張玉杰 謝富玲 付慶帥 李榮勝 潘一峰，2

（1. 上海黃海制藥有限責(zé)任公司 上海 200942；2. 上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司 上海 200050）

扶正化瘀片是由五味子、桃仁、絞股藍(lán)、丹參、發(fā)酵蟲草菌粉和松花粉六味藥材組成的復(fù)方中成藥。具有活血祛瘀、益精養(yǎng)肝的功效，用于乙型肝炎肝纖維化屬瘀血阻絡(luò)、肝腎不足證者[1]。五味子作為使藥，含有豐富的木脂素成分，其中五味子醇甲、乙是主要的藥效成分[2-5]。目前《中國(guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)五味子僅以五味子醇甲作為含量控制成分[6]，而USP 41/NF36 在此基礎(chǔ)上增加了五味子醇乙等4 個(gè)成分的含量控制[7]。扶正化瘀片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以五味子甲素的TLC 的鑒別作為判斷依據(jù)，很難準(zhǔn)確地表征木脂素成分的含量。同時(shí)扶正化瘀片成分復(fù)雜，很多成分極性相近或?qū)偻之悩?gòu)體，其中戈米辛D、J 出峰位置與五味子醇甲、乙也十分接近，采用已報(bào)道的HPLC 方法[8]流動(dòng)相體系測(cè)定扶正化瘀片中五味子醇甲、乙的含量存在分離度和積分值重現(xiàn)性差，甚至目標(biāo)峰和其他成分完全重合為共流峰的現(xiàn)象，從而影響準(zhǔn)確定量。另外劉珊等[9]、邢心睿等[10]采用UPLCMS/MS 和UHPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)測(cè)定人體口服扶正化瘀片后在血漿中檢測(cè)到以原型化合物入血成分有五味子醇甲、乙等多種化合物，得到較明顯的血藥濃度與時(shí)間曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。因此建立適合扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量測(cè)定方法有助于扶正化瘀制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，為藥理、毒理研究提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1）儀器 Agilent 1260ⅠⅠ高效液相色譜儀、Agilent Zorbax Extend C18柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）［安捷倫科技（中國(guó)）有限公司］；XP-105 電子天平［梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司］；HWS-28 恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；SK7200 LHC 超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

2）試劑與藥物 五味子醇甲（批號(hào)110857-201815，純度99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；五味子醇乙（批號(hào)3249，純度98.0%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；扶正化瘀片0.8 g（批號(hào)S200404，上海黃海制藥有限責(zé)任公司）；甲醇為HPLC 級(jí)（上海星可高純?cè)噭┯邢薰荆?；純水自制?/p>

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax Extend C18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～55 min，55% A；55～57 min，55%～90% A；57～60 min，90% A；60～62 min，90%～55% A；62～65 min，55% A）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品五味子醇甲24.00 mg、五味子醇乙16.00 mg，分別置10 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為2.39、1.57 mg/mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 供試品溶液的制備

取本品10 片稱重，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

取供試品、混合對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液（除去五味子提取物）以及五味子提取物供試品溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.2.5 線性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取2 種對(duì)照品溶液適量，置于不同規(guī)格容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，配制成6 個(gè)不同濃度的混標(biāo)溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

在不同日期，采用不同儀器，由兩位實(shí)驗(yàn)員平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.2.7 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取本品0.75 g，置具塞錐形瓶中，精密加入上述對(duì)照品混標(biāo)儲(chǔ)備液5、10、15 mL，精密加入15、10、5 mL 70%甲醇，搖勻，稱重，超聲處理15 min，放冷，再稱重，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，平行制備3 份即得低、中、高濃度準(zhǔn)確度測(cè)定溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液和同一對(duì)照品溶液，于25 ℃下分別存放0、6、12、24、48 h，進(jìn)行色譜測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

樣品中五味子醇甲、乙色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離。空白溶液與陰性供試品溶液在對(duì)照品保留時(shí)間處無干擾峰，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間位置出峰，且待測(cè)成分與鄰近干擾峰分離度大于1.5，表明該方法專屬性良好（圖1）。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，五味子醇甲：y=39 974.00x－58.30，r=0.999 9，線性范圍0.024 0～1.203 4 mg/mL；五味子醇乙：y=33 093.60x－126.43，r=0.999 9，線性范圍0.015 7～0.784 5 mg/mL，兩成分在各自濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度（重復(fù)性、中間精密度）

實(shí)驗(yàn)員1 測(cè)定平行6 份樣品中五味子醇甲、乙的平均含量分別為0.206%（RSD 0.59%）、0.052%（RSD 1.94%）；實(shí)驗(yàn)員2 測(cè)定平行6 份樣品中五味子醇甲、乙的平均含量分別為0.205%（RSD 0.43%）、0.053%（RSD 0.95%）；表明精密度良好。

2.4 準(zhǔn)確度

低、中、高水平樣品中五味子醇甲的平均加樣回收率為105.63%（RSD 0.90%，n=9）；五味子醇乙平均加樣回收率為103.24%（RSD 3.81%，n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

表1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品及對(duì)照品溶液中五味子醇甲、乙的峰面積RSD 分別為0.49%、1.84%；0.68%、0.95%。表明對(duì)照品與供試品溶液中待測(cè)成分在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 含量測(cè)定

根據(jù)建立的方法對(duì)10 批次不同批號(hào)的扶正化瘀片進(jìn)行五味子醇甲、乙含量測(cè)定，被測(cè)組分色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離，峰形尖銳對(duì)稱、重現(xiàn)性良好，五味子醇甲、乙含量范圍分別在0.093%～0.181%、0.025%～0.056%（表2）。

表2 扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量

3 討論

在色譜條件優(yōu)化研究中，參考陳立柱等[8]、劉晶等[11]、支旭然等[12]、王艷等[13]已發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)乙腈-水、甲醇-水流動(dòng)相體系調(diào)整比例后均進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)不同流動(dòng)相體系下，均能達(dá)到目標(biāo)化合物的有效分離，但是甲醇-水體系下五味子醇甲、乙的出峰時(shí)間更短，出于縮短分析時(shí)間、節(jié)約成本的角度，選擇甲醇-水作為色譜測(cè)定的流動(dòng)相體系。

對(duì)五味子醇甲、乙對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)（200 ～400 nm）掃描，五味子醇甲、乙分別于210、250 nm 處有最大吸收，250 nm 波長(zhǎng)下基線平穩(wěn)、目標(biāo)峰周圍干擾峰少且響應(yīng)低，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020 年版及相關(guān)文獻(xiàn)，最終選擇250 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

考察了流動(dòng)相中添加劑（0.1%甲酸、0.1%磷酸、2 mmol/L 乙酸銨）對(duì)五味子醇甲、乙的色譜峰面積、理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子的影響。研究表明，以磷酸為添加劑（濃度0.1%）時(shí)，五味子醇乙峰與雜質(zhì)峰（戈米辛J）分離度不佳，其余添加劑對(duì)分析結(jié)果無顯著性影響，結(jié)合目標(biāo)化合物本身性質(zhì)，選擇不添加任何添加劑，以水-甲醇體系作為流動(dòng)相按一定的比例梯度洗脫。

考察了不同柱溫（20、25、30、35 ℃）對(duì)五味子醇甲、乙的色譜峰面積及相關(guān)參數(shù)的影響。結(jié)果表明，各柱溫對(duì)分析結(jié)果無明顯影響，為便于控制柱溫，選擇柱溫為30 ℃。

在準(zhǔn)確度考察研究中，高濃度下五味子醇乙測(cè)得的回收率略高，其原因是由于五味子醇乙含量較低。參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部＜ 9101＞分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，其回收率為85%～110%，仍符合相關(guān)要求。

綜上所述，本研究建立了HPLC 方法測(cè)定扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量，有助于扶正化瘀片及相關(guān)劑型的質(zhì)量控制，可為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升、藥理及毒理研究提供參考依據(jù)。該分析方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、耐用性良好、操作簡(jiǎn)便且符合方法驗(yàn)證相關(guān)要求。