鄭瑞兵，張卉卉，應(yīng)建飛，汪一萍

艱難梭菌（CD）屬于厭氧芽孢桿菌，能以芽孢形式長期存活于土壤或水環(huán)境中，經(jīng)糞-口途徑傳播，是抗生素相關(guān)性腹瀉和醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)性腹瀉重要病原體之一[1]。艱難梭菌感染（CDI）患者常表現(xiàn)為腹瀉、伴或不伴腹痛及發(fā)熱等癥狀，輕中度癥狀具有自限性，重度及暴發(fā)型感染患者則易引發(fā)全身癥狀，威脅患者生命健康[2]。我國CDI 發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升趨勢，作為我國丙類法定傳染病的重要病原體之一，CD的診斷與檢測技術(shù)評估，對疾病的二級預(yù)防具有重大意義[3-4]。社區(qū)獲得性艱難梭菌感染（CA-CDI）是指在醫(yī)院外罹患的CDI[5]。相關(guān)研究顯示，社區(qū)獲得性腹瀉中CDI 率為14%，培養(yǎng)陽性率為5%～6%[6]。CD 的毒性主要來源于兩大毒素，毒素A（tcd-A）為外毒素，結(jié)合腸黏膜刷狀緣以破壞其正常生理結(jié)構(gòu)；毒素B（tcd-B）發(fā)揮細(xì)胞毒作用，破壞腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)從而形成偽膜[7]。本研究選取社區(qū)來源非重復(fù)腹瀉糞便標(biāo)本，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR 法對tcd-B 基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，評估實(shí)時熒光定量PCR 法直接檢測糞便標(biāo)本與“金標(biāo)準(zhǔn)”[產(chǎn)毒培養(yǎng)法（TC）+細(xì)胞毒性酶免疫分析（EIA）][8]診斷結(jié)果的差異，為進(jìn)一步的CA-CDI 社區(qū)干預(yù)提供更多依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本 選取2016年4-10月寧波市社區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診的具有社區(qū)暴露史的腹瀉患者，符合：（1）腹瀉發(fā)病前6 周無住院經(jīng)歷；（2）非重復(fù)有效腹瀉標(biāo)本；（3）具有CDI 臨床診斷特征（危險因素+臨床表現(xiàn)）[9]；（4）社區(qū)暴露腹瀉樣本行CA-CDI檢測，以TC+EIA為“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。排除：（1）具有醫(yī)院暴露史；（2）重復(fù)腹瀉標(biāo)本。最終獲得有效腹瀉標(biāo)本329例，并及時進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。其中男191例，女138例；年齡3 ～81歲，平均（42.1±25.6）歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與運(yùn)輸 囑被檢測者于干燥清潔便盆內(nèi)自然排便，以無菌采便管/盒挑取糞便中存在黏液、膿液或血液的部分4 ～6 g（液體糞便≥5 ml），4℃保存，24 h 內(nèi)完成免疫學(xué)檢測。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 實(shí)時熒光定量PCR 法（1）儀器與試劑：儀器選取實(shí)時熒光定量PCR儀（Cepheid，美國），試劑采用艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒[（tcd-B）XY-DT-D-1330，xuanya]。（2）方法：拭子蘸取少量待測樣本插入含樣品處理液的小瓶后震蕩混勻，加樣后按照試劑盒說明書操作，將反應(yīng)體系放入熒光PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，并于退火/延長過程中記錄熒光信號。采用通用循環(huán)法，即以95℃10min 進(jìn)行酶活化；95℃15s 進(jìn)行變性，循環(huán)35 ～40 輪；60℃60s進(jìn)行退火/延伸。（3）反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光信號與Ct 值判斷擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2.2 TC+EIA 鑒定（1）CD 培養(yǎng)：取約0.2 ml 糞便標(biāo)本與Eugon 肉湯（美國BBL公司）1∶1 混勻，并于80 ℃加熱10 min；接種環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂平板（CCFA）和增菌肉湯，行35 ℃厭氧菌培養(yǎng)。如直接培養(yǎng)陰性可取變成紅色的肉湯轉(zhuǎn)移CCFA 繼續(xù)培養(yǎng)并鑒定；CD在CCFA上呈白色或淡黃色不透明的扁平狀“攤雞蛋樣”菌落，分離CD 菌株入－40 ℃低溫冰箱保存。（2）EIA 鑒定：采用毒素A+B 抗原ELISA 試劑盒（C.difficile toxins A+B ELISA，ELA4448 DRG，96T），檢測tcd-A、tcd-B。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以n（%）表示，待評估檢測手段與“金標(biāo)準(zhǔn)”診斷結(jié)果差異性檢驗采用McNemar 檢驗，一致性檢驗采用Kappa 分析。

2 結(jié)果

2.1 329例社區(qū)暴露腹瀉標(biāo)本CA-CDI檢測情況 艱難梭菌熒光PCR 檢測共檢測tcd-B陽性14例，陽性率為4.26%；其中包括1例熒光PCR 檢測CA-CDI（+）但培養(yǎng)（－）標(biāo)本。排除1例培養(yǎng)（+）但EIA 鑒定陰性標(biāo)本，TC 法共獲得產(chǎn)毒CD 17 株（5.17%），陽性菌株ELISA法定性測定毒素基因tcd-A 和tcd-B，15株標(biāo)本為tcd-A（+）、tcd-B（+）樣本；1 株為tcd-A（－）、tcd-B（+），1 株為tcd-A（+）、tcd-B（－）。

2.2 兩種檢測法對CA-CDI 檢測效能比較 艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對CA-CDI 檢測結(jié)果與“TC+EIA 鑒定”結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.375，雙側(cè)檢驗），一致性檢驗Kappa 值為0.831。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對CA-CDI 檢測靈敏度為76.47%，特異度為99.68%，見表1～2。

表1 實(shí)時熒光定量PCR與產(chǎn)毒培養(yǎng)對CACDI 檢測結(jié)果比較 例

2.3 兩種檢測法對tcd-B檢測效能比較艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對tcd-B 檢測結(jié)果與“TC+EIA 鑒定”結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.625，雙側(cè)檢驗），一致性檢驗Kappa 值為0.860。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對tcd-B 檢測靈敏度為81.25%，特異度為99.68%，見表2～3。

表2 實(shí)時熒光定量PCR 對不同診斷目標(biāo)的檢測效能參數(shù) %

表3 實(shí)時熒光定量PCR 與產(chǎn)毒培養(yǎng)對產(chǎn)毒基因tcd-B 檢測結(jié)果比較例

3 討論

CDI 是腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而產(chǎn)毒性CD大量繁殖并產(chǎn)生毒素導(dǎo)致的[11]。以往研究多著眼于醫(yī)院CDI 的檢測與治療，關(guān)于的CA-CDI 研究相對較少[12-13]。本研究就是著眼于CA-CDI，分析在社區(qū)暴露腹瀉患者群體中，病原分子生物學(xué)檢測手段的檢測效能。

現(xiàn)有的CDI 檢測技術(shù)包括糞便厭氧培養(yǎng)、EIA、谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測及熒光定量PCR 檢測等[14]。本研究選取實(shí)時熒光定量PCR 為主要待評估檢測手段，以TC+EIA 為“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）檢測CA-CDI 陽性率為4.26%；“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測CA-CDI 陽性率為5.17%（17/329），與以往研究中1%～7%的人群攜帶率相符[15]。出現(xiàn)1例實(shí)時熒光定量PCR 檢測樣本tcd-B（+）但培養(yǎng)（－）標(biāo)本，考慮為運(yùn)輸及保存過程中空氣暴露時間過長引起的假陰性結(jié)果。另有1例TC 法對樣本CA-CDI 檢測中培養(yǎng)（+），但進(jìn)一步EIA 檢測顯示均為陰性，考慮源于TC 無法區(qū)分產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒CD 的檢測缺陷導(dǎo)致[16]。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對社區(qū)暴露腹瀉樣本CA-CDI診斷靈敏度與特異度分別為76.47%和99.68%；對tcd-B 檢測靈敏度與特異度分別為 81.25%和99.68%；與“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測一致性分別達(dá)到0.831 和0.860。這說明社區(qū)暴露腹瀉樣本CA-CDI 產(chǎn)毒基因tcd-B 的實(shí)時熒光定量PCR 檢測效能較高，可代替TC 進(jìn)行快速的獨(dú)立檢測。

總之，實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測糞便樣本，具有簡單快捷且準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，對CA-CDI診斷效能良好，方便在基層醫(yī)療單位廣泛應(yīng)用。