高雯 邵株燕 鄭增光 孫文勇 席蕓 季恩明 張慧萍 孫海燕

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率居高不下，尤其在發(fā)展中國家更為嚴(yán)重[1]，嚴(yán)重威脅女性健康。宮頸局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降是宮頸癌發(fā)生的重要原因[2]。免疫監(jiān)視是免疫系統(tǒng)最基本的功能之一，它可以識別、破壞、殺死或抑制突變細(xì)胞，防止腫瘤發(fā)生。因此，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中，免疫微環(huán)境起至關(guān)重要的作用。程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）是一種表達(dá)于多種組織細(xì)胞表面的蛋白，它可以與T細(xì)胞上的程序性死亡受體-1（programmed death protein-1，PD-1）結(jié)合，傳導(dǎo)免疫抑制信號，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷。因此阻斷PD-1/PD-L1通路在理論上可以恢復(fù)腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞的免疫殺傷作用，從而抑制腫瘤生長[3]。且研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá)，過表達(dá)的PD-L1通過與PD-1結(jié)合抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[4-5]?；诖?，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，從蛋白水平檢測PD-L1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為宮頸癌的免疫治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 組織樣本 選取2019年8月至2020年3月浙江省腫瘤醫(yī)院收治的病理學(xué)診斷明確為宮頸癌的患者172例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18歲的宮頸癌手術(shù)患者；石蠟包埋的蠟塊存在足夠剩余組織進(jìn)行PD-L1檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他惡性腫瘤病史；有嚴(yán)重或控制不穩(wěn)定的軀體疾病者；妊娠或哺乳期婦女。通過醫(yī)院信息管理系統(tǒng)，獲取患者臨床病理特征資料，包括年齡、身高、體重、BMI、生育史、家族史、術(shù)前實驗室檢查指標(biāo)、影像學(xué)檢查指標(biāo)等以及病理報告中關(guān)于腫瘤分期、有無淋巴轉(zhuǎn)移和血管侵犯等資料，收集患者術(shù)后隨訪資料。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批件號：IRB-[2020]9號。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 PD-L1抗體試劑（克隆號：WD160）和DAB染色液試劑盒均為蘇州藥明澤康生物科技有限公司產(chǎn)品。免疫組織化學(xué)試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)液購自上海威奧生物科技有限公司。凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；數(shù)碼相機(jī)購自日本Canon公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2.2 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)情況檢測 采用免疫組織化學(xué)法。將石蠟包埋的宮頸癌組織蠟塊連續(xù)切片，厚2 μm，放置于載玻片上。脫蠟、水化后采用檸檬酸鈉緩沖溶液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，血清封閉抗體，PD-L1一抗（稀釋濃度為1∶50）4℃孵育過夜，PBS清洗后，二抗（稀釋濃度為1∶50）室溫孵育1 h，再次PBS清洗后，采用DAB染色液染色并封片。已知PD-L1表達(dá)陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。由2位病理科醫(yī)師雙盲閱片，評估染色需在低倍、高倍鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取3個視野，采用目鏡20倍、物鏡10倍放大視野，每個視野記數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。宮頸癌組織PD-L1表達(dá)情況采用聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（combined positive score,CPS）評估，計算公式：CPS=（PD-L1陽性細(xì)胞/可計數(shù)腫瘤細(xì)胞）×100。CPS≥1為PD-L1表達(dá)陽性，＜1為PD-L1表達(dá)陰性。PD-L1陽性細(xì)胞為：任何染色強(qiáng)度下具有完全或部分細(xì)胞膜染色而非僅有細(xì)胞質(zhì)染色的腫瘤細(xì)胞；任何染色強(qiáng)度下，位于腫瘤巢內(nèi)或相鄰的滋養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)為細(xì)胞膜染色和（或）細(xì)胞質(zhì)染色的直接與腫瘤反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。影響因素分析采用多因素logistic回歸分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)情況 172例宮頸癌患者中PD-L1表達(dá)陽性166例，陽性表達(dá)率為96.51%。PD-L1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性、陰性病理切片分別見圖1、2（插頁）。

圖1 宮頸癌組織程序性死亡配體-1（PDL1）表達(dá)陽性（免疫組織化學(xué)染色，×200）

圖2 宮頸癌組織程序性死亡配體-1（PDL1）表達(dá)陰性（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系分析 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性與高危型HPV感染、CA19-9水平、病理類型、分化程度均有關(guān)（均P＜0.05），與患者年齡、懷孕次數(shù)、分娩次數(shù)、BMI、家族史、Hb水平、血清鱗狀細(xì)胞癌抗原、癌胚抗原、CA125、初始治療方式、腫瘤生長類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、器官轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、合并其他癌癥等均無關(guān)（均P＞0.05）。宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性患者與陰性患者臨床病理特征比較見表1。

表1 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性患者與陰性患者臨床病理特征比較

2.3 患者宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性的影響因素分析 多因素logistic回歸分析顯示，病理類型是患者宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 患者宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性的影響因素logistic回歸分析

2.4 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系分析 患者術(shù)后隨訪4～46個月，中位隨訪時間28個月。隨訪期內(nèi)共有24例患者復(fù)發(fā)，PD-L1表達(dá)陽性、陰性患者中分別有21例（12.7%）、3例（50%）；共有13例患者死亡，PD-L1表達(dá)陽性、陰性患者中分別有11例（6.6%）、2例（33.3%）。宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性、陰性患者2年無進(jìn)展生存率分別為88.6%、50.0%，2年總生存率分別為96.4%、66.7%，宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性患者2年無進(jìn)展生存率、2年總生存率均高于PD-L1表達(dá)陰性患者（均P＜0.05），見圖3、4。

圖3 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患者無進(jìn)展生存曲線比較

圖4 宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患者總生存曲線比較

3 討論

宮頸局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降及免疫逃逸現(xiàn)象的產(chǎn)生在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，PD-L1在宮頸癌中高表達(dá)，且參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤的免疫逃逸中起到了重要作用[6-10]。PD-L1與其受體PD-1結(jié)合后，導(dǎo)致腫瘤抗原特異性T細(xì)胞凋亡或免疫無能，從而抑制免疫反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞逃逸。因此，PD-L1的表達(dá)情況對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸上調(diào)，同時，PD-L1蛋白表達(dá)在不同F(xiàn)IGO分期，不同腫瘤大小，不同分化程度中表達(dá)不同[11]。本研究結(jié)果表明PD-L1在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率為96.51%，但未發(fā)現(xiàn)其與腫瘤分期的相關(guān)性，原因可能與本研究樣本量較小有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，PDL1的表達(dá)情況與高危型HPV感染狀態(tài)、CA19-9水平、病理類型和分化程度有關(guān)。

本研究宮頸癌組織PD-L1表達(dá)陽性患者與表達(dá)陰性患者相比，高危型HPV感染的比例較高、CA19-9升高的比例較低，鱗癌比例較高，且中低分化比例較高。既往研究顯示，PD-L1的表達(dá)受HPV調(diào)控，HPV E5/56/E7可激活PI3K/Akt、MAPK、STAT/NF-κB通路調(diào)控PD-L1/PD-1軸促進(jìn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展[12]。然而，近期有研究通過免疫組織化學(xué)法檢測了HPV相關(guān)和HPV不相關(guān)的宮頸腺癌患者中PD-L1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異[13]。該團(tuán)隊還進(jìn)一步研究HPV相關(guān)宮頸腺癌時發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)在攜帶不同亞型的HPV患者中同樣無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果提示，PD-L1表達(dá)陽性患者2年無進(jìn)展生存率和2年總生存率均高于表達(dá)陰性患者。這可能是因為PD-L1表達(dá)陽性患者基本都是鱗癌，而PD-L1表達(dá)陰性患者基本都是腺癌或其他類型，而在宮頸癌中鱗癌預(yù)后較好。

PD-L1作為PD-1/PD-L1免疫抑制劑的作用靶點，對從腫瘤患者中篩選獲益群體具有積極意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在宮頸癌的各臨床病理特征中有不同的表達(dá)，宮頸鱗癌表達(dá)最高，而PD-L1表達(dá)越高，患者從PD-1/PD-L1免疫抑制劑治療中獲益可能性越高。然而，目前對于PD-L1表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征，以及與患者使用PD-1/PD-L1免疫抑制劑的藥效相關(guān)性的研究不多，臨床病理特征中PD-L1表達(dá)水平高的群體是否普遍受益有待進(jìn)一步研究。