蘇文文，任春光，潘麗珊，吳 迪，韓振誠，王加國，李良良，李葦潔

(1 貴州省山地資源研究所，貴陽，550001；2 貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽，550025)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)的藤本植物，其果實營養(yǎng)豐富，富含維生素和多種礦質(zhì)元素及氨基酸，被譽為“水果之王”，是我國多地精準(zhǔn)扶貧的特色優(yōu)勢樹種[1-2]。作為精品產(chǎn)業(yè)之一，獼猴桃已經(jīng)成為貴州省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)。近年來，隨著獼猴桃種植產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，獼猴桃的病害問題也愈發(fā)嚴重。現(xiàn)已報道的獼猴桃病害主要有獼猴桃花腐病、獼猴桃潰瘍病、獼猴桃褐斑病、獼猴桃軟腐病和獼猴桃根結(jié)線蟲病等[3-7]。這些病害分別發(fā)生在獼猴桃的花蕾、枝干、葉片、果實和根部，對獼猴桃樹體造成不同程度的危害。

獼猴桃褐斑病是獼猴桃葉片上的一類重要病害，病葉率達60%～100%，不僅能夠引起果園大面積落葉，甚至造成果樹返花返青，產(chǎn)量損失高達30%～50%，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成極大威脅[8]。該病在我國陜西、四川、貴州等獼猴桃種植區(qū)都有發(fā)生，但沒有大面積暴發(fā)的記錄。獼猴桃褐斑病病原菌多樣，目前已報道的能夠引起獼猴桃褐斑病的病原菌主要有鏈格孢Alternariaalternata、小球腔菌Mycosphaerellasp.、擬莖點霉菌Phomopsiscauloides、細極鏈格孢Alternariatenuissima等[9-12]。但不同區(qū)域、不同品種上病原菌種類的報道存在明顯差異，隨著病原菌的致病性分化以及環(huán)境等因素的影響，獼猴桃褐斑病病原菌的種類可能不斷增加，目前也尚未報道有效的田間防控措施。鑒于此，本試驗采用組織分離法分離紅陽獼猴桃褐斑病葉片，通過形態(tài)學(xué)觀察和病原菌rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS 序列對紅陽獼猴桃褐斑病進行病原菌鑒定，同時對田間防治常用的6種試驗藥劑進行室內(nèi)毒力測定，明確貴州省六盤水市水城區(qū)紅陽獼猴桃褐斑病病原菌種類，篩選出能夠有效抑制病原菌菌絲生長的藥劑，以期為紅陽獼猴桃褐斑病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試紅陽獼猴桃病害樣本和健康葉片采自貴州省六盤水市水城區(qū)獼猴桃產(chǎn)學(xué)研基地，在室內(nèi)進行組織分離培養(yǎng)。

供試藥劑：0.3%苦參堿水劑，廣東真格生物科技有限公司生產(chǎn)；40%戊唑醇懸浮劑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；30%吡唑醚菌酯乳油，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；80%乙蒜素乳油，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司生產(chǎn)；80%代森錳鋅可濕性粉劑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；70%甲基托布津可濕性粉劑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；80%多菌靈可濕性粉劑，上海悅聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采集紅陽獼猴桃發(fā)病葉片，選擇病健交接處組織，用流水沖洗干凈，放入70%無水乙醇中消毒1 min，用無菌水反復(fù)沖洗3次，將其放置于滅菌濾紙上，待水分揮發(fā)干后放入PDA培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基放入25 ℃光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，3 d后選取PDA培養(yǎng)基邊緣新生長的菌絲進行純化培養(yǎng)，得到單個病原菌。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)：用打餅器選取6 mm菌餅，放入新鮮PDA培養(yǎng)基上，放入25 ℃培養(yǎng)箱。7 d后觀察菌落的形態(tài)特征，包括菌絲形態(tài)，菌落顏色，量取菌落直徑，并記錄。

顯微形態(tài)：以無菌水為浮載劑，挑取新鮮菌絲于載玻片上，在顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子，依據(jù)真菌分類系統(tǒng)，初步確定病原菌種類[13]。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定 依據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌絲DNA，選用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對其rDNA-ITS 區(qū)域進行擴增，將擴增好的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增片段。然后將其送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果通過BLAST 進行同源序列比較，明確病原菌的種類。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)的體系為25 μL，其中DNA 2μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 uL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將測序所得序列上傳到NCBI網(wǎng)站的GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行比較，下載同源性高的參考序列，使用MEGA 7.0.14軟件的最大似然法(MI)進行系統(tǒng)發(fā)育分析及進化樹的構(gòu)建，確定病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌致病性檢測 選取健康的紅陽獼猴桃葉片，用無菌水反復(fù)沖洗干凈，放置于滅菌濾紙上晾干。用脫脂棉包裹葉柄處后放于有無菌濾紙的托盤中，將葉柄處的脫脂棉用無菌水浸濕。在葉片的兩側(cè)用無菌接種針制造傷口，進行有傷接種。每個葉片右側(cè)接菌絲塊進行處理(菌落正面貼于傷口上)，左側(cè)接無菌的PDA作為對照。將接種好的葉片置于光照培養(yǎng)箱中，定期進行觀察，7 d后進行病斑記錄。待發(fā)病后采集病斑組織進行分離鑒定。

1.2.5 室內(nèi)毒力測定 采用菌絲生長法進行藥劑毒力測定，所有藥劑按照最適噴施濃度進行濃度梯度稀釋，制成含有不同濃度藥劑的含藥培養(yǎng)基，每種藥劑設(shè)置5個梯度，每個梯度做3次重復(fù)。用直徑為6 mm的打餅器打取菌餅放置于含藥平板上，以接種無菌PDA作為對照。將接種好的培養(yǎng)基放入25 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法量取菌落直徑，計算各藥劑對病原菌菌絲的抑制作用。抑菌率(%)=(對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑)/對照菌落平均直徑×100。采用Excel軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，求出各藥劑抑制中濃度(EC50)、毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃褐斑病發(fā)病癥狀

獼猴桃褐斑病主要危害獼猴桃葉片，發(fā)病初期，在葉片上出現(xiàn)黃綠色斑點，隨后病斑慢慢擴散至3 mm，發(fā)病部位中間為灰褐色，外緣為黃褐色。發(fā)病后期，病斑會擴展為圓形或不規(guī)則形病斑且病斑中間呈輪紋狀，嚴重時病斑連接成片，導(dǎo)致葉片大面積脫落，影響樹體營養(yǎng)吸收和生長(見圖1)。

圖1 獼猴桃褐斑病田間發(fā)病癥狀

2.2 病原菌分離及形態(tài)學(xué)觀察

將分離、純化后的獼猴桃褐斑病菌株置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，病原菌菌絲由白色變?yōu)榛液稚q狀，菌絲濃密，邊緣整齊，菌絲中間凸起。顯微鏡觀察分生孢子梗和菌絲聯(lián)結(jié)，由菌絲演變而來，分生孢子平滑，倒棍棒形，頂部圓滑，具有2個假隔膜(見圖2)。依據(jù)病原菌形態(tài)特征初步判斷該病原菌為多主棒孢菌Corynesporacassiicola。

A：菌落正面、背面；B：病原菌PDA培養(yǎng)基上菌落背面；C：分生孢子；D、E：分生孢子梗和菌絲

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析

將分離得到的病原菌菌株DNA進行PCR擴增，得到535 bp片段，將擴增后測序結(jié)果提交到GenBank中，獲得登錄號MZ191792。將所得序列進行BLAST 在線比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。BLAST在線比對結(jié)果表明，病原菌的ITS序列與棒孢菌的多個菌株(MN393243,KF928288,MN871621,KF928286等)的同源性達到96%以上。基于病原菌ITS序列的聚類結(jié)果表明(見圖3)，紅陽獼猴桃褐斑病病原菌的ITS序列與棒孢菌的多個菌株處于同一分支，表明病原菌與棒孢菌親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定出此次分離得到的紅陽獼猴桃褐斑病病原菌主要為多主棒孢菌Corynesporacassiicola。

圖3 基于ITS-rDNA基因序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 病原菌的致病性檢測

葉片離體接種結(jié)果顯示，無傷接種7 d后，接種菌絲塊和PDA培養(yǎng)基的葉片均未發(fā)病，有傷接種7 d后，紅陽獼猴桃葉片左側(cè)接種PDA培養(yǎng)基塊部位沒有出現(xiàn)病斑，葉片右側(cè)接種病原菌菌絲塊部位出現(xiàn)黑色病斑(見圖4)。對接種后發(fā)病的葉片組織再次分離，病原菌形態(tài)特征與前期分離的形態(tài)特征一致。

圖4 紅陽獼猴桃葉片褐斑病病原菌致病性檢測

2.5 室內(nèi)毒力測定

通過室內(nèi)毒力測定結(jié)果可以看出，6種藥劑對紅陽獼猴桃褐斑病病原菌均有一定的毒力，不同的藥劑之間抑菌效果有一定的差異。其中50%多菌靈可濕性粉劑防治效果最好，最低濃度即可抑制病原菌菌絲生長；其次為40%戊唑醇懸浮劑抑菌效果最好，EC50為0.000 2 mg/L；80%乙蒜素乳油、30%吡唑醚菌酯乳油和80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果較好，EC50分別為0.074 3、0.087 1和3.571 1 mg/L；0.3%苦參堿水劑相對于其他幾種藥劑，抑菌效果一般，EC50為0.502 5 mg/L(見表1)。

表1 6種藥劑對紅陽獼猴桃褐斑病病原菌的毒力測定

3 討論

紅陽獼猴桃褐斑病在貴州紅陽獼猴桃園區(qū)迅速蔓延，嚴重威脅獼猴桃產(chǎn)量、品質(zhì)及經(jīng)濟效益。本研究針對貴州省六盤水市水城區(qū)紅陽獼猴桃褐斑病標(biāo)樣進行分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)檢測以及致病性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致紅陽獼猴桃褐斑病發(fā)生的病原菌為多主棒孢菌Corynesporacassiicola。這與之前對四川省獼猴桃褐斑病病原菌的報道結(jié)果相符[15]。

多主棒孢菌侵染力強，寄主范圍廣，不僅可以侵染獼猴桃，還對豆科、茄科以及葫蘆科等多種植物造成危害[16]。至今已經(jīng)有很多報道表明，多主棒孢菌在不同國家和地區(qū)的橡膠、番茄、黃瓜、大豆、棉花等植物上危害嚴重，逐步成為該種植物的主要病害[17-20]。

20世紀(jì)90年代，在我國遼寧省黃瓜褐斑病上首次分離到多主棒孢菌，該病原菌侵染黃瓜，造成了黃瓜大面積減產(chǎn)[21]。隨著黃瓜褐斑病發(fā)病率直線上升，病原菌對其他植物的侵染也越加嚴重。2005年以來，我國的黃瓜、茄子、番茄、豇豆等蔬菜和經(jīng)濟作物因多主棒孢菌侵染，經(jīng)濟損失過億，其主要發(fā)生地在云南、海南、山東、遼寧、吉林等地[22]。然而關(guān)于多主棒孢菌在紅陽獼猴桃上的侵染以及致病力分化情況尚未有報道，因此，隨著該病原菌的發(fā)展以及在寄主植物上發(fā)病率的逐漸提高，給紅陽獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來潛在風(fēng)險。

此前針對紅陽獼猴桃褐斑病，已有研究已經(jīng)分離鑒定該病主要由細極鏈格孢Alternariatenuissima侵染引起，同時針對該病原菌進行了室內(nèi)藥劑篩選和毒力測定，但是田間發(fā)病依然較為嚴重，推測紅陽獼猴桃褐斑病是由多主棒孢菌和細極鏈格孢菌混合侵染引起。到目前為止，僅有崔永亮研究報道多主棒孢菌Corynesporacassiicola危害紅陽獼猴桃，但其研究未提出防控方案[8]。關(guān)于紅陽獼猴桃褐斑病病原菌種類及優(yōu)勢病原菌的研究都將需要長期深入研究。

徐麗慧等[23]報道，對黃瓜靶斑病致病菌多主棒孢菌抑制效果較好的為430 g/L戊唑醇懸浮劑、45%咪鮮胺乳油；番華彩等[24]報道，造成香蕉葉斑病的棒孢霉菌對丙環(huán)唑、多抗霉素和苯甲·丙環(huán)唑等藥劑敏感。本研究選擇田間常用的藥劑進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，對多主棒孢菌抑制效果較好的是50%多菌靈可濕性粉劑、40%戊唑醇懸浮劑，其次為80%乙蒜素乳油、30%吡唑嘧菌酯乳油和80%代森錳鋅。這些藥劑對于田間防治紅陽獼猴桃褐斑病都具有一定的理論價值，但本研究僅測定了藥劑對病原菌的室內(nèi)毒性，關(guān)于田間的試驗效果還需要結(jié)合環(huán)境、成本、對果實生長的影響以及農(nóng)藥殘留等因素進行進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對貴州省六盤水市水城區(qū)紅陽獼猴桃褐斑病標(biāo)樣進行分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)檢測以及致病性測定，表明引起紅陽獼猴桃褐斑病病原菌為多主棒孢菌Corynesporacassiicola。室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明，對多主棒孢菌抑制效果較好的是50%多菌靈可濕性粉劑、40%戊唑醇懸浮劑，其次為80%乙蒜素乳油、30%吡唑嘧菌酯乳油和80%代森錳鋅。