韋璐瑩 盧清華 甘昌鑫 謝冬梅 唐愛(ài)存

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院宣傳辦公室，南寧市 530023，電子郵箱:wly24312@163.com)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖活化是肝纖維化進(jìn)展的主要特征。HSC是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要合成細(xì)胞，正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，但在肝臟不斷受到慢性損傷的刺激后HSC被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚蚚1-2]。HSC活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌與自分泌作用使HSC增殖，并合成大量的ECM，同時(shí)ECM的降解減少，以致其在肝內(nèi)大量沉積，肝纖維化逐漸形成。因此，HSC的活化是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[3-4]。目前，越來(lái)越多的學(xué)者選擇HSC作為治療的靶標(biāo)研發(fā)抗肝纖維化藥物。

葫蘆茶苷是從壯藥葫蘆茶中提取分離得到的活性化合物。本課題組前期研究表明，葫蘆茶苷具有顯著的保肝和抗肝纖維化作用，其保肝作用機(jī)制可能與其抗氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用和下調(diào)Caspase-3和Caspase-8的活性有關(guān)[5-6]；其抗肝纖維化機(jī)制可能是通過(guò)清除自由基和抑制炎性反應(yīng)，抑制膠原合成與沉積，減輕HSC的活化[7-8]。但葫蘆茶苷抗肝纖維化的具體作用及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)信號(hào)通路參與肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以抑制NLRP3炎性小體活性，減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，從而抑制肝星狀細(xì)胞活化。本實(shí)驗(yàn)使用LX-2細(xì)胞建立體外HSC活化模型， 并基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路進(jìn)一步探討葫蘆茶苷抗肝纖維化的作用及其機(jī)制，以期為葫蘆茶的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 葫蘆茶苷樣品(純度>98.0%)由本課題組從葫蘆茶中分離而得，先采用水提正丁醇萃取，再分別采用硅膠柱色譜法、凝膠柱色譜、反相高效液相半制備色譜法得到葫蘆茶苷樣品。采用無(wú)血清高糖杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)配成濃度為500 μg/mL的母液，-4 ℃保存?zhèn)溆?。高糖DMEM由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)(批號(hào)：8118290)；胎牛血清由AusGeneX公司生產(chǎn)(批號(hào)：FBS00819-1)；胰蛋白酶由美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)(批號(hào)：0761)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)培養(yǎng)液、MTT由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)分別為GF346、M2003)；TRIzol試劑由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)(批號(hào)：15596026)，反轉(zhuǎn)錄試劑由德國(guó) Thermo公司生產(chǎn)(批號(hào)：K1622)；瓊脂糖由西班牙Biowest公司生產(chǎn)(批號(hào)：11860)；PBS由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：8120140)；SYBR熒光定量PCR試劑盒由日本TaKaRa公司生產(chǎn)(批號(hào)：C-19864)；RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Western電泳液、Western 轉(zhuǎn)膜液均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)分別為P0013B、P0015、P0015、P0021A)；Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,ColⅠ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen type Ⅲ,ColⅢ)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為20201210、20201210、20200705)，其他試劑均為分析純；α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1多克隆抗體由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)分別為00075696、00066288、00032518、00075847)；山羊抗兔IgG二抗由美國(guó)Abbkine公司生產(chǎn)(批號(hào)：ATSMR2201)；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液由上海愛(ài)必信生物科技有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：EL0419004)。

1.2 主要儀器 Model 311型CO2孵箱由美國(guó)Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)；ACB-4A1細(xì)胞超凈臺(tái)由新加坡藝思高科技有限公司生產(chǎn)；CKX-41型熒光倒置顯微鏡由日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)；Model 450型自動(dòng)酶標(biāo)儀、ABI 9700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、HD-4N型核酸蛋白測(cè)定儀、Micro 17R低溫高速離心機(jī)均由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；EM10-7-10型水平電泳儀由美國(guó) Major Science公司生產(chǎn)；LI-COR Odyssey CLx型雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)由美國(guó) LI-COR公司生產(chǎn)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)胞株來(lái)源和細(xì)胞培養(yǎng) LX-2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)傳代。采用高糖DMEM將凍存的LX-2細(xì)胞復(fù)蘇，并采用含青霉素(10萬(wàn)單位)、鏈霉素(10萬(wàn)單位)及10 %胎牛血清的高糖DMEM作為培養(yǎng)液，將LX-2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每?jī)商旄鼡Q一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿后，采用0.25 %胰酶消化并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)葫蘆茶苷對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞調(diào)整為5×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，分為空白對(duì)照組、模型組、不同濃度(10、20、40、80、160 μg/mL)葫蘆茶苷組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組6個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)至60%左右，棄去舊培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液，除空白對(duì)照組外，其余各組加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1刺激細(xì)胞增殖活化；刺激24 h后，葫蘆茶苷各劑量組給予相應(yīng)濃度的藥物(給藥體積為100 μL)干預(yù)，空白對(duì)照組和模型組加入等體積的含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去各孔中的培養(yǎng)基，加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT溶液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去上清液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜溶液，振搖10 min，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490 nm處檢測(cè)各組光密度A490值。細(xì)胞抑制率(%) = (給藥組A490值-空白組A490值)/(陰性對(duì)照組A490值-空白組A490值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液ColⅠ、ColⅢ和α-SMA的表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞調(diào)整濃度為5×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分為空白對(duì)照組、模型組、葫蘆茶苷低中高劑量組(20、40、80 μg/mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組6個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右，除空白對(duì)照組外，其余各組加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1刺激細(xì)胞增殖活化；刺激24 h后，葫蘆茶苷各劑量組給予相應(yīng)濃度的藥物(給藥體積為100 μL)干預(yù)，空白對(duì)照組和模型組加入等體積的含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞上清液，分別按照試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中ColⅠ、ColⅢ和α-SMA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)水平 按照1.5步驟中的方法進(jìn)行細(xì)胞分組和給藥干預(yù)，培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞上清液，收集各組細(xì)胞，嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并采用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定RNA純度和濃度，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。PCR的反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)中α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 GAPDH基因的引物設(shè)計(jì)、合成及驗(yàn)證均由大連TaKaRa寶生物工程有限公司完成。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，采用2-△△Ct法分析各基因在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。各基因引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

表1 基因引物序列表

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平 按照1.5步驟中的方法進(jìn)行細(xì)胞分組與給藥干預(yù)，連續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞上清液，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞獲得總蛋白，使用微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的濃度，以蛋白裂解液空白調(diào)零。采用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉液封閉膜1 h，以TBST緩沖液洗膜3次(5 min/次)后，再分別加入均為1 ∶1 000稀釋的α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1、GAPDH多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，然后加入1 ∶1 000稀釋的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h后，再用TBST 緩沖液清洗，最后以ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，采用ImageJ 2×軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葫蘆茶苷對(duì)LX-2 細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖明顯(P<0.05)；與模型組比較，葫蘆茶苷各劑量組LX-2 細(xì)胞的增殖均受到抑制(均P<0.05)，且隨著葫蘆茶苷藥物劑量的增加，抑制效果越明顯(均P<0.05)，見(jiàn)表2。10 μg/mL葫蘆茶苷抑制率偏低，而160 μg/mL葫蘆茶苷抑制率過(guò)高，故選取抑制率適宜的劑量20、40、80 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 7組LX-2細(xì)胞的增殖情況比較(x±s)

2.2 葫蘆茶苷對(duì)LX-2細(xì)胞上清液ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組中ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，葫蘆茶苷各劑量組細(xì)胞上清液中ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平降低(均P<0.05)。葫蘆茶苷低、中、高劑量組中的ColⅠ、α-SMA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)；而葫蘆茶苷中、高劑量組中ColⅢ表達(dá)水平均低于葫蘆茶苷低劑量組(均P<0.05)，但這兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 5組LX-2細(xì)胞上清液ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平的比較(x±s，ng/mL)

2.3 葫蘆茶苷對(duì)LX-2細(xì)胞α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組中α-SMA和ColⅠ的mRNA表達(dá)水平升高(均P<0.05)， 而Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與模型組比較，各劑量葫蘆茶苷組細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ 的mRNA表達(dá)水平降低，同時(shí)Nrf2、HO-1 的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05)。而葫蘆茶苷中、高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)水平均低于葫蘆茶苷低劑量組(均P<0.05)，但這兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；葫蘆茶苷低、中、高劑量組ColⅠ的mRNA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)；葫蘆茶苷高劑量組Nrf2、HO-1 的mRNA表達(dá)水平均高于其他低劑量組(均P<0.05)，而葫蘆茶苷低、中劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 5組細(xì)胞α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 葫蘆茶苷對(duì)LX-2細(xì)胞α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組中α-SMA和ColⅠ蛋白表達(dá)水平升高，而Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與模型組比較，葫蘆茶苷各劑量組α-SMA、ColⅠ蛋白表達(dá)水平降低，Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)。葫蘆茶苷中、高劑量組中α-SMA、ColⅠ的蛋白表達(dá)水平均低于葫蘆茶苷低劑量組(均P<0.05)，而中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；葫蘆茶苷低、中、高劑量組中Nrf2、HO-1 的蛋白表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 5組細(xì)胞α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

在肝臟受到病毒、炎癥等致病因素刺激后，HSC被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)增多，以及ColⅠ、ColⅢ等ECM成分過(guò)度沉積，從而引起肝細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白合成和降解失衡，肝內(nèi)膠原纖維大量增加，肝臟纖維結(jié)締組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[9]。而肝纖維化的持續(xù)存在，伴隨著正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的壞死和凋亡，以及ECM的不斷合成與沉積，這導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)的破壞與重建，肝實(shí)質(zhì)逐漸被ECM形成的瘢痕組織所取代，最終引起肝硬化，甚至肝癌[10]。TGF-β1是介導(dǎo)肝損傷及纖維化的最關(guān)鍵細(xì)胞因子，在細(xì)胞外、胞質(zhì)及胞核內(nèi)均有表達(dá)，研究證實(shí)TGF-β1對(duì)HSC的激活、轉(zhuǎn)化、分化及調(diào)節(jié)具有極其重要的作用，是最強(qiáng)的促HSC纖維化生成因子[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1刺激后模型組細(xì)胞增殖明顯，且細(xì)胞上清液ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平升高，細(xì)胞中的α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表達(dá)水平亦升高(P<0.05)，提示成功建立體外HSC活化模型；在給予葫蘆茶苷干預(yù)后，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞上清液中ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表達(dá)水平降低，同時(shí)細(xì)胞中的α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表達(dá)水平亦下調(diào)，提示葫蘆茶苷具有明顯的抗肝纖維化作用。此外，隨著葫蘆茶苷干預(yù)劑量的增加，細(xì)胞增殖的抑制效果越明顯，細(xì)胞上清液ColⅠ和α-SMA表達(dá)水平、細(xì)胞中ColⅠ蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，提示該藥物在抑制HSC增殖和抗纖維化作用方面具有一定的劑量依賴性。

Nrf2/HO-1氧化應(yīng)激信號(hào)途徑參與了肝臟的氧化應(yīng)激損傷，在氧化損傷保護(hù)中發(fā)揮著重要作用[12]。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)肝臟炎癥及纖維化過(guò)程中起著重要的作用，其作為HO-1激活的主要轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1結(jié)合，后者能夠促使Nrf2發(fā)生泛素化且被蛋白酶體降解，使得Nrf2的活性受到抑制；但是當(dāng)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2發(fā)生磷酸化并與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核上并與抗氧化反應(yīng)元件序列結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用[13]。本研究結(jié)果顯示，給予TGF-β1誘導(dǎo)刺激后，模型組中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降，提示Nrf2/HO-1信號(hào)通路與HSC活化存在關(guān)聯(lián)；在給予一定的葫蘆茶苷藥物干預(yù)后，細(xì)胞中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，提示葫蘆茶苷抑制HSC的增殖活化可能與調(diào)控Nrf2、HO-1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，葫蘆茶苷能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化與增殖，具有抗肝纖維化作用，且中/高劑量干預(yù)時(shí)效果更佳，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)途徑而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果或可為進(jìn)一步深入研究葫蘆茶苷抗肝纖維化作用機(jī)制及開發(fā)高效的抗肝纖維化新藥奠定基礎(chǔ)。