馮玲玲，杜鑫，葛瑜，楊凡，黃榮，張麗萍

（1.長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院兒科，仙桃 433000；2.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，武漢 430000）

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是肺部重度炎癥，可導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷、低氧血癥、肺水腫和呼吸衰竭[1]。世界范圍內(nèi)兒童ALI 的發(fā)生率很高，常見(jiàn)病因是由于呼吸道感染革蘭氏陰性桿菌，病死率大于35%[2]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要生物活性成分，已被廣泛用于通過(guò)觸發(fā)過(guò)多的炎癥介質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)與人的ALI 病理特征相似的ALI 模型[3]。由于目前ALI 的病理機(jī)制尚未完全闡明，臨床上以對(duì)癥治療為主，治療效果較差，導(dǎo)致ALI 患者的病死率較高。因此，尋找有效的方法和探索分子機(jī)制是十分必要的。

葶藶子為十字花科芝麻菜屬植物芝麻菜或播娘蒿的種子，具有止咳平喘、強(qiáng)心利尿、抗腫瘤等作用[4]。已有研究表明葶藶子水提液通過(guò)改善水通道蛋白5 的含量或活性，對(duì)LPS 致ALI 大鼠的肺淤血、肺水腫及動(dòng)脈血?dú)獾母淖兙哂姓{(diào)節(jié)作用[5]。但葶藶子對(duì)LPS 誘導(dǎo)ALI 的具體作用機(jī)制仍不清楚，本文探究葶藶子水提液對(duì)LPS 吸入性肺炎新生大鼠病理?yè)p傷、氧化應(yīng)激、炎性因子及高遷移率族蛋白1（HMGB1）/Toll 樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只雄性3 d 齡新生SPF 級(jí)SD大鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量（7±2）g，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2016—0009。于SPF 級(jí)別動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，每周更換滅菌墊料，按時(shí)添加裸鼠飼料及飲水。本實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程經(jīng)仙桃市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和主要試劑 葶藶子（批號(hào)：3010523）購(gòu)自上元堂大藥房；地塞米松（批號(hào)：SD9530）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號(hào)：D006-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A001-3-2）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A003-1）、谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A005-1-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）測(cè)定測(cè)試盒（批號(hào)：H007）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：H002）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：H052）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012S）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（批號(hào)：A0208）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗單克隆抗體HMGB1（批號(hào)：ab18256）、TLR4（批號(hào)：ab13556）、NF-κB p65（批號(hào)：ab16502）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 葶藶子水提液的制備 取葶藶子200 g，8 倍量水煎煮3 次，將其制備為含生藥2 g/mL 的水提液，即合并3 次濾液濃縮至100 mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成所需濃度[6]。

1.4 動(dòng)物模型建立及分組 將大鼠隨機(jī)分為6 組：對(duì)照組、模型組、葶藶子水提液低、中、高劑量組和地塞米松組，每組10 只大鼠。葶藶子水提液低、中、高劑量組分別灌胃葶藶子水提液5、10、20 g/kg[7]，地塞米松組灌胃地塞米松0.002 g/kg[8]，對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每日1 次，連續(xù)7 d。于第7 日灌胃后，除對(duì)照組外的其余大鼠用左手大拇指和食指固定新生大鼠頭部，均于鼻內(nèi)單次滴注LPS 5 mg/kg復(fù)制吸入性肺損傷模型[9]。

1.5 干濕法 采用干濕法檢測(cè)肺干濕質(zhì)量比值，處死各組大鼠后，取肺組織稱取質(zhì)量，記為濕質(zhì)量，置于烤箱中烘烤至質(zhì)量不變，記為干質(zhì)量。肺干濕質(zhì)量比值=干質(zhì)量/濕質(zhì)量×100%。

1.6 HE 染色 取各組大鼠肺組織用10%甲醛固定48 h，石蠟包埋制作成切片，厚度5 mm。然后用HE染液進(jìn)行染色，在200 倍熒光顯微鏡下觀察肺組織損傷情況。

1.7 氧化應(yīng)激 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定SOD 含量，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定MDA、GSH含量。SOD 在450 nm 處測(cè)A 值，MDA 在532 nm 處測(cè)A 值，GSH 在412 nm 處測(cè)A 值。

1.8 ELISA 將各組大鼠肺組織置于含蛋白酶抑制劑的裂解液的玻璃勻漿器中勻漿，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），收集上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.9 Western Blot 取各組大鼠肺組織，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取等質(zhì)量蛋白質(zhì)樣品，100 ℃變性5 min 后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），在4 ℃條件下加入HMGB1、TLR4 和NFκB p65 一抗并孵育過(guò)夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值，以目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葶藶子水提液降低吸入性肺損傷新生大鼠模型肺干濕質(zhì)量比值 通過(guò)干濕法檢測(cè)各組新生大鼠肺干濕質(zhì)量比值，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組肺干濕質(zhì)量比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，葶藶子水提液中、高劑量組和地塞米松組肺干濕質(zhì)量比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地塞米松組比較，葶藶子水提液各劑量組肺干濕質(zhì)量比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 葶藶子水提液降低吸入性肺損傷大鼠模型肺干濕質(zhì)量比值（±s）

表1 葶藶子水提液降低吸入性肺損傷大鼠模型肺干濕質(zhì)量比值（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

肺干濕質(zhì)量比值（濕質(zhì)量/干質(zhì)量）對(duì)照組10-4.36±0.18模型組10-6.63±0.31*地塞米松組100.0024.71±0.28#葶藶子水提液低劑量組105.0006.34±0.23△葶藶子水提液中劑量組1010.0005.96±0.16#△葶藶子水提液高劑量組1020.0005.23±0.11#△組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）

2.2 葶藶子水提液改善吸入性肺損傷新生大鼠模型肺組織病理?yè)p傷 通過(guò)HE 染色檢測(cè)各組新生大鼠肺組織病理?yè)p傷，提示對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，無(wú)明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肺泡組織結(jié)構(gòu)紊亂、水腫、間質(zhì)增厚、出血和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，葶藶子水提液中、高劑量組和地塞米松組病理?yè)p傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型肺組織病理?yè)p傷的影響（×200）

2.3 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型SOD、MDA 和GSH 含量的影響 通過(guò)ELISA 法檢測(cè)各組新生大鼠SOD、MDA 和GSH 含量，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組大鼠SOD、GSH 含量降低，MDA 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，葶藶子水提液中、高劑量組和地塞米松組SOD、GSH 含量升高，MDA 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地塞米松組比較，葶藶子水提液各劑量組SOD、GSH 含量降低，MDA 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型SOD、MDA 和GSH 含量的影響（±s）

表2 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型SOD、MDA 和GSH 含量的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）SOD（U/mg pro）MDA（nmol/mg pro）GSH（U/mg pro）對(duì)照組10-138.45± 5.2610.74± 2.420.590±0.042模型組10-29.56± 4.24*88.23±10.36*0.043±0.026*地塞米松組100.002127.48± 6.55#21.41± 2.17#0.510±0.043#葶藶子水提液低劑量組105.00046.27± 8.56△80.47± 6.29△0.152±0.033△葶藶子水提液中劑量組1010.00067.79± 6.11#△66.76± 5.57#△0.291±0.039#△葶藶子水提液高劑量組1020.000105.28±15.00#△39.55± 3.35#△0.447±0.048#△

2.4 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的影響 通過(guò)ELISA 法檢測(cè)各組新生大鼠IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組IL-6、IL-1β 和TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，葶藶子水提液中、高劑量組和地塞米松組IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地塞米松組比較，葶藶子水提液各劑量組IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的影響（±s） pg/mL

表3 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的影響（±s） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）IL-6IL-1βTNF-α對(duì)照組10-47.58±10.3519.74± 2.0199.66±20.01模型組10-279.69±25.31*59.556±10.11*706.67±55.05*地塞米松組100.00289.26±10.31#38.37± 4.04#227.36±15.18#葶藶子水提液低劑量組105.000255.36±16.34△53.23± 5.88△657.56±42.87△葶藶子水提液中劑量組1010.000223.35±12.88#△41.26± 8.45#△536.67±29.34#△葶藶子水提液高劑量組1020.000147.56±15.15#△33.98± 2.34#△308.31±23.02#△

2.5 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平的影響 通過(guò)Western Blot 法檢測(cè)新生大鼠肺組織中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組HMGB1、TLR4 蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65 與NF-κB p65 比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，葶藶子水提液中、高劑量組和地塞米松組HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65 與NF-κB p65 比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地塞米松組比較，葶藶子水提液各劑量組HMGB1、TLR4 蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65 與NF-κB p65 比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

表4 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平的影響（±s）

表4 葶藶子水提液對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）HMGB1/ActinTLR4/Actinp-NF-κB p65/NF-κB p65對(duì)照組10-0.11±0.010.08±0.020.15±0.03模型組10-1.24±0.13*1.01±0.11*1.89±0.21*地塞米松組100.0020.25±0.04#0.14±0.03#0.48±0.05#葶藶子水提液低劑量組105.0001.05±0.10△0.91±0.05△1.58±0.19△葶藶子水提液中劑量組1010.0000.81±0.09#△0.55±0.06#△1.05±0.14#△葶藶子水提液高劑量組1020.0000.48±0.05#△0.27±0.04#△0.88±0.09#△

圖2 HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平

3 討論

由于肺泡發(fā)育不成熟，自生免疫功能低下，新生兒發(fā)生ALI 的概率極高[10]。臨床治療方式主要為抗感染、氧療和機(jī)械輔助通氣，但效果不佳。本研究通過(guò)鼻內(nèi)滴注LPS 5 mg/kg 的方法建立了吸入性肺損傷大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)葶藶子水提液具有降低模型大鼠肺干濕質(zhì)量比值及改善肺組織病理?yè)p傷程度的作用。

由于呼吸道和肺組織承擔(dān)著機(jī)體所需氧氣的供給及交換，肺組織容易受到氧自由基的攻擊，相關(guān)研究表明，過(guò)度的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致ALI 的重要原因[11]。GSH、SOD 是體內(nèi)最重要的抗氧化物酶，可清除細(xì)胞中ROS，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用[12]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，并在一定程度上反映了氧化應(yīng)激水平[13]。陳小蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn)葶藶子提取液可降低心肌缺血/再灌注損傷大鼠MDA 含量，提高SOD 活力從而減輕心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)葶藶子水提液能夠升高吸入性肺損傷大鼠模型SOD、GSH 含量，降低MDA 含量，提示葶藶子水提液具有改善吸入性肺損傷新生大鼠模型氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用。

肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是LPS 誘發(fā)ALI 的主要病理生理變化之一[15]。IL-6 是評(píng)估和檢測(cè)ALI 的常用指標(biāo)，其水平高低與ALI 呈正相關(guān)。IL-1β 和TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有致炎作用的細(xì)胞因子[16]，IL-1β 通過(guò)激活相關(guān)炎癥通路進(jìn)一步刺激炎癥介質(zhì)的釋放，TNF-α 可通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞黏附因子，使炎癥細(xì)胞在炎癥部位得到表達(dá)[17]。張桐茂等[18]研究發(fā)現(xiàn)葶藶子提取物可減輕慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，葶藶子水提液具有降低吸入性肺損傷大鼠模型IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的作用，提示葶藶子水提液通過(guò)抑制炎癥因子的釋放對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠模型具有保護(hù)作用。

LPS 誘發(fā)的ALI 與HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，HMGB1 是真核細(xì)胞廣泛表達(dá)的一種高度保守的細(xì)胞核非組蛋白，當(dāng)細(xì)胞壞死或被激活時(shí)可釋放大量HMGB1，可促進(jìn)炎癥因子的釋放[19]。TLR4 作為HMGB1 的重要配體，參與晚期炎性信號(hào)的傳導(dǎo)，使NF-κB p65 磷酸化，誘導(dǎo)IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子的釋放[20]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，磷酸化激活后可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合并啟動(dòng)促炎基因表達(dá)，導(dǎo)致炎癥損傷[21]。因此，抑制NF-κB 信號(hào)活化是治療炎癥性疾病的重要方式[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，葶藶子水提液具有降低吸入性肺損傷大鼠模型HMGB1、TLR4 蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65 與NF-κB p65 比值的作用，提示葶藶子水提液通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NFκB 信號(hào)通路活化，減輕肺組織病理?yè)p傷、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，對(duì)LPS 誘發(fā)ALI 的新生大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，葶藶子水提液可改善吸入性肺損傷大鼠模型肺組織病理?yè)p傷，抑制氧化應(yīng)激、炎癥因子的釋放，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路活化實(shí)現(xiàn)的。本研究為葶藶子臨床治療新生兒吸入性肺損傷提供了一定理論依據(jù)。