宗海英，劉君，郭曉紅，李萌，黃小麗，王芳麗，宋寧寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，山東 青島 266109；2.魯東大學資源與環(huán)境工程學院，山東 煙臺 264025；3.山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264001；4.青島農(nóng)業(yè)大學中心實驗室，山東 青島 266109）

微塑料（Microplastics，MPs，指顆粒尺寸＜5 mm的塑料）作為一種新型污染物成為當前國際環(huán)境科學研究的熱點之一。關(guān)于海洋生態(tài)系統(tǒng)中的MPs污染已被大量報道。近期研究顯示，陸地環(huán)境中的MPs豐度可能是海洋中的4～23倍，尤其是農(nóng)田土壤中，發(fā)現(xiàn)大量MPs的存在。據(jù)調(diào)查，山東省沿海地區(qū)土壤MPs豐度為1.3～14 712.5個·kg。武漢某郊區(qū)蔬菜農(nóng)田中MPs的平均豐度為320～12 560個·kg。同時，在云南省10個縣100個地點采集的土壤樣品均存在嚴重的MPs污染，進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些MPs污染均與地膜的使用有關(guān)。另外。在全國19個省份采集的384份土壤樣品中也得到了類似的結(jié)果，即地膜使用量與土壤MPs之間呈線性正相關(guān)關(guān)系。農(nóng)用薄膜主要成分為聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯，它們在自然狀態(tài)下難以降解，且使用過的舊殘膜不易回收利用，導(dǎo)致薄膜經(jīng)自然風化破碎成MPs殘留在土壤環(huán)境中。

MPs進入土壤后會影響土壤理化性質(zhì)、改變土壤生物活動、破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)，進而影響植物生長發(fā)育。例如，廖苑辰等研究表明，高濃度（200 mg·L）的聚乙烯微塑料會顯著抑制小麥根系生長和降低小麥的葉綠素含量。LI等研究表明，黃瓜水培溶液中添加50 mg·L的100 nm聚苯乙烯納米塑料7 d和14 d后，在黃瓜各干組織中檢測到0～6 893μg·g納米塑料。MPs不僅會抑制作物生長，降低作物產(chǎn)量，還會造成蔬菜品質(zhì)下降。因此，MPs的存在對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了極大的威脅。

我國土壤環(huán)境中除了MPs污染外，還存在持久性有機污染物和重金屬等污染物。2020年全國生態(tài)環(huán)境質(zhì)量簡況報告顯示，重金屬是影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物，其中Cd是主要的重金屬污染物。土壤中的Cd具有較強的移動性，易被植物根部吸收并運輸?shù)娇墒秤貌课?，對人體健康構(gòu)成威脅。MPs粒徑小，具有較高的比表面積，極易與其共存的重金屬Cd產(chǎn)生潛在的相互作用，進而影響作物的生長和發(fā)育。但是目前關(guān)于MPs和重金屬相互作用對作物毒性的研究多關(guān)注于Cd積累的研究，而對作物生理特征的研究相對較少。

花生是我國重要的油料作物，普遍采用覆膜栽培。同時，花生也極易吸收土壤中的Cd。種植花生的土壤中不可避免地同時存在MPs和Cd污染。因此，本研究以花生為供試植物，以聚乙烯微塑料（PE）和Cd為研究對象，研究單一PE或與Cd復(fù)合污染對花生生理特性及吸收Cd的影響，進一步探討PE和Cd復(fù)合污染對作物的毒性效應(yīng)，為MPs和重金屬復(fù)合污染環(huán)境風險評價及污染治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種為魯花8號，由山東省花生研究所提供。PE購于河北弘耀實業(yè)有限公司，顆粒密度為0.940～0.976 g·cm，粒徑為100～500μm。

1.2 試驗設(shè)計

選取飽滿且大小一致的花生種子，用1%的次氯酸鈉滅菌10 min，自來水沖洗干凈后用蒸餾水浸泡24 h，7 d后選取長勢均一的花生幼苗，移入裝有Hoagland（pH 5.8）半營養(yǎng)液的塑料盆中進行培養(yǎng)（每盆含有5顆幼苗），4 d后加入Hoagland全營養(yǎng)液，花生幼苗生長10 d后，設(shè)置PE和Cd單一和復(fù)合試驗。參考廖苑辰等研究中的MPs濃度，同時結(jié)合本研究前期預(yù)實驗，PE添加濃度分別為0、50、200 mg·L（分別標記為PE0、PE50、PE200）；根據(jù)課題組前期Cd脅迫對花生生理特征的研究，Cd暴露濃度為0、25、100μmoL·L（分別標記為Cd0、Cd25、Cd100）。每個處理設(shè)置三次重復(fù)，隨機區(qū)組設(shè)計。全營養(yǎng)液每隔3 d更換一次，處理41 d后收獲植株并測定相關(guān)指標。培養(yǎng)條件：光照14 h，光強為800 μmol·m·s，溫度為白天25±1℃、夜晚22±1℃，濕度為60%±5%。

1.3 指標測定方法

1.3.1 花生生長指標測定

新鮮花生樣品在105℃下殺青30 min，然后在75℃下烘干至恒質(zhì)量，分別測定地上部和根部干質(zhì)量。

1.3.2 根系活力測定

根系活力采用TTC法測定：花生收獲后，每個處理組隨機選取0.5 g根尖樣品，經(jīng)TTC處理后，于485 nm下進行比色并計算根系活力。

1.3.3 植株Cd含量測定

顯效:術(shù)中無疼痛等不適,無出現(xiàn)血壓降低、認知功能障礙等并發(fā)癥,心率、動脈壓麻醉前后穩(wěn)定;有效:術(shù)中輕度疼痛不適,心率、動脈壓麻醉前后有一定波動;無效:術(shù)中明顯疼痛,出現(xiàn)并發(fā)癥,心率、動脈壓麻醉前后明顯波動。老年腹腔鏡全麻手術(shù)麻醉效果為顯效、有效百分率之和[2]。

地上部和根部樣品烘干，研磨，經(jīng)硝酸-高氯酸（4∶1）消解后，采用原子吸收分光光度計測定Cd含量。

1.3.4 丙二醛含量測定

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定。

1.3.5 抗氧化酶測定

新鮮花生葉片或根系低溫下研磨成勻漿，經(jīng)離心提取后，分別采用藍四唑（NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）、愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）、紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對試驗結(jié)果進行處理，圖中數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。運用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行方差分析和雙因素分析，使用Duncan法對各處理進行多重比較（＜0.05）。運用Origin 2018進行制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗生長的影響

由圖1可知，MPs單一處理時，與PE0相比，PE50顯著增加了花生地上部和根部生物量，增加幅度分別為9.23%和12.6%；而PE200與PE0差異不顯著。說明在沒有Cd脅迫條件下，低濃度PE對花生生長具有一定的促進作用。PE與Cd交互作用時，在Cd25條件下，與PE0相比，PE50和PE200減少花生地上部生物量的幅度分別為6.45%和15.4%。在Cd100時，PE50和PE200處理花生地上部生物量分別降低17.4%和46.4%。MPs單一及其與Cd復(fù)合污染對花生根部的影響與對地上部影響的規(guī)律一致，即PE單一處理時，低濃度PE（50 mg·L）促進了花生根部的生長，增加了花生根部的生物量，而高濃度PE（200 mg·L）對花生根部生物量無顯著影響。在Cd存在條件下，PE50和PE200均顯著抑制了花生根部的生長，且隨著PE濃度升高抑制作用增強。雙因素分析表明，PE和Cd共存對花生地上部和根部生長的影響顯著（表1），說明PE和Cd交互對花生生長的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。

表1 PE和Cd的交互作用Table 1 The interaction between PE and Cd

圖1 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗生物量的影響Figure 1 Effects of the combination of PE and Cd on peanut biomass

2.2 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗MDA含量的影響

MDA是植物細胞膜中不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。一般植物體內(nèi)MDA含量越高，說明植物細胞膜氧化損傷越嚴重。從圖2可以看出，PE單一及其與Cd復(fù)合污染均導(dǎo)致花生地上部和根部MDA含量上升。就花生地上部MDA而言，PE單一處理時，與未添加PE相比，PE50處理對花生地上部MDA含量無顯著影響，而PE200處理顯著增加了地上部MDA含量，增加幅度為23.5%。說明高濃度（200 mg·L）的PE會導(dǎo)致植物地上部細胞膜的氧化損傷。可能原因是累積在植物根部的PE，通過細胞壁和細胞間隙進入植物脈管系統(tǒng)，通過脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到植物地上部，導(dǎo)致PE對植物莖和葉產(chǎn)生損害，并引起細胞膜的氧化損傷。而較低濃度PE導(dǎo)致的氧化損害作用，會通過植物自身抗氧化系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)而緩解。

圖2 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗MDA含量的影響Figure 2 Effects of the combination of PE and Cd on peanut MDA content

PE和Cd共存使得花生地上部MDA含量顯著增加（圖2）。其中，Cd25條件下，與PE0相比，PE50和PE200處理使花生植株內(nèi)MDA分別提高8.13%和12.4%。Cd100時，與未添加PE相比，僅PE200顯著提高了花生地上部MDA含量。PE和Cd交互作用下根部MDA含量的變化與地上部有所不同。例如在Cd100時，PE50和PE200均顯著提高了根部MDA含量，增幅分別為18.1%和45.7%。以上結(jié)果說明PE會加重Cd對植物的氧化損傷。與單一PE相比，PE和Cd交互作用也顯著提高了花生地上部和根部MDA含量，且隨著PE和Cd濃度升高，提高幅度增強。通過雙因素分析也發(fā)現(xiàn)Cd對花生幼苗MDA含量的影響顯著，PE和Cd交互也顯著影響了花生幼苗MDA的含量，可見PE和Cd共存對植物的氧化脅迫表現(xiàn)出協(xié)同作用。原因可能是高濃度PE會吸附、運載大量Cd到花生體內(nèi)，造成Cd在花生體內(nèi)的大量積累。有研究證實Cd在植物體內(nèi)會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，引起植物活性氧增加，加劇植物細胞膜氧化損傷。

2.3 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗抗氧化酶的影響

SOD、POD和CAT是生物適應(yīng)和抵抗逆境脅迫的重要酶，也是清除活性氧的關(guān)鍵酶，被稱為抗氧化酶。由圖3可以看出，PE單一及與Cd復(fù)合污染均會對花生地上部和根部抗氧化酶產(chǎn)生影響。就花生地上部而言，PE單一處理時，與PE0相比，PE50對花生地上部SOD、POD和CAT活性無顯著影響，而PE200顯著提高了三類抗氧化酶的活性。說明高濃度（200 mg·L）PE脅迫條件下，花生會通過提高地上部氧化酶活性來中和活性氧，使植株細胞免受PE的毒害。劉玲等在研究MPs對水稻SOD、POD和CAT活性時也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果，即10 mg·LMPs（100 nm）會增加水稻抗氧化酶的活性。但廖苑辰等的研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤苯乙烯MPs（5 μm）含量的增加（0～100 mg·kg），小麥SOD活性一直下降，而CAT活性先下降后上升。這與本研究結(jié)果不太一致，這可能是由于MPs材料、濃度和粒徑不同所引起的。

圖3 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活性的影響Figure 3 Effects of the combination of PE and Cd on the peanut activities of SOD（A）,POD（B）and CAT（C）

PE和Cd復(fù)合污染條件時，在Cd25條件下，PE50對花生地上部SOD和CAT無顯著作用（＞0.05），卻顯著提高了POD的活性，增幅為53.5%。PE200均顯著提高了SOD、POD和CAT的活性，增幅分別為14.9%、83.5%和60.0%。Cd100時，PE50和PE200均顯著提高了三類抗氧化酶的活性。PE和Cd復(fù)合污染時，花生根部SOD和CAT酶活性變化與地上部的規(guī)律基本一致，而POD活性變化與地上部有所不同，即在Cd暴露條件下，PE50和PE200處理之間根部POD活性差異顯著。SOD是植物防御氧化脅迫的第一道防線，能把活性氧中的O·轉(zhuǎn)化為HO，隨后CAT和POD清除HO。SOD、CAT和POD通過協(xié)同作用使植物體內(nèi)的活性氧處于平衡狀態(tài)，防止植物細胞免受損害。酶活性的短暫變化是植物體自身為免受外部環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的調(diào)節(jié)反應(yīng)。通過雙因素分析發(fā)現(xiàn)，PE和Cd共存對SOD、POD和CAT活性的升高表現(xiàn)出協(xié)同作用（表2），說明花生通過改變以上3種酶的活性來中和產(chǎn)生的活性氧，使機體免受PE和Cd的毒害。MENG等探究Cd脅迫對蔬菜抗氧化酶活性的影響時也發(fā)現(xiàn)，菠菜和生菜會通過增高酶活性來使自身免受環(huán)境脅迫的影響。

2.4 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗根系活力的影響

根系活力是指根系吸收和合成營養(yǎng)成分以及氧化還原的能力。植物受到Cd毒害后首先影響到根系的生長發(fā)育，從圖4可以看出，在未添加Cd的處理中，PE50可以顯著提高花生的根系活力，增幅為8.03%，可見低濃度（50 mg·L）PE會促進根系活力。PE和Cd復(fù)合污染時，Cd25條件下，與PE0相比，PE50和PE200對花生的根系活力表現(xiàn)出顯著的抑制作用，使得根系活力分別降低10.8%和22.7%。Cd100時，PE50和PE200對根系活力的抑制作用增強。與單一PE相比，PE和Cd交互顯著降低了花生的根系活力，PE和Cd100交互時的花生根系活力顯著低于PE和Cd25交互時的根系活力，說明PE和Cd對根系活力的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。本研究結(jié)果與DONG等的PE和As復(fù)合脅迫加劇了對水稻根系活力的毒性作用的結(jié)果基本一致。這可能是因為PE在根系的累積，堵塞根部通道，擾亂了水分和養(yǎng)分的運輸，引起根系細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，導(dǎo)致防御系統(tǒng)平衡被打破引發(fā)了更高的毒性。因為據(jù)KALCIKOVá等的研究發(fā)現(xiàn)，液配條件下，聚乙烯微珠會大量附著于浮萍根系表面，干擾浮萍對養(yǎng)分和水分的吸收。

圖4 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗根系活力的影響Figure 4 Effects of the combination of PE and Cd on peanut root activity

2.5 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗Cd含量的影響

PE和Cd復(fù)合作用也促進了花生對Cd的積累，且隨著PE濃度增加，促進作用逐漸增強（圖5）。就花生地上部而言，在Cd25的處理中，與PE0相比，PE50和PE200顯著提高了花生地上部對Cd的吸收，增幅分別為35.5%和60.9%，且PE50和PE200處理之間差異顯著。Cd100處理時，PE50和PE200使得花生地上部Cd吸收增加幅度分別為40.9%和78.8%，且PE50和PE200處理之間差異顯著。PE和Cd復(fù)合污染對根部吸收Cd的影響與地上部規(guī)律一致，即添加PE促進了根部對Cd的吸收，且隨著PE濃度的增加根部Cd濃度也隨之增加。通過雙因素分析也發(fā)現(xiàn)，PE和Cd交互對花生地上部和根部Cd濃度具有顯著影響（表2）。以上結(jié)果說明，PE和Cd交互會促進花生對Cd的吸收。WANG等研究了土壤中MPs和Cd復(fù)合污染對生菜Cd積累的影響，指出MPs可通過改變土壤理化性質(zhì)提高生菜對Cd的吸收。而本研究條件為液配試驗，不存在改變土壤理化性質(zhì)的現(xiàn)象。CAO等報告指出在液配條件下MPs與其共存的重金屬會通過靜電力和非共價發(fā)生復(fù)雜的相互作用，進而影響重金屬離子的有效性。例如劉玲等研究MPs和Pb復(fù)合脅迫對水稻根系Pb含量影響時發(fā)現(xiàn)，10 mg·L和20 mg·L聚苯乙烯MPs可抑制水稻根系對Pb的吸收，而更高濃度（40 mg·L）聚苯乙烯微塑料MPs促進了Pb在水稻根系中的積累。解釋原因是低濃度MPs與Pb存在競爭吸附，導(dǎo)致根系降低了對Pb的吸收，而高濃度的MPs會作為載體將Pb轉(zhuǎn)移到水稻體內(nèi)，造成水稻根系內(nèi)Pb的積累。推測本研究PE增強花生對Cd的積累機制可能與PE對Cd的吸附和載體效應(yīng)有關(guān)。但具體機制有待進一步研究。

圖5 PE和Cd復(fù)合污染對花生幼苗Cd濃度的影響Figure 5 Effects of the combination of PE and Cd on Cd concentration of peanut

3 結(jié)論

（1）聚乙烯微塑料（PE）單一處理時，低濃度（50 mg·L）PE可顯著提高花生的生物量。高濃度（200 mg·L）PE提高了花生體內(nèi)丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性，并抑制了根系活力，降低了花生生物量。

（2）PE和Cd復(fù)合污染條件下，無論是低濃度Cd（25 μmol·L）污染還是高濃度Cd（100 μmol·L）污染，添加PE均顯著提高了花生MDA含量，抗氧化酶活性和Cd吸收，抑制了花生根系活性和生長，且隨著PE添加量的增加，其作用程度增強，說明微塑料會加劇Cd對植物的毒性。

（3）雙因素分析表明，PE和Cd交互時對花生生長、MDA含量、抗氧化酶活性和Cd吸收均表現(xiàn)出顯著影響，表明PE和Cd共存對花生幼苗生理毒性和Cd吸收表現(xiàn)出協(xié)同作用，實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)加強對地膜源微塑料和重金屬污染的管控。