 min，B液濃度從22%上升至28%；15～35 min，B液從28%上升至68%[22]。

利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS），結(jié)合混合標(biāo)準(zhǔn)品Cy3Ga和Cy3G共洗脫試驗(yàn)，進(jìn)行花青苷結(jié)構(gòu)鑒定。設(shè)備為ACQUITYTM UPLCⅠ-Class 超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation，Milford，MA，USA），Xevo G2-XS QTof MS質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters Corporation，Manchester，UK），UNIFI 1.8 軟件系統(tǒng)。色譜條件與上述色素定性分析條件一致。質(zhì)譜分析條件：電噴霧電離離子源（ESI），正離子模式，全離子掃描，掃描范圍（m/z）：50～1 200 u。脫溶劑氣體為高純度氮?dú)?，溫?50 ℃，流速600 L·h?1，毛細(xì)管電壓為1 kV，錐孔電壓為40 V。低能量掃描電壓為6 eV，高能量掃描電壓為20～45 eV。

1.2.2 花青苷定量分析 標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cy3G）和矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷（Cy3Ga）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%）。根據(jù)朱滿蘭等[23]方法，采用標(biāo)準(zhǔn)品半定量法計(jì)算各樣品每克新鮮花瓣中含有的相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的花青苷含量（μg·g?1），重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花素青苷鑒定

根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS圖譜，對(duì)杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代花瓣中花青苷成分進(jìn)行鑒定，共檢測(cè)到14種花青苷（圖2），其紫外-可見(jiàn)光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。根據(jù)Cy糖苷在513～520 nm有特征吸收峰及碎片離子m/z 287，推定14種花青苷均為Cy型花青苷[24]；花青苷在440 nm與λvis-max兩處吸收值之比A440/Avis-max變化范圍為32%～34%，確定14種花青苷均為3-O-糖苷類型[25-26]。根據(jù)290～340 nm波長(zhǎng)下肩峰的出現(xiàn)推定化合物被芳香酸?；痆27]，峰P5～P14在310～316 nm波長(zhǎng)下肩峰的出現(xiàn)推定其花青苷被芳香酸?；?。

圖2 杜鵑紅山茶與‘媚麗’雜交品種花青苷成分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of anthocyanin components in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili'

表1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花青苷的紫外–可見(jiàn)吸收光譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Chromatographic and spectral data of anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili'

峰P2和P4質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 449，碎片離子m/z 287，其中，m/z 287為Cy苷元特征質(zhì)荷比，其裂解釋放162 u對(duì)應(yīng)一分子己糖；根據(jù)峰P2和峰P4與標(biāo)準(zhǔn)品Cy3Ga和Cy3G共洗脫特性以及花青素半乳糖洗脫時(shí)間小于花青素葡萄糖苷特性[24]，確定峰P2為矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷，峰P4為矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷[28-29]。峰P1和P3質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 581，碎片離子m/z 449、287，m/z 581到m/z 449丟失132 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，參考Li等[10-11]文獻(xiàn)，推定其分別為矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基）-β-半乳糖苷（Cy3GaX）、矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基）-β-葡萄糖苷（Cy3GX）。

峰P5和P10質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 611，碎片離子m/z 449、287，m/z 611到m/z 449丟失162 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，判定其為矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-咖啡酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaECaf）和矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-咖啡酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GECaf）[2-4]。峰P6和P9質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 743，碎片離子m/z 611、449、287，m/z 743到m/z 611丟失132 u，m/z 611到m/z 449丟失162 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，推定其為矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基-6-O-（E）-咖啡酰）-β-半乳糖苷（Cy3GaECafX）和矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基-6-O-（E）-咖啡酰）-β-葡萄糖苷（Cy3GECafX）。

峰P8、P11和P14質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 595，碎片離子m/z 449、287，m/z 595到m/z 449丟失146 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u；根據(jù)其A440/Avis-max（34%）及在310、313 nm波長(zhǎng)下肩峰的出現(xiàn)，推定其為Cy-3-O-芳香酸?；吞擒斩懦罄钐擒誟30]；根據(jù)順式花青苷洗脫時(shí)間小于反式花青苷[31-32]及花青素半乳糖苷洗脫時(shí)間小于花青素葡萄糖苷的特性，判定峰P8、P11和P14分別為矢車菊素-3-O-[6-O-（Z）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaZpC）、矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpC）和矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpC）。

峰P7、P12和P13質(zhì)譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 727，碎片離子m/z 595、449、287，m/z 727到m/z 595丟失 132 u，m/z 595到m/z 449丟失146 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，推定其分別為矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（Z）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaZpCX）、矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（E）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpCX）和矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（E）-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpCX）[10-11]。

2.2 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷變異特征

杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其35個(gè)雜交后代中，‘媚麗’檢測(cè)到7種花青苷，其中Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量較高，Cy3GaECaf、Cy3GaZpC和Cy3GECaf含量均低于 10 μg·g?1。杜鵑紅山茶中檢測(cè)到14種花青苷，除與山茶‘媚麗’相同的7種外，還包括其相應(yīng)的含2-O-β-木糖基的花青苷；含量較高的花青苷有8種（表2），分別為Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC以及相應(yīng)的含2-O-β-木糖基的Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX，其余成分均低于 1 μg·g?1。杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’35個(gè)雜交后代除MD78外，均檢測(cè)到8種主要相關(guān)花青苷，其余成分含量均較低或未檢測(cè)到。

表2 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷含量Table 2 Content of main anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili' μg·g?1

杜鵑紅山茶主要花青苷含量為 735.81 μg·g?1，山茶‘媚麗’主要花青苷含量為 526.61 μg·g?1，杜鵑紅山茶主要花青苷含量為‘媚麗’的1.40倍；雜交后代中主要花青苷含量高于杜鵑紅山茶的占11.43%，低于山茶‘媚麗’的占37.14%，雙親之間的占51.43%。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX均來(lái)源于杜鵑紅山茶，其中Cy3GX、Cy3GaX含量低于杜鵑紅山茶，而Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量大部分高于杜鵑紅山茶；Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC主要來(lái)源于山茶‘媚麗’，含量大部分介于雙親之間。山茶‘媚麗’中含葡萄糖苷的花青苷含量遠(yuǎn)高于相應(yīng)含半乳糖苷的花青苷；杜鵑紅山茶及雜交后代中含2-O-β-木糖基的花青苷含量基本上高于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基的花青苷，含葡萄糖苷的花青苷（除個(gè)別雜交后代外）含量也高于相應(yīng)含半乳糖苷的花青苷。

2.3 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例的遺傳變異

杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例見(jiàn)表3。杜鵑紅山茶花瓣中主要花青苷Cy3GX、Cy3GaX分別占63.14%、19.17%，合計(jì)82.30%；其次為Cy3G、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX，分別占6.08%、5.42%和3.17%。山茶‘媚麗’主要成分Cy3GEpC、Cy3G分別占44.76%、40.26%，合計(jì)85.02%；其次為Cy3GaEpC、Cy3Ga，分別占8.18%、5.27%。雜交后代中，Cy3GX、Cy3GaX所占比例均低于杜鵑紅山茶，而Cy3GaEpCX（除MD72外）所占比例均高于杜鵑紅山茶；Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC所占比例大部分介于雙親之間，其中，Cy3GX、Cy3GEpCX平均比例分別為31.24%、22.18%，合計(jì)53.42%；Cy3G、Cy3GEpC平均比例分別為15.37%和14.20%，合計(jì)29.57%?？梢?jiàn)，杜鵑紅山茶花青苷主要成分為Cy3GX和Cy3GaX，山茶‘媚麗’為Cy3GEpC和Cy3G，雜交后代主要成分為Cy3GX和Cy3GEpCX，其次為Cy3G和Cy3GEpC。

表3 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例Table 3 Proportion of main anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili' %

3 討論

植物花色是多種因子協(xié)同作用的結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)特定色素的存在是根本內(nèi)因[33-35]。山茶花的花瓣中色素主要為類黃酮，其中，黃色系山茶花主要為黃酮醇類[36-37]；紅色系山茶花主要為矢車菊素類[2]。本試驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器和超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從杜鵑紅山茶及其雜交后代中鑒定出14種花青苷，7種不含2-O-β-木糖基的花青苷與山茶花研究結(jié)果相符[2-4]，7種含2-O-β-木糖基的花青苷與滇山茶品種‘大理茶’研究一致[11]；8種組分含量較高，即Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX以及相應(yīng)不含2-O-β-木糖基的Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC；山茶‘媚麗’中未檢測(cè)到含2-O-β-木糖基花青苷，表明雜交后代中含2-O-β-木糖基花青苷主要遺傳自杜鵑紅山茶。

本試驗(yàn)中杜鵑紅山茶8種主要花青苷總量高于山茶‘媚麗’，雜交后代主要花青苷總量大部分介于雙親之間，少量高于杜鵑紅山茶或低于山茶‘媚麗’，表明其雜交后代花青苷總量存在較大的變異。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX含量均低于杜鵑紅山茶，Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量基本上介于雙親之間；但Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量基本上高于杜鵑紅山茶，這可能由于存在雜種優(yōu)勢(shì)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。杜鵑紅山茶及其雜交后代中，含葡萄糖苷花青苷高于相應(yīng)含半乳糖苷花青苷，相關(guān)結(jié)果與已有山茶花青苷研究一致[2-4]；含2-O-β-木糖基花青苷含量高于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基花青苷，與滇山茶品種研究結(jié)果相符[11,38]，表明含2-O-β-木糖基花青苷遺傳能力大于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基花青苷。

杜鵑紅山茶主要花青苷為Cy3GX和Cy3GaX，二者合計(jì)占其花青苷總量的82%以上；山茶‘媚麗’主要為Cy3GEpC和Cy3G，合計(jì)占85%以上；雜交后代中主要花青苷Cy3GX和Cy3GEpCX占50%以上，其次是Cy3G和Cy3GEpC約占30%，含2-O-β-木糖基的花青苷所占比例遠(yuǎn)高于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基的花青苷，也表明含2-O-β-木糖基的花青苷具較強(qiáng)的遺傳能力。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX比例降低，Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX比例升高，具體原因有待于進(jìn)一步研究。林艷等[39]對(duì)仙客來(lái)（Cyclamen persicum Mill）、李曉麗等[40]對(duì)月季（Rosa chinensis Jacq.）和陳和明等[41]對(duì)秋石斛蘭（Dendrobium spp.）的研究結(jié)果表明，白色花與紅色花雜交后得到的絕大部分是紅色花，紅色的花色遺傳能力強(qiáng)于白色；本試驗(yàn)中杜鵑紅山茶鮮紅色，山茶‘媚麗’玫瑰紅色帶白邊，其雜交后代大部分花色為紅色，少量帶白邊或零星白斑，也表明其紅色遺傳能力強(qiáng)于白色。李辛雷等[2-4]研究表明，山茶花的花青苷成分含量與比例均影響其花色，本試驗(yàn)中杜鵑紅山茶雜交后代花青苷成分含量與比例對(duì)花色的影響不明顯，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中11.43%的雜交后代主要花青苷總量高于杜鵑紅山茶，最高為其近2倍（1 406.15 μg·g?1），表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，其花瓣中花青苷具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。通過(guò)利用花青苷含量高的雜交后代與杜鵑紅山茶回交，有望增加其花青苷的積累，進(jìn)一步選育出高花青苷含量的新品種。此外，杜鵑紅山茶雜交后代具有四季開(kāi)花的特性，為其花青苷利用提供了穩(wěn)定的材料，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器和超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代中花青苷進(jìn)行分析，從杜鵑紅山茶及其雜交后代中鑒定出14種花青苷，7種含2-O-β-木糖基的花青苷來(lái)源于杜鵑紅山茶。杜鵑紅山茶主要花青苷總量高于山茶‘媚麗’，雜交后代花青苷總量存在較大的變異，Cy3GX、Cy3GaX含量均低于杜鵑紅山茶，Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量總體上高于杜鵑紅山茶，Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量基本上介于雙親之間。杜鵑紅山茶及其雜交后代中含2-O-β-木糖基的花青苷含量高于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基花青苷，含葡萄糖苷花青苷高于相應(yīng)含半乳糖苷花青苷。杜鵑紅山茶主要花青苷為Cy3GX和Cy3GaX，山茶‘媚麗’為Cy3GEpC和Cy3G，雜交后代主要為Cy3GX和Cy3GEpCX，其次為Cy3G和Cy3GEpC，含2-O-β-木糖基的花青苷所占比例高于相應(yīng)不含2-O-β-木糖基的花青苷，表明含2-O-β-木糖基的花青苷具較強(qiáng)的遺傳能力。