楊 敏，劉笑蓉,2，曾 梅，周新茹，王志輝,2，童巧珍,2,3，周日寶,2,3*，劉湘丹,2,3*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室；3 湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208

博落回Macleayacordata(Willd.) R.Br為罌粟科博落回屬多年生直立草本植物，最早收載于《本草拾遺》，主產(chǎn)于湖南、云南、江蘇、浙江等地區(qū)[1]。博落回全草入藥，有大毒，不可內(nèi)服，外用具有祛風(fēng)散寒、解毒止痛、殺蟲等功效，用于治療滴蟲性陰道炎等各類炎癥[2]。博落回主要活性成分為生物堿，包括原阿片堿(protopine，PRO)、別隱品堿(allocryptine，ALL)、白屈菜紅堿(chelerythrine，CHE)、血根堿(sanguinarine，SAN)等異喹啉類生物堿[3]，其抗炎抗菌、抗腫瘤及改善肝功能等藥理作用顯著[4-8]。

博落回應(yīng)用廣泛，其作為特色中藥材資源有著非常大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。目前市場以博落回生物堿研制并上市的獸藥制劑主要有博落回散、博普總堿；博落回散，主成分為白屈菜紅堿和血根堿[9]，有消炎抗菌、促進(jìn)生長的作用；博普總堿，主要成分為原阿片堿及別隱品堿，有抗炎功效。博落回提取物還用作畜禽業(yè)的飼料添加劑，具有抗寄生蟲、抗菌等功能[10]，能提高畜禽的生產(chǎn)性能、生長性能、改善腸道、增加免疫力等[11,12]。博落回還是新型生物農(nóng)藥的原材料[13]。

隨著原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿等成分的市場需求量的不斷增加，人工種植博落回已具規(guī)模，目前市場主要以博落回葉和果作為相關(guān)生物堿提取原料，博落回根和莖則未被利用。博落回為多年生宿根草本，一般三年重種1次，具有量大的地下根系和地上莖，進(jìn)行博落回根、莖、葉、果化學(xué)組分對比研究并進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，可為充分利用博落回資源提供依據(jù)，具有十分重要的研究意義。

1 儀器及材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1260二極管陣列檢測器，德國安捷倫公司)；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；冰箱(BCD-452WDPF，青島海爾服務(wù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(Eco-S15，上海和泰儀器有限公司)；電子分析天平(ME204E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；中藥粉碎機(jī)(LG-08A，浙江瑞安市百信藥機(jī)器械廠)；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)(101-3AB，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 材料

原阿片堿對照品(19052101，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)、別隱品堿對照品(19052104，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)、血根堿對照品(19060502，純度99.94%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)、白屈菜紅堿對照品(20051408，純度99.77%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司樣品信息)、磷酸(天津市恒心化學(xué)試劑制造有限公司，分析純)、甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、鹽酸(湖南匯虹試劑有限公司，分析純)、乙腈(色譜純)。

1.3 藥材

本研究收集了17批博落回根樣品，14批博落回果實(shí)樣品，14批博落回葉樣品，10批博落回莖樣品，具體信息見表1。

表1 樣品信息表

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B，采用梯度洗脫(0～5 min，20% A；5～22 min，20%→40% A；22～37 min，40%→60% A；37～39 min，60%→25% A；39～40 min，25→20A%；40～42 min，20%A)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL，檢測波長：284 nm。

2.2 博落回不同器官指紋圖譜研究

2.2.1 對照品溶液制備

精密稱取原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿對照品適量，用甲醇溶解制得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.2.2 供試品溶液制備

取過60目篩博落回樣品約0.3 g，精密稱定，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇-1%鹽酸水溶液(1∶1)30 mL，稱定重量，超聲提取1 h后取出冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，制得樣品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

精密稱取S3號樣品0.3 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以血根堿為參照峰，測得10個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.15%～0.67%，相對峰面積的RSD在0.11%～4.24%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份0.3 g的S3號樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以血根堿為參照峰，測得10個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.01%～0.12%，相對峰面積的RSD在1.76%～4.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取S3號樣品0.3 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖。以血根堿為參照峰，測得10個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.02%～0.09%，相對峰面積的RSD在1.20%～4.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 參照峰選擇

在各批次博落回樣品色譜圖中血根堿峰分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大且為所有樣品共有，故確定血根堿峰為參照峰(S)。

2.2.7 博落回不同器官HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

取各批博落回樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各批樣品的色譜圖，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件”(2012.130723版)分別對博落回不同器官樣品HPLC色譜圖進(jìn)行多點(diǎn)矯正和色譜峰匹配(時(shí)間寬度為0.10)，用中位數(shù)法生成對照圖譜R，計(jì)算相似度，并建立博落回不同器官的特征圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17批根樣品共標(biāo)定了10個(gè)共有峰，14批果樣品共標(biāo)定了9個(gè)共有峰，14批葉樣品共標(biāo)定了9個(gè)共有峰，10批莖樣品共標(biāo)定了6個(gè)共有峰。博落回不同器官樣品與其對照圖譜的相似度均>0.9，說明大部分來源博落回樣品相似度良好。博落回不同器官色譜疊加圖見圖1，博落回不同器官對照特征圖譜見圖2(標(biāo)出的峰為共有峰)，不同器官樣品相似度評價(jià)結(jié)果見表2。

圖1 博落回不同器官HPLC指紋圖譜圖Fig.1 HPLC fingerprints of different organs of M.cordata注：A-根；B-果；C-葉；D-莖。Note:A-Root;B-Fruit;C-Leaf;D-Stem.

圖2 博落回不同器官對照特征圖譜Fig.2 Control fingerprint of different organs of M.cordata注：A-莖；B-葉；C-根；D-果。Note:A-Stem;B-Leaf;C-Root;D-Fruit.

表2 樣品相似度評價(jià)結(jié)果

2.2.8 部分特征峰指認(rèn)

進(jìn)一步確認(rèn)博落回樣品特征峰的化學(xué)信息，采用HPLC對博落回樣品對照特征圖譜中共有峰中的4個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)；通過與對照品對照，分別鑒定為原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿，結(jié)果見圖3。

圖3 混合對照品(A)和S1樣品(B)的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of reference substance(A) and S1 sample(B)注：1-原阿片堿；2-別隱品堿；3-血根堿；4-白屈菜紅堿。Note:1-PRO;2-ALL;3-SAN;4-CHE.

2.3 不同器官4種化學(xué)成分含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜條件同“2.1”項(xiàng)

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取生物堿對照品適量，用甲醇溶解分別制得濃度為1.0 mg/mL原阿片堿、別隱品堿，濃度為0.4 mg/mL血根堿、白屈菜紅堿對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.3.3 供試品溶液制備

取過60目篩博落回樣品約0.2 g，精密稱定，分別置于250 mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇-1%鹽酸水溶液(1∶1)20 mL，稱定重量，超聲提取1 h后取出冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，制得樣品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.2”項(xiàng)下原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿對照品儲備液適量，加甲醇溶液成倍數(shù)稀釋，配制成不同濃度對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各對照品峰面積。以各對照品峰面積為縱坐標(biāo)、各生物堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各生物堿線性回歸方程；原阿片堿：y=10 996 354.38x+60 697.60(R2=0.999 9)；別隱品堿：y=6 497 302.54x+30 215.55(R2=0.999 9)；血根堿：y=32 264 068.75x+99 772.67(R2=0.999 6)；白屈菜紅堿：y=27 972 245.40x+1 339.45(R2=0.999 9)。結(jié)果表明，原阿片堿、別隱品堿質(zhì)量濃度在0.012～0.800 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好；血根堿、白屈菜紅堿質(zhì)量濃度在0.005～0.400 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取S3號樣品0.2 g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄峰面積。計(jì)算原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿峰面積RSD分別為0.35%、0.54%、0.38%、0.28%，說明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份0.2 g的S3號樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣并記錄峰面積。計(jì)算原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿峰面積RSD分別為1.73%、1.80%、2.62%、2.64%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取S3號樣品0.2 g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣并記錄峰面積。計(jì)算原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿峰面積RSD分別為0.96%、0.12%、2.65%、0.99%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別精密稱定已知含量6份樣品各0.1 g，并加入適量對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明原阿片堿的平均回收率為103.74%(RSD=2.61%)，別隱品堿的平均回收率為97.18%(RSD=0.67%)，血根堿的平均回收率為105.20%(RSD=2.13%)，白屈菜紅堿的平均回收率為101.71%(RSD=2.71%)，結(jié)果見表3。表明該方法的回收率良好。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.9 樣品含量測定與分析

2.3.9.1 樣品含量測定

將各批博落回樣品按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，代入線性回歸方程，計(jì)算各生物堿含量，結(jié)果如表4。

表4 博落回不同器官4種化學(xué)成分含量

2.3.9.2 不同栽培品種博落回生物堿含量對比分析

對采自湖南常德(湖南省棉科所基地)的5個(gè)博落回栽培品種根、果、葉、莖中以上4種生物堿總含量進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖4。

2.3.9.3 野生博落回與栽培博落回不同器官生物堿含量對比分析

分別對野生博落回與栽培博落回根、莖、葉、果中以上4種生物堿及總生物堿均值進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖5。

圖4 不同栽培品種博落回生物堿總含量對比分析圖Fig.4 Comparative and analysis of total alkaloid content of M.cordata in different cultivars

圖5 野生博落回與栽培博落回不同器官生物堿含量對比分析圖Fig.5 Comparison and analysis of alkaloid content in different organs of wild M.cordata and cultivated M.cordata

2.4 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

分別將博落回根、果、葉樣品共有峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，采用OPLS-DA程序進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)的模型(見圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，累積解釋能力參數(shù)(R2X)分別為0.937、0.896、0.758，累積解釋能力參數(shù)(R2Y)分別為0.854、0.983、0.904，預(yù)測能力參數(shù)(Q2)分別為0.602、0.757、0.616，均大于0.5，表明該模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強(qiáng)，可用于區(qū)別博落回根、果、葉。由圖6A可知，各地博落回根藥材較分散，說明各個(gè)產(chǎn)地的博落回根樣品存在一定差異；由圖6B可知，博落回果主要分為兩大類，由圖6C可知，博落回葉也主要分為兩大類。綜合圖6中的三個(gè)圖可得出，采自常德棉科所的根、果、葉樣品均分別聚在一簇。

OPLS-DA模型中變量重要性投影(VIP)圖(見圖7)。以VIP值>1.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，由圖7A可知，博落回根共得到4個(gè)共有峰VIP值大于1，按VIP值大小排序?yàn)榉?>峰7(白屈菜紅堿)>峰1>峰3(別隱品堿)；由圖7B可知，博落回果共得到4個(gè)共有峰VIP值大于1，按VIP值大小排序?yàn)榉?(原阿片堿)>峰2(別隱品堿)>峰4>峰6(血根堿)；由圖7C可知，博落回葉共得到5個(gè)共有峰VIP值大于1，按VIP值大小排序?yàn)榉?>峰4>7(白屈菜紅堿)>峰5(血根堿)>峰9。說明這些化學(xué)成分對博落回根、果、葉具有顯著影響，是引起其質(zhì)量差異的主要潛在標(biāo)志性成分。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本研究共考察了270、284及300 nm三個(gè)檢測波長，研究發(fā)現(xiàn)，284 nm時(shí)原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿均能有較好吸收，且能檢測到樣品中更多的成分峰，各成分分離度及峰形均良好，故本研究選擇284 nm作為檢測波長。

3.2 不同來源、不同器官博落回藥材化學(xué)組分對比分析及質(zhì)量評價(jià)

本研究分別建立了博落回根、莖、葉、果化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果表明不同器官化學(xué)組分存在一定差異；從圖1可得，根和果中的化學(xué)成分種類較多，其次為葉，莖中檢測到的化學(xué)成分相對最少。本研究比較分析了博落回根、莖、葉、果中原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿含量，結(jié)果表明不同器官的以上4種生物堿含量存在差異，各器官4種生物堿總量高低順序依次為果>根>葉>莖(見圖5)。博落回莖中以上4種生物堿含量差異最小但均極低，博落回果中以上4種生物堿含量差異較小均較高，博落回根、葉中4種生物堿含量差異較大，其中原阿片堿和別隱品堿含量相對較高；分析發(fā)現(xiàn)，根中原阿片堿與別隱品堿含量均值分別大于果、葉中原阿片堿與別隱品堿含量均值(見圖5)。博落回為多年生草本植物，其根系發(fā)達(dá)，產(chǎn)量較高，根據(jù)研究結(jié)果博落回根可以作為原阿片堿、別隱品堿提取原料，以充分利用博落回資源。

圖6 樣品OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA score plot of samples注：A-根；B-果；C-葉。Note:A-Root;B-Fruit;C-Leaf.

圖7 重要性變量投影圖Fig.7 VIP plot of OPLS-DA注：A-根；B-果；C-葉。Note:A-Root;B-Fruit;C-Leaf.

生物堿類成分為植物生長過程不斷合成的次生代謝產(chǎn)物，結(jié)合表4和圖5可知，不同生長方式對博落回根、莖、葉生物堿的積累影響較小，果中的生物堿積累量在野生和栽培兩種生長方式下有一定差別，野生博落回果生物堿含量高于栽培博落回果生物堿含量。根據(jù)湖南省博落回果、葉地方標(biāo)準(zhǔn)[14，15]，博落回果及葉分別以血根堿與白屈菜紅堿之和、原阿片堿與別隱品堿之和作為等級劃分指標(biāo)，博落回果血根堿與白屈菜紅堿之和>1.5為一等品，博落回葉原阿片堿與別隱品堿之和>1.5為一等品。結(jié)果表明，本研究的野生與栽培果樣品血根堿與白屈菜紅堿之和均>1.5，野生與栽培葉樣品原阿片堿與別隱品堿之和均>1.5。由此可知，栽培博落回適應(yīng)性較好，可以通過人工栽培以滿足市場對于博落回原料的需求。結(jié)合圖4分析可知，采自常德棉科所的5個(gè)不同品種中博落回 CK JS樣品不同器官總生物堿含量均為最高，在后續(xù)栽培生產(chǎn)過程中可選育該品種進(jìn)行推廣種植。

3.3 博落回根、葉、果潛在質(zhì)量標(biāo)志物分析

本研究發(fā)現(xiàn)，博落回莖總生物堿含量低，且所含成分種類較少，未對其進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析?；凇?.4”項(xiàng)OPLS-DA分析結(jié)果可知，以VIP值>1為計(jì)，別隱品堿及白屈菜紅堿可作為博落回根潛在質(zhì)量標(biāo)志物；原阿片堿、別隱品堿、血根堿可作為博落回果潛在質(zhì)量標(biāo)志物；血根堿、白屈菜紅堿可作為博落回葉潛在質(zhì)量標(biāo)志物，其他標(biāo)定的未知共有峰需進(jìn)一步研究指正。

4 結(jié)論

本文對博落回根、莖、葉、果的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較分析，研究發(fā)現(xiàn)博落回不同器官化學(xué)組分存在差異，博落回根、果、葉中化學(xué)組分較豐富，莖中化學(xué)組分較少。進(jìn)行了博落回不同器官原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿4種生物堿含量測定，結(jié)果表明，野生博落回與栽培博落回的根、莖、葉的生物堿含量接近，果中生物堿含量差異較大，但均能達(dá)到博落回果和葉湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)要求，提示栽培的博落回適應(yīng)性強(qiáng)、品質(zhì)好。

目前市場主要以博落回葉、果作為生物堿的提取原料，根和莖未被利用；博落回為多年生宿根草本，具有量大的地下根系和地上莖；研究發(fā)現(xiàn)博落回莖中以上4種生物堿含量低，利用價(jià)值較低，而根中原阿片堿、別隱品堿含量高于果和葉，且資源量大，其可作為原阿片堿、別隱品堿的提取原料，以充分利用博落回資源。上述研究結(jié)果可為博落回的質(zhì)量控制和根的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。