張昆明, 陸麗金, 黃永春, 段 超, 徐 云, 任仙娥, 余慧群

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006；2.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西南寧 530004）

殼聚糖（CS）是一種天然的弱堿性多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，且安全無(wú)毒，因而常被加工制作成微球，并作為載體用來(lái)負(fù)載藥物，以降低藥物毒副作用，提高藥物穩(wěn)定性和生物利用率等[1]。乳化交聯(lián)是制備殼聚糖載藥微球最常用的方法之一，但該過(guò)程制備得到的微球粒度大（微米級(jí)），且粒度均一性差，導(dǎo)致微球靶向性差、藥物的生物利用率低，影響其后續(xù)應(yīng)用[2,3]。納米微球是一種粒度尺寸小于1.0μm 的顆粒[1]，與大粒徑（如：微米級(jí)）微球相比，小粒徑（如：納米級(jí)）的載藥微球具有更大優(yōu)勢(shì)，如增強(qiáng)藥物靶向性、控制藥物釋放、延長(zhǎng)藥效等[2]。因而，近年來(lái)有報(bào)道采用高壓膜乳化[1]、超聲乳化[4]、靜電乳化[5]和微流控[6]等技術(shù)來(lái)制備粒度均一、分布窄或單分散性的微球，但這些技術(shù)存在工藝耗時(shí)長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低、成本高，且能耗高等缺陷[1,4～6]。因此，開(kāi)發(fā)新技術(shù)強(qiáng)化/改善傳統(tǒng)乳化交聯(lián)過(guò)程，以制備納米級(jí)的殼聚糖載藥微球具有重要意義。

水力空化作為一種新型過(guò)程強(qiáng)化技術(shù)，在納米顆粒制備領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[7～12]。例如，張昆明等[8]采用文丘里管空化強(qiáng)化離子交聯(lián)過(guò)程制備了殼聚糖抗菌微球，所得微球最小粒徑為329.4 nm，和傳統(tǒng)工藝相比，平均粒徑減小了20.5% 。Sonawane 等[9]采用具有5 個(gè)孔、孔徑1 mm 的孔板水力空化制備出CaCO3顆粒，得到的顆粒平均粒徑為37 nm，與未經(jīng)空化處理相比，平均粒徑減小了63.4%。Hao 等[10]采用水力空化制備SiO2納米潤(rùn)滑劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)空化處理時(shí)間從15 min 延至90 min時(shí)，SiO2顆粒的平均粒徑從2668 nm 減小至585 nm。Wang 等[11]以初始形態(tài)不規(guī)則、數(shù)百微米的NaCS 為樣品，采用水力空化強(qiáng)化超臨界流體輔助霧化技術(shù)制備出的NaCS 的平均粒徑為0.3～3.0μm，這歸因于水力空化的引入強(qiáng)化了混合器內(nèi)的兩相傳質(zhì)，增強(qiáng)了混合效果，極大地降低了反應(yīng)時(shí)的傳質(zhì)阻力；Peng 等[12]也證實(shí)了這一結(jié)論。而且，水力空化具有簡(jiǎn)便易行、能耗低、能效高和易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)[7,13]。然而，撞擊流-射流空化（IS-JC）作為水力空化的一種形式，迄今尚未見(jiàn)有用于殼聚糖微球制備的研究報(bào)道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用超聲/水力空化乳化可制備得到粒度分布較為均一的殼聚糖W/O 型納米乳液[14,15]，這為IS-JC 強(qiáng)化/改善反相乳液交聯(lián)過(guò)程，并制備均一的納米級(jí)殼聚糖微球提供了可能?；诖耍疚囊?-氟尿嘧啶（5-Fu）為模型藥物、戊二醛為交聯(lián)劑，采用IS-JC 連續(xù)作用于常規(guī)乳液交聯(lián)過(guò)程中的W/O 乳化和交聯(lián)反應(yīng)2 個(gè)關(guān)鍵步驟制備出粒徑小，粒度分布均勻的5-Fu 殼聚糖納米微球，且在相同配比工藝下，IS-JC 處理單位體積料液獲得單位質(zhì)量微球的能耗為1.623×108kJ/(m3·kg)，顯著低于超聲乳化處理單位體積料液獲得單位質(zhì)量微球的能耗5.831×1010kJ/(m3·kg)；同時(shí)探討了油相種類(lèi)和殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)（酸性溶劑種類(lèi)、溶劑pH值、殼聚糖溶液初始濃度）對(duì)微球粒徑大小、粒度分布、表面形貌及其產(chǎn)率的影響，并利用掃描電鏡（SEM）、紅外光譜（FT-IR）、X 射線衍射（XRD）和熱重分析（TGA）等手段對(duì)其進(jìn)行表征，以期為IS-JC制備均一粒度分布的納米級(jí)殼聚糖載藥微球提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與設(shè)備

CS：相對(duì)分子質(zhì)量5×105，脫乙酰度90%，深圳中發(fā)源生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu）：醫(yī)藥級(jí)，純度為99%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)有限公司；棕櫚油、棕果油（棕櫚頂級(jí)液油）、大豆油、玉米油：食品級(jí)，天津聚龍糧油有限公司；麻瘋籽油：云南神宇新能源有限公司；液體石蠟、煤油：化學(xué)純，西隴科學(xué)股份有限公司；Span80：化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；25%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛水溶液等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，電導(dǎo)率4.0μs/cm。

撞擊流-射流空化耦合元件：自行研制；精密增力電動(dòng)攪拌器：JJ-1 型，江蘇常州國(guó)華電器有限公司；pH 計(jì)：PE20 型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)：J-26 XPI 型，美國(guó)Beckman Coulter 公司；真空干燥箱：DZ-2AII 型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與制備流程

撞擊流-射流空化實(shí)驗(yàn)裝置如Fig.1 所示[16]。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：稱(chēng)量5.0 g 5-Fu 充分溶解于一定pH 值的500.0 mL 酸性溶劑中，再緩慢加入適量的殼聚糖，攪拌至固體充分溶解，靜置1.0 h，用雙層濾布除去不溶性雜質(zhì)，配制成一定濃度的5-Fu 殼聚糖溶液（水相）；在（55±2）℃水浴中，將Span 80 添加到有機(jī)分散介質(zhì)（油相）中，連續(xù)攪拌5 min，使二者充分混合均勻（油相）；隨后，在相同溫度下，將5-Fu 殼聚糖溶液（水相）以20 mL/min 加入到油相中，連續(xù)攪拌20 min，制得殼聚糖W/O 型粗乳液（乳液A）。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)操作，將戊二醛溶液（水相）加入到上述相同油相中，制得戊二醛W/O 型粗乳液（乳液B）；以上攪拌速率均控制為450 r/min。

Fig.1 Schematic presentation of the experimental set-up for impinging stream-jet cavitation process

將上述乳液A 傾倒入料液槽（1）中，開(kāi)啟驅(qū)動(dòng)泵（2）和（3），打開(kāi)循環(huán)冷凝水（-5～100 ℃范圍可控），調(diào)節(jié)閥門(mén)V1和V2，控制撞擊流-射流空化元件（4）的撞擊室壓力（Pi）為0.22 MPa，并通過(guò)壓力表P1 進(jìn)行監(jiān)測(cè)；調(diào)節(jié)冷凝水溫度，控制水力空化乳化溫度為（55±2）℃，連續(xù)乳化20 min，得到殼聚糖W/O 型納米乳液（乳液C）。此時(shí)，在相同溫度下，將乳液B 以20 mL/min 添加至乳液C 中進(jìn)行水力空化交聯(lián)固化40 min；待反應(yīng)結(jié)束后，收集料液，用冰水混合物迅速冷卻至室溫，離心，沉淀用石油醚反復(fù)洗滌5 次，真空干燥，即得到載5-Fu 藥物的殼聚糖納米微球。

除非特別說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用的有機(jī)分散介質(zhì)為棕櫚油，殼聚糖初始溶液濃度（cf）為10.0 g/L，酸性溶劑為pH 3.6 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（HAc-NaAc）；對(duì)于乳液A 和B，其油相體積分別為2455 mL 和480 mL，內(nèi)水相含量（φw）為15.0%，Span 80 體積分?jǐn)?shù)（φs）為3.7%，即：殼聚糖溶液用量為367 mL、戊二醛溶液用量為72 mL；Span80 用量分別為90 mL 和18 mL。空白微球?yàn)樯鲜鱿嗤苽錀l件下未包裹5-Fu 藥物的殼聚糖納米微球。

實(shí)驗(yàn)采用的撞擊流-射流空化耦合元件結(jié)構(gòu)如Fig.2 所示。撞擊角度為180°，噴嘴直徑(e)為8.5 mm，噴嘴間距(D1)為15.0 mm，入口段長(zhǎng)度(L1)為45 mm，出口段長(zhǎng)度(L2)為35.0 mm，出口直徑(D2)為20.0 mm，收縮段長(zhǎng)度(a)為10.2 mm，喉管段長(zhǎng)度(b)為12.0 mm，擴(kuò)張段長(zhǎng)度(c)為18.0 mm，喉管直徑(d)為3.6 mm，入口錐角(α)為30°，出口錐角(β)為25°。殼聚糖與戊二醛通過(guò)醛氨縮合生成席夫（Schiff）堿，共價(jià)交聯(lián)的反應(yīng)方程式如Fig.3 所示。

Fig.2 Schematic presentation of the structure for impinging stream-jet cavitation (venturi tube) reactor

Fig.3 Schematic presentation of the crosslinking reaction process between chitosan and glutaraldehyde

1.3 微球的結(jié)構(gòu)與性能表征

1.3.1 平均粒徑和多分散性指數(shù)（PDI）的測(cè)定：取適量空化交聯(lián)固化后含有微球的水分散體系，添加至專(zhuān)用比色皿中，然后用英國(guó)Malven 公司Nano-ZS90 型激光納米粒度分析儀進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定微球粒徑大小和多分散性指數(shù)（PDI）。測(cè)定條件為：溫度為25 ℃，平衡時(shí)間為2 min，散射角為90°，折光率為1.33。PDI 是分散顆粒不均勻性的量度，其值越低，顆粒的均勻性越好。一般認(rèn)為，當(dāng)PDI＞0.7 時(shí)，顆粒的粒徑分布寬[14,17]。

1.3.2 SEM 分析：將干燥的殼聚糖微球粉末用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺(tái)上，經(jīng)噴金處理后，采用荷蘭艾恩德霍芬復(fù)納科學(xué)儀器有限公司Phenom ProX 掃描電鏡調(diào)節(jié)不同的放大倍數(shù)觀察微球的形態(tài)。測(cè)試電壓為10.0 kV。

1.3.3 FT-IR 表征：取少量干燥樣品，KBr 壓片法制樣，采用美國(guó)Perkin Elmer 公司LR64912C 型傅里葉變換紅外光譜儀在室溫對(duì)樣品進(jìn)行紅外表征，分析5-Fu 殼聚糖納米微球的主要官能團(tuán)。測(cè)試掃描波數(shù)范圍為500～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。

1.3.4 XRD 分 析：采 用 德 國(guó)Bruker 公 司D8AA25 型X 射線衍射儀對(duì)干燥后的殼聚糖納米微球進(jìn)行晶型結(jié)構(gòu)分析。測(cè)試管電壓為40 kV，電流為30 mA，掃描范圍的衍射角為2θ=10° 70°，步寬為0.02°。

1.3.5 TGA 分析：分別取少量干燥的5-Fu、殼聚糖、空白微球和5-Fu 殼聚糖納米微球至于小坩堝中，采用德國(guó)Nachi 公司TG209F3 型熱重分析儀進(jìn)行測(cè)試，測(cè)定微球的熱穩(wěn)定性。測(cè)試溫度范圍為30～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

1.4 油相分子結(jié)構(gòu)表征

將IS-JC 作用下交聯(lián)固化后的料液離心，取適量上層油相，采用紅外光譜儀在室溫下對(duì)其進(jìn)行FTIR 測(cè)試；并與未經(jīng)IS-JC 作用的棕櫚油進(jìn)行比較，以分析棕櫚油微觀分子結(jié)構(gòu)在IS-JC 作用下是否發(fā)生氧化和降解。測(cè)試掃描波數(shù)范圍為500～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。

1.5 殼聚糖微球產(chǎn)率測(cè)試

取IS-JC 作用下制備的空白微球，在交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將沉淀物洗滌并于50 ℃真空干燥、稱(chēng)量，所得微球的產(chǎn)率（X）計(jì)算公式如式（1）[18]

式中：mo——干燥后殼聚糖空白微球的總質(zhì)量；m1和m2——分別為戊二醛和殼聚糖的初始干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 油相種類(lèi)對(duì)微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響

在微觀層面上，不同種類(lèi)的油相（有機(jī)分散介質(zhì)）由于理化性質(zhì)（如：黏度）的差異，使其與微球的粒度大小、分布及顆粒形貌密切相關(guān)[1]。由Tab. 1，F(xiàn)ig.4 和Fig.5 可 知，在IS-JC 作 用 下，當(dāng) 油 相 為 棕 櫚油、玉米油和大豆油時(shí)，洗滌后得到的沉淀均呈顆粒狀，且微球產(chǎn)率接近（Tab. 1 和Fig.4），交聯(lián)固化40 min 后均達(dá)29.6～32.5%。然而，當(dāng)麻瘋籽油作為油相時(shí)，干燥后的沉淀物為不規(guī)則塊狀團(tuán)聚物（Fig.5(c)），且產(chǎn)率高達(dá)42.6%；當(dāng)石蠟油、煤油作為油相時(shí)，僅有少量沉淀生成，產(chǎn)率僅為1.9～8.3%（Tab.1 和Fig.4）。這一方面可能是由于麻瘋籽油自身分子結(jié)構(gòu)所致，另一方面可能是麻瘋籽油酸值（23.7 mgKOH/g）顯著高于其他4 種食用油的酸值（＜1.0 mgKOH/g），這些富余的高級(jí)脂肪酸，如油酸、軟脂酸等改變了原乳液顆粒的界面性質(zhì)；而石蠟油、煤油作為油相時(shí)，水力空化乳化制備的殼聚糖W/O 乳狀液形成不透明的稠狀/奶酪狀白色液體，且呈現(xiàn)出具有高黏性的非牛頓假塑性乳液，乳液流動(dòng)性較差，室溫測(cè)定其乳液黏度可高達(dá)113.5 mPa·s[14]，這一結(jié)果導(dǎo)致負(fù)載殼聚糖的W/O 和負(fù)載戊二醛的W/O乳滴二者間相互接觸的傳質(zhì)阻力增大，大大降低了二者相互碰撞的機(jī)會(huì)，阻礙了殼聚糖分子中的氨基（—NH2）與戊二醛分子中的（—CHO）交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，因而導(dǎo)致微球產(chǎn)率較低。

Fig.4 Visual observation of the sediments (a)before and (b)after washing with petroleum ether, when the type of oil phase was changed.

Tab. 1 Effects of different types of oil on the features of the microspheres

Fig.5 Effects of different types of oil on the surface morphologies of the microspheres

然而，棕櫚油、玉米油和大豆油作為分散介質(zhì)，其制備的殼聚糖W/O 型乳狀液均呈淡黃色且流動(dòng)性較好，室溫測(cè)定其乳液黏度僅為44.8～61.2 mPa·s。此外，大豆油和玉米油作為分散介質(zhì)制備的微球粒度和PDI 均較大，微球粒徑分別為517.2 nm 和523.5 nm，PDI 分別為0.573 和0.565。棕櫚油作為分散介質(zhì)制備的微球粒度最小，且分散性最好，其粒徑為392.3 nm，PDI 為0.535，說(shuō)明棕櫚油作為油相制備的微球顆粒更小，且粒度分布更加均勻。微球粒度、PDI 和產(chǎn)率均與棕櫚油接近，這主要是由于棕果油實(shí)為棕櫚頂級(jí)液油，屬精煉植物油[19]，二者成分及特征相似，因而制備的微球顆粒特征和產(chǎn)率也極為相近，但棕果油價(jià)格顯著高于棕櫚油價(jià)格。因此，綜合考慮各因素，以棕櫚油作為有機(jī)分散介質(zhì)為宜。

2.2 殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)對(duì)微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響

高分子殼聚糖濃溶液屬于典型的非牛頓假塑性流體，其流變學(xué)性質(zhì)對(duì)酸性溶劑種類(lèi)、pH 值和自身溶液濃度表現(xiàn)出依賴(lài)性[14,20～23]。為了弄清楚在ISJC 作用下，殼聚糖微球的顆粒特征（如粒徑大小、粒度分布、表面形貌）、產(chǎn)率與其溶液流變學(xué)性質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系，考察了酸性溶劑種類(lèi)、溶劑pH 值和殼聚糖溶液初始濃度對(duì)微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響。

2.2.1 酸性溶劑種類(lèi)的影響：王偉等[20]研究表明，殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)具有溶劑性質(zhì)的依賴(lài)性。因此，在相同pH2.18 下，考察酸性溶劑種類(lèi)對(duì)IS-JC 制備的微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響。由Tab. 2 和Fig.6可知，當(dāng)殼聚糖分別用1%甲酸、10%乙酸作為溶劑時(shí)，IS-JC 交聯(lián)固化40 min 后二者微球的產(chǎn)率分別為35.67%和36.62%，但均不屬于微球顆粒（Fig.6(a)和Fig.6(b)），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者得到的沉淀均為類(lèi)似果凍的黃色水凝膠狀物。然而，在相同pH 值下，采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液作為溶劑時(shí)，IS-JC 制備得到的沉淀為淡黃色顆粒，表面光滑，且分散性好（Fig.6(c)），且微球產(chǎn)率達(dá)43.15%，但該條件下微球粒徑為1536.7 nm、PDI 為0.952。這一結(jié)果表明，殼聚糖微球的粒徑大小、粒度分布、顆粒形貌和微粒的生成對(duì)酸性溶劑種類(lèi)具有較強(qiáng)依賴(lài)性。這可能是由于在相同（近）pH 值下，殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)具有溶劑性質(zhì)依賴(lài)性，也即在相同（近）pH 值下，不同酸性溶劑種類(lèi)由于自身離子種類(lèi)及數(shù)量的差異對(duì)具有相同分子結(jié)構(gòu)的殼聚糖溶解性及其溶液黏度影響很大，例如：在相同pH 值條件下，殼聚糖在甲酸中的黏度高于乙酸中的黏度[20]；此外，盡管溶劑pH 值相同，殼聚糖的分子構(gòu)象和理化性質(zhì)也會(huì)因溶劑類(lèi)型的不同而產(chǎn)生差異[21]。以上2 種因素的共同作用，導(dǎo)致高分子殼聚糖溶于相同pH 值的不同酸性溶劑時(shí)，殼聚糖分子與戊二醛分子交聯(lián)產(chǎn)生的沉淀結(jié)構(gòu)有著明顯的差別。

Tab. 2 Effects of different types of acidic solvents with the same pH value of ca. 2.18 on the features of the microspheres

Fig.6 Effects of different types of acidic solvents with the same pH value of ca. 2.18 on the surface morphologies of the microspheres

2.2.2 酸性溶劑pH 值的影響：殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)同樣表現(xiàn)出具有溶劑pH 值依賴(lài)性[22]。因此，以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（HAc-NaAc）為酸性溶劑，考察pH 值對(duì)IS-JC 制備的微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響。由Tab. 3，F(xiàn)ig.7(a)和Fig.7(b)可知，當(dāng)HAc-NaAc的pH 值由3.6 升高至4.0 時(shí)，IS-JC 制備的殼聚糖納米微球粒度由392.3 nm 增大至678.5 nm，PDI 值由0.535 升高至0.819，但二者的微球產(chǎn)率接近。這一結(jié)果說(shuō)明，在相同酸性溶劑下，增大溶劑pH 值不利于得到小粒度的殼聚糖微球，且微球的粒度分布變寬。同時(shí)，當(dāng)溶劑HAc-NaAc 為pH3.6 時(shí)，制備得到的微球形貌更加圓整、規(guī)則，且表面更加光滑（Fig.7(a)），而溶劑pH4.0 制備得到的微球顆粒圓整性差，呈不規(guī)則形狀（Fig.7(b)）；當(dāng)溶劑HAc-NaAc 的pH 值繼續(xù)增大至4.6 和5.0 時(shí)，所得沉淀均為塊狀團(tuán)聚物（Fig.7(c)和Fig.7(d)），但微球產(chǎn)率沒(méi)有發(fā)生明顯變化。這一結(jié)果說(shuō)明，在相同HAc-NaAc 溶劑下，增大溶劑pH 值，所制備的微球顆粒形狀越不規(guī)則，即ISJC 制備得到的微球顆粒性變差，表面粗糙度越發(fā)明顯，且顆粒的不規(guī)則性加劇。這主要是由于增大溶劑pH 值，殼聚糖溶液的黏度也隨之增大，其溶液的非牛頓屬性增強(qiáng)[14,23]，促使IS-JC 的空化阻力加大，導(dǎo)致水力空化乳化過(guò)程中生成的乳滴粒度增大，乳滴間易發(fā)生聚結(jié)或絮凝現(xiàn)象，乳滴大小分布變寬，從而造成負(fù)載殼聚糖的W/O 乳滴和負(fù)載戊二醛的W/O 乳滴在接觸碰撞發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后，生成微球的顆粒特征出現(xiàn)了上述差異。此外，由Tab. 3，F(xiàn)ig.7(a)和Fig.7(e)可知，當(dāng)溶劑pH 值為3.6，HAc-Ac-總濃度為1.0 mol/L，Na+濃度為0.151 mol/L 時(shí)，IS-JC 制備的殼聚糖微球粒度為405.6 nm、PDI 為0.542，產(chǎn)率為31.69%。這與相同pH3.6，而HAc-Ac-總濃度為1.65 mol/L，Na+濃度為0.249 mol/L 時(shí)制備的微球粒徑、PDI 和產(chǎn)率相接近，且微球形貌均呈顆粒狀，形態(tài)規(guī)則（Fig.7 (a)和Fig.7(e)）；類(lèi)似地，當(dāng)pH5.0 的HAc-Ac-總濃度分別為0.20 mol/L，0.23 mol/L 和1.00 mol/L，Na+濃度分別為0.128 mol/L，0.147 mol/L 和0.640 mol/L 時(shí)，IS-JC 制備所得的沉淀均為塊狀團(tuán)聚物（Fig.7 (d),Fig.7(f)和Fig.7(g)），但三者產(chǎn)率接近。以上研究結(jié)果表明，在相同pH 值的HAc-NaAc 溶劑下，其離子數(shù)量的改變并未對(duì)IS-JC 制備的微球粒徑大小、粒度分布、產(chǎn)率和微球生成產(chǎn)生明顯影響，但以上特征卻表現(xiàn)出相同溶劑pH 值依賴(lài)性。綜合考慮，HAc-NaAc 的pH 值以3.6 為宜。

Tab. 3 Effects of different pH values at the same acidic solvent on the features of the microspheres

Fig.7 Effects of pH value at the same acidic solvent on the surface morphologies of the microspheres

2.2.3 殼聚糖溶液初始濃度（cf）的影響：殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)與其溶液濃度密切相關(guān)[22]。因此，在其他實(shí)驗(yàn)條件保持一致的情況下，考察cf對(duì)IS-JC 制備的微球顆粒特征及產(chǎn)率的影響。由Tab. 4 和Fig.8可知，cf對(duì)IS-JC 制備殼聚糖微粒的成球性及顆粒形貌有著顯著影響。當(dāng)cf5.0 g/L 時(shí)，IS-JC 制備得到的沉淀均為塊狀團(tuán)聚物（Fig.8(a～c)）。這一研究結(jié)果和Varma 等[24]采用傳統(tǒng)工藝制備殼聚糖微球的研究結(jié)果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)cf5.0 g/L 時(shí)，殼聚糖與戊二醛交聯(lián)后未見(jiàn)有微粒生成。Al-Helw 等[25]也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)論。而當(dāng)cf增大至10.0 ～15.0 g/L時(shí)，IS-JC 均制得顆粒狀、分散性好的殼聚糖微球，且當(dāng)cf為10.0 g/L 時(shí)，制備的微球顆粒飽滿(mǎn)，表面光滑（Fig.8(d)），而當(dāng)cf增大至15.0 g/L 時(shí)，微球表面粗糙度增大，并出現(xiàn)了團(tuán)聚現(xiàn)象（Fig.8(e)）。由Tab. 4還可知，當(dāng)cf從10.0 g/L 增大至15.0 g/L 時(shí)，IS-JC 制備的微球粒徑由392.3 nm 增大至506.1 nm，PDI 由0.535 升高至0.561，產(chǎn)率由31.24%增大至41.58%。這一結(jié)果說(shuō)明，盡管在IS-JC 作用下，增大cf，微球粒徑也隨之增大，且分布均勻性變差，但產(chǎn)率隨之提高。以上研究結(jié)果表明，微球的粒徑大小、粒度分布、顆粒形貌和微粒的生成對(duì)cf具有較強(qiáng)依賴(lài)性。綜合考慮，cf以10.0 g/L 為宜。

Fig.8 Effects of initial chitosan concentration on the surface morphologies of the microspheres

Tab. 4 Effects of initial chitosan concentration on the features of the microspheres

2.3 微球結(jié)構(gòu)及性能分析

2.3.1 FT-IR 分析：Fig.9 為殼聚糖、空白微球和5-Fu 殼聚糖納米微球的FT-IR 圖。由曲線a 可知，3438 cm-1處為—OH 伸縮振動(dòng)吸收峰，2914 cm-1和2852 cm-1處為2 個(gè)—CH 的伸縮振動(dòng)吸收峰，1179 cm-1處為醚氧鍵C—O—C 吸收峰，1084 cm-1處為C—O 吸收峰。曲線b 中，1639 cm-1和1559 cm-1處分別對(duì)應(yīng)殼聚糖微球中的C=O 和C=N 伸縮振動(dòng)吸收峰。對(duì)比曲線a,b 可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖自身的酰胺I 譜帶和—NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰分別在1597 cm-1和1658 cm-1 處；殼聚糖與戊二醛發(fā)生交聯(lián)后，殼聚糖微球中—NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰轉(zhuǎn)移至1559 cm-1處，說(shuō)明有亞胺基團(tuán)C=N 鍵的生成。以上分析結(jié)果說(shuō)明，殼聚糖與戊二醛之間產(chǎn)生了比較強(qiáng)的分子間作用力，殼聚糖與戊二醛交聯(lián)成功。曲線c 中，900 cm-1處對(duì)應(yīng)5-Fu 的C—H 面外彎曲振動(dòng)吸收峰，1250 cm-1處對(duì)應(yīng)著5-Fu 的C—N 伸縮振動(dòng)吸收峰，對(duì)比曲線b,c 可以發(fā)現(xiàn)，曲線c 中除了5-Fu 的特征峰以外，其它峰與曲線b 基本一致，這說(shuō)明5-Fu 成功負(fù)載于殼聚糖微球之中。

Fig.9 FT-IR spectra of (a)chitosan, (b)chitosan nanomicrospheres and (c)5-Fu chitosan nano-microspheres

2.3.2 XRD 分析：Fig.10 為5-Fu、殼聚糖和5-Fu 殼聚糖納米微球的XRD 圖。由曲線a 和b 可知，5-Fu 在2θ=30°附近有1 個(gè)尖銳的衍射吸收峰，殼聚糖在2θ=20°附近有1 個(gè)較強(qiáng)的衍射吸收峰。由曲線c 可知，殼聚糖微球在2θ=30°附近出現(xiàn)了5-Fu 的尖銳結(jié)晶峰，而殼聚糖在此處沒(méi)有出現(xiàn)5-Fu 的特征峰（曲線b），這說(shuō)明5-Fu 成功負(fù)載于殼聚糖微球之中。對(duì)比曲線b 和c 發(fā)現(xiàn)，5-Fu 殼聚糖微球在2θ=20°的衍射峰平而寬，強(qiáng)度明顯減弱，這說(shuō)明殼聚糖與戊二醛分子間交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)降低了殼聚糖的結(jié)晶度，且制得的殼聚糖微球主要以無(wú)定形結(jié)構(gòu)存在。

Fig.10 XRD patterns of (a)5-Fu, (b)chitosan and(c)5-Fu chitosan nano-microspheres

2.3.3 TGA 分析：Fig.11 為5-Fu、殼聚糖、空白微球和5-Fu 殼聚糖納米微球的TGA 曲線圖。由曲線a可知，5-Fu 失重分2 個(gè)階段：第1 階段（240～350 ℃）質(zhì)量急劇下降，失重率為75.8%，這是由于5-Fu 分子結(jié)構(gòu)中的嘧啶環(huán)降解導(dǎo)致；第2 階段（350～800 ℃）質(zhì)量緩慢下降，這是由于5-Fu 逐漸炭化的結(jié)果。曲線b 顯示，殼聚糖失重分3 個(gè)階段：第1 階段（30～95 ℃）的失重率為9.8%，這是由于失去吸附的水和結(jié)晶水所致；第2 階段（220～400 ℃）質(zhì)量下降顯著，失重率為44.8%，這是由于殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵發(fā)生斷裂，主鏈降解所致；第3 階段（400～800 ℃）的失重率約為15.6%，這是由于殼聚糖分子中吡喃環(huán)的降解及炭化所致?？瞻孜⑶?、5-Fu 殼聚糖納米微球和殼聚糖具有相似的失重規(guī)律。由曲線c 和d 可知，空白微球在第2 個(gè)失重階段（95～370 ℃）的失重率為35.2%，然而5-Fu 殼聚糖納米微球在第2 個(gè)失重階段（95～370 ℃）的質(zhì)量損失更大，失重率達(dá)49.6%，這是微球中5-Fu 共同受熱分解的結(jié)果，說(shuō)明殼聚糖微球?qū)?-Fu 的包埋降低了其熱穩(wěn)定性，也進(jìn)一步佐證了5-Fu 藥物成功負(fù)載于微球中。

2.4 撞擊流-射流空化對(duì)棕櫚油微觀分子結(jié)構(gòu)的影響

IS-JC 效應(yīng)可誘導(dǎo)水溶液中的水（H2O）分子鍵斷裂產(chǎn)生羥自由基（·OH），并產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波、微射流、局部高溫和高壓等，這一系列效應(yīng)可將大分子化合物降解或氧化生成小分子化合物[7]。為了弄清IS-JC 效應(yīng)在制備殼聚糖納米微球過(guò)程中對(duì)棕櫚油微觀分子結(jié)構(gòu)的影響，采用FT-IR 表征微球制備前后棕櫚油分子的結(jié)構(gòu)變化。如Fig.12 所示，曲線a 和曲線b 分別為IS-JC 制備微球前、后棕櫚油的紅外光譜圖，可以發(fā)現(xiàn)，IS-JC 制備微球前后棕櫚油分子結(jié)構(gòu)的FT-IR 圖未發(fā)生變化，沒(méi)有出現(xiàn)油脂氧化產(chǎn)物的主要官能團(tuán)，例如：醛基（在1625～1750 cm-1處C=O 伸縮振動(dòng)，在2700～2750 cm-1及2800-2850 cm-1處C=O 兩側(cè)的C—H 伸縮振動(dòng)），酮基（在1625～1750 cm-1處C=O 伸縮 振動(dòng)）和羧基（在1650～1730 cm-1處C=O 伸縮振動(dòng)，在2400～3400 cm-1處O—H 伸縮振動(dòng)）。這一結(jié)果說(shuō)明，IS-JC 耦合反相乳液過(guò)程制備殼聚糖納米微球中沒(méi)有氧化產(chǎn)物的生成，IS-JC效應(yīng)并未對(duì)棕櫚油的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生降解作用；棕櫚油可作為有機(jī)分散介質(zhì)重復(fù)使用。這和Raviadaran等[26]采用超聲輔助制備棕櫚油W/O 型納米乳液的研究結(jié)果相一致。

Fig.12 FT-IR spectra of palm oil (a)before and (b)after preparation of chitosan nano-microspheres by ISJC process

3 結(jié)論

本文采用撞擊流-射流空化（IS-JC）耦合反相乳液過(guò)程制備了納米級(jí)5-Fu 殼聚糖微球，并考察了油相種類(lèi)和殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)對(duì)微粒特征和產(chǎn)率的影響。SEM 和激光納米粒度分析結(jié)果表明，ISJC 制備出的微球粒度小、分布窄、分散性好、顆粒飽滿(mǎn)，且表面光滑，最小粒徑和PDI 分別為392.3 nm 和0.535。水力空化乳化下，不同油相形成的W/O 乳液黏度和流體屬性存在差異，這顯著影響著后續(xù)交聯(lián)步驟中微球的生成和顆粒的形貌。微粒的生成、大小、分布及其形貌對(duì)酸溶劑類(lèi)型、相同溶劑pH 和cf表現(xiàn)出較強(qiáng)的依賴(lài)性。水力空化效應(yīng)未造成棕櫚油的微觀分子結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化并降解。IS-JC 效應(yīng)可連續(xù)強(qiáng)化常規(guī)乳液交聯(lián)過(guò)程中的W/O 乳化和交聯(lián)反應(yīng)2 個(gè)關(guān)鍵步驟，并生成粒度分布均勻的納米級(jí)殼聚糖載藥微球，為其在納米生物材料制備領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供了可能性。