王 冠

山西省長治醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，山西省長治市 046011

涎腺腺樣囊性癌(Adenoid cystic carcinoma of salivary gland，ACC)是口腔頜面部最為常見的腫瘤之一，存在嗜神經(jīng)侵襲特性[1-2]，而這一特性是該腫瘤復發(fā)、生存以及預后是否良好的重要因素。許多學者[3]在研究嗜神經(jīng)侵襲在惡性腫瘤復發(fā)的現(xiàn)象中，提出了多因子構(gòu)成的微環(huán)境促使嗜神經(jīng)侵襲的理論學說。大多數(shù)理論認為[3]，存在于神經(jīng)周圍的微環(huán)境是適于腫瘤細胞生長和增殖的，嗜神經(jīng)侵襲不僅造成腫瘤體積增大，其神經(jīng)分泌的神經(jīng)生長因子(Nerve growth factors，NGFs)可能通過抑制腫瘤細胞的凋亡，促進了增殖。

紅參為五加科人參栽培品的根莖，紅參皂苷是從紅參根莖浸出液中分離出的微量活性單體，是一種類固醇化合物，其中紅參皂苷Rh2在抑制腫瘤增殖與浸潤、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、促進腫瘤細胞凋亡等方面有一定的作用[4]，而被廣泛研究于抗腫瘤領(lǐng)域。人參皂苷Rh3在治療其他癌癥方面的功效已得到廣泛證實[5]，而關(guān)于紅參Rh2在抑制涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲方面卻鮮見報道。故而本文就紅參皂苷Rh2在抑制人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞體外嗜神經(jīng)增殖進行研究，以期為口腔臨床治療腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 紅參皂苷Rh2純品(北京創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所)，用DOSM溶解，RPMI-1640稀釋成所需濃度，0.22μm濾過膜過濾滅菌。ACC-M細胞系(中國科學院上海細胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；MTT(北京華美生物工程公司)，ELISA檢測NGFs試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器 CO2孵箱(Thermo，美國)，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，Multiskan Spectrun全波長酶標儀(BIO-TEK,美國)，超凈工作臺(蘇州凈化有限公司)。

1.3 細胞培養(yǎng) 將一凍存的ACC-M在37℃水浴箱中復溫，解凍，離心，吹打，再置于含10%胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)液中制成細胞懸液，并放入5%CO2，37℃，100%濕度培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 ACC-M單細胞懸液的制備：用0.25%胰蛋白酶進行消化，按1∶3的細胞比例進行傳代。觀察ACC-M細胞的生長狀態(tài)，選用對數(shù)生長期的細胞，棄去上層培養(yǎng)液，用PBS無菌液沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃孵箱中消化15min，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，終止其消化，以800r/min離心3min，加入PBS無菌液離心漂洗3次，用含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，細胞計數(shù)板調(diào)整ACC-M細胞濃度至4×103/ml。

1.4.2 面神經(jīng)的分離與培養(yǎng)：在顯微鏡下截取兩段各長約2cm SD大鼠面神經(jīng)，仔細剝離并棄去SD大鼠面神經(jīng)外膜及其血管，將兩段神經(jīng)纖維分別放置于含10ml的RPMI1640培養(yǎng)液的無菌細胞培養(yǎng)瓶中，備用。

1.4.3 制備面神經(jīng)培養(yǎng)液：在有面神經(jīng)的無菌細胞培養(yǎng)瓶中單獨培養(yǎng)面神經(jīng)，其上清液為面神經(jīng)培養(yǎng)液。48h后用10ml離心管收集，4℃冰箱保存，備用。

1.4.4 紅參皂苷Rh2處理細胞并分組培養(yǎng)：第1組為ACC-M對照組，設(shè)3列復孔，縱8行，共24孔，接種細胞懸液100μl，使每孔含細胞4 000個，再加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液100μl。第2組為面神經(jīng)培養(yǎng)液下的ACC-M組，設(shè)為實驗組1，設(shè)3列復孔，縱8行，共24孔，接種細胞懸液100μl，使每孔含細胞4 000個，再加入面神經(jīng)培養(yǎng)液100μl。第3組紅參皂苷Rh2處理面神經(jīng)培養(yǎng)液下的ACC-M組，設(shè)為實驗組2，設(shè)3列復孔，縱8行，共24孔，接種細胞懸液100μl，使每孔含細胞4 000個，再加入40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、240μg/ml紅參皂苷Rh2 100μl。上述分組分別在96孔培養(yǎng)板中進行，按時間的先后順序分別接種三板，再將培養(yǎng)板放入5%、37℃、100%濕度孵箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24h、48h和72h后，待檢測。

1.4.5 MTT法檢測ACC-M增殖情況：以24、48、72h時間點為準，實驗終止前4h，每孔中加入MTT應用液(5mg/ml)20μl，再次放入5%CO2、37℃、100%濕度孵箱中培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加二甲亞砜(DMSO)溶液150μl，震蕩10min，以空白對照孔(無細胞)在Multiskan Spectrun全波長酶標儀上調(diào)零，測定490nm吸光度值。檢測各孔的OD值減去空白對照組OD值即為其實際數(shù)值。

1.4.6 ELISA法檢測NGFs濃度。用無菌管收集面神經(jīng)培養(yǎng)液下培養(yǎng)的ACC-M細胞培養(yǎng)液，紅參皂苷Rh2處理的面神經(jīng)培養(yǎng)液下的ACC-M細胞培養(yǎng)液，兩液都以2 000～3 000r/min離心20min，4℃冰箱保存，備用。設(shè)標準管8管，第1管加標本稀釋液900μl，第2～8管加入標本稀釋液500μl。在第1管中加入20ng/ml的標準品溶液100μl混勻后用加樣器吸出500μl，移至第2管，如此反復做對倍稀釋，從第7管中吸出500μl棄去。第8管為空白對照。分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl，加樣將樣品加于酶標板孔底部，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120min。棄去液體，甩干。每孔加檢測溶液A工作液 100μl，酶標板加上覆膜, 37℃反應60min。溫育60min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2min，大約400μl/孔，甩干。每孔加檢測溶液B工作液100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60min。溫育60min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2min，350μl/孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色。依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。OD值可代表培養(yǎng)液當中神經(jīng)生長因子(NGFs)濃度的大小，隨即用全波長酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 紅參皂苷Rh2處理面神經(jīng)培養(yǎng)液下ACC-M細胞數(shù)量與形態(tài)學觀察 由圖1可知，對照組培養(yǎng)的ACC-M細胞形態(tài)為單層，稀薄狀排列，鵝卵石樣鑲嵌，胞間稀疏，細胞為多邊形，有棱角，邊界較清楚，胞漿較豐富，并可見少許處于分裂相的細胞(圖1a)； 面神經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的ACC-M細胞形態(tài)呈單層，致密排列，鑲嵌融合，細胞間連接較為緊密，細胞為多邊形，邊界清楚，胞漿非常豐富，并可見多個處于分裂相的細胞(圖1b)，說明面神經(jīng)培養(yǎng)液當中有促進ACC-M細胞生長的因子，也是臨床當中腺樣囊性癌嗜神經(jīng)性增殖的分子基礎(chǔ)。

a b c

而用紅參皂苷Rh2處理面神經(jīng)培養(yǎng)液下ACC-M細胞生長速度明顯減慢，細胞質(zhì)收縮明顯，細胞之間連接疏松，無棱角，胞漿模糊，分裂相減少(圖1c)，說明紅參皂苷Rh2有抑制ACC-M細胞增殖的作用。由圖2可知40～240μg/ml紅參皂苷Rh2處理下的ACC-M隨著濃度及時間的增加而減少，其抑制率呈現(xiàn)時間與劑量依賴性。

2.2 紅參皂苷Rh2對面神經(jīng)培養(yǎng)液下的ACC-M細胞增殖的影響

2.2.1 由表1可知：與對照組相比，實驗組2具有顯著性差異(P<0.01)。由表2可知：40～240μg/ml紅參皂苷Rh2處理下的ACC-M隨著濃度及時間的增加而減少，均有顯著性抑制作用，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其抑制率呈現(xiàn)時間與劑量依賴性。

表1 各組在不同時間不同培養(yǎng)液作用下ACC-M細胞的OD值

表2 不同濃度的紅參皂苷Rh2在不同時間作用于面神經(jīng)培養(yǎng)液下ACC-M細胞的OD值

2.2.2 MTT法檢測實驗中所形成的甲臜(Formazan)顆粒可以間接反映細胞的活性，甲臜顆粒越多說明細胞增殖活性愈強，反之則說明細胞增殖活性愈低[6]。與紅參Rh2作用的ACC-M細胞所形成的甲臜顆粒較稀疏(見圖3)，且隨時間變化稀疏程度更為明顯。

圖3 MTT檢測的甲臜顆粒

2.3 不同濃度紅參皂苷Rh2對NGFs濃度的影響 由圖4可知，在面神經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)下的ACC-M細胞表達的NGFs濃度很高，這種物質(zhì)也是促進腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲的主要物質(zhì)，將不同濃度的紅參皂苷Rh2作用于ACC-M細胞后，NGFs的濃度逐漸下降，其中，與對照組相比，用40～240μg/ml的紅參皂苷Rh2處理后的NGFs的濃度顯著下降(P<0.05)，尤其是240μg/ml的紅參皂苷Rh2抑制作用明顯(P<0.01)。

圖4 不同濃度紅參皂苷Rh2對NGFs濃度的影響

3 討論

紅參皂苷Rh2是由30個碳原子排列成四個環(huán)的甾烷類固醇核，是從紅參根莖浸出液中分離出的微量活性單體，對癌細胞的生長有抑制作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞異常分化，具有抑制癌細胞向其他器官轉(zhuǎn)移，增強機體免疫力，快速恢復體質(zhì)的作用。對癌細胞具有明顯的抗轉(zhuǎn)移作用，與化療藥物聯(lián)合使用可以起到增效減毒的作用。李帥坪等[7]發(fā)現(xiàn)紅參皂苷組分對大鼠血漿中神經(jīng)化學物質(zhì)有一定的影響；張琴芬等[8]發(fā)現(xiàn)紅參皂苷體外有抗卵巢癌的作用，證實紅參皂苷中的一些成分可以顯著降低卵巢癌細胞的增殖并誘導其凋亡。本文通過MTT法表明40～240μg/ml的紅參皂苷Rh2對ACC-M細胞嗜神經(jīng)生長具有明顯的抑制作用，在研究ACC-M細胞嗜神經(jīng)生長和用紅參皂苷Rh2處理時間及濃度的相關(guān)性實驗中，240μg/ml的紅參皂苷Rh2對ACC-M細胞嗜神經(jīng)生長的抑制率最高。表明紅參皂苷Rh2具有抑制ACC-M細胞嗜神經(jīng)生長的作用，暗示其可以作為抑制腫瘤細胞嗜神經(jīng)生長藥物的機制之一，是臨床上用于抑制腺樣囊性癌嗜神經(jīng)轉(zhuǎn)移藥物的機制之一。

NGFs是一類含量極微卻能夠促進和維持特異性神經(jīng)元的生長、存活和分化，影響突觸可塑性的可溶性多肽因子[9]。NGFs包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4)等，不同的NGFs對不同部位的神經(jīng)元發(fā)揮作用。NGF有兩種功能性受體：一種是高親和力的酪氨酸蛋白激酶受體TrkA，另一種是低親和力受體p75。近年來實驗證明[10]，NGFs及其受體在多種非神經(jīng)元性腫瘤細胞的神經(jīng)侵襲中起著明顯的作用。有研究表明[11]涎腺腺樣囊性癌中顯著高表達NGFs，陽性染色集中在癌細胞的胞漿和間質(zhì)中，而神經(jīng)束膜細胞上有大量TrkA存在，由此推測癌細胞分泌的NGFs與神經(jīng)束膜上的TrkA特異性可能是神經(jīng)侵襲過程中起“導航”作用的中間媒介。人們在另一種嗜神經(jīng)侵襲的腫瘤——胰腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子和TrkA的mRNA表達水平比正常組織增長了2.7倍和5.6倍。神經(jīng)侵襲的機制中包含著腫瘤細胞與神經(jīng)組織之間的相互吸引的作用,這種癌細胞與神經(jīng)組織的特殊親和力可能是通過NGFs的特異性“吸引”作用來實現(xiàn)的。而本文通過實驗得知：紅參皂苷Rh2可以降低促使ACC-M細胞增殖的NGFs的濃度。從而推測得出紅參皂苷Rh2抑制ACC-M細胞的增殖可能是通過抑制NGFs的活性而實現(xiàn)的。

綜上所述，紅參皂苷Rh2在體外可以抑制ACC-M細胞的嗜神經(jīng)增殖，可以為紅參皂苷Rh2用于抑制腺樣囊性癌嗜神經(jīng)性生長的臨床治療提供實驗依據(jù)，對開發(fā)新型抗腫瘤藥物，新型抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物有重要意義，但其中具體機制還需進一步探討與證明。