薛 艷，邱鳳喜，鄭曉棟，陳 斌，王 楠，王 雅，張 楠，仲榮洲，褚立?！?/p>

1.上海市養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院/上海市陽光康復(fù)中心臨床研究中心，上海 201600;2.上海市普陀區(qū)真如鎮(zhèn)街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200333

骨骼肌是人體功能活動的基礎(chǔ)，能夠進(jìn)行運動和呼吸[1]。隨著年齡的增長，血液供應(yīng)減少，或肌肉固定，長時間失重，營養(yǎng)不良等會導(dǎo)致橫紋肌營養(yǎng)障礙，肌肉纖維變細(xì)甚至消失等，使得肌肉體積縮小并且力量減退，最終引發(fā)肌肉萎縮[2-3]。肌肉萎縮如果未進(jìn)行及時治療，很可能引發(fā)其他并發(fā)癥，因此肌肉萎縮不僅危害健康，還會降低日常生活質(zhì)量[4]。但目前尚未有統(tǒng)一的治療方案，很多藥物的療效也不太理想，因此研究者應(yīng)當(dāng)要重視其預(yù)防和治療。在本研究中，通過對比GEO數(shù)據(jù)庫中臥床前和臥床后受試者肌肉組織中的差異表達(dá)基因(DEGs)，可以進(jìn)一步明確肌肉萎縮的相關(guān)靶點及信號通路，由此可以為治療肌肉萎縮提供新的思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個儲存高通量測序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。在本次研究中，以("Muscular Atrophy"[Mesh])作為關(guān)鍵詞進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)檢索，芯片類型為“Expression profiling by array”，種屬為“Homosapiens”，檢索時間截止于2020年9月。檢索獲得GSE148152數(shù)據(jù)集，其注釋平臺為GPL17586。

1.2數(shù)據(jù)分析方法 下載基因芯片數(shù)據(jù)GSE148152和GPL 17586-45144的芯片基因注釋文件，運用KNN算法補(bǔ)全缺失值，構(gòu)建基因表達(dá)矩陣，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，運用R軟件中的limma包篩選符合|logFoldChange|>1且P<0.05的差異基因。篩選出差異基因后使用R軟件中的ggplot2和pheatma程序包對DEGs進(jìn)行可視化分析，繪制火山圖和熱圖。

1.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING(https://string.db.org/)，一個已知的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫來進(jìn)一步篩選核心靶點，并且繪制PPI的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4基因本體論(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 使用R軟件中的clusterProfiler GO和clusterProfiler KEGG軟件包對DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析主要分析差異基因的功能。KEGG富集可以獲得差異基因的潛在生物學(xué)功能和所涉及的生物途徑。

2 結(jié) 果

2.1原始數(shù)據(jù)的基本信息 選取GSE148152數(shù)據(jù)集中11名健康男性，進(jìn)行84 d頭朝下傾斜臥床休息(BR)，即受試者始終保持6°頭低位(即休息、淋浴、運輸、運動訓(xùn)練、如廁等)，但在用餐時可以用肘部休息，這樣可以造成肌肉萎縮。所有受試者在臥床前(PRE)和臥床后(POST)，即發(fā)生肌肉萎縮的前后均取股外側(cè)肌的肌肉進(jìn)行活檢，其中PRE組的樣本編號分別為GSM 4455104、GSM 4455106、GSM 4455108、GSM 4455110、GSM 4455112、GSM 4455114、GSM 4455116、GSM 4455117、GSM 4455119、GSM 4455120和GSM 4455121；POST組的樣本編號分別為GSM 4455105、GSM 4455107、GSM 4455109、GSM 4455111、GSM 4455113、GSM 4455115、GSM 4455127、GSM 4455128、GSM 4455129、GSM 4455130和GSM 4455131。

2.2DEGs的篩選結(jié)果 運用R語言分析受試者臥床前后股外側(cè)肌的肌肉組織中的基因表達(dá)，結(jié)果共獲得100個DEGs，其中臥床后上調(diào)基因為51個，同時下調(diào)基因為49個。見圖1。

注：圖中三角形表示上調(diào)基因，方形表示下調(diào)基因，圓形表示未有明顯改變的基因。

2.3DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在String 數(shù)據(jù)庫中，通過構(gòu)建100個DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，然后運用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞣治?，以“自由度”、“接近中心性”?“介數(shù)”3個主要參數(shù)為基礎(chǔ)，通過篩選各項參數(shù)的數(shù)值均>0的31個DEGs作為關(guān)鍵靶點，其中發(fā)生肌肉萎縮后肌肉組織中表達(dá)顯著上調(diào)的基因為MYOZ2、MYH7B、TECRL、CASQ2、CKMT2、TNNT1、LDHB、MYL6B、GYS1、MYL3、SMPX、FABP3、MDH1、TNNI1、UQCR10、NDUFAB1、GOT2、ACSL1、FBP2、ATP5G1、HK2和COX5A，同時表達(dá)顯著下調(diào)的基因為SESN1、ABCA1、FOXO3、MSTN、ADH1B、ACTN3、MYH1、PDK4和MYH8。

2.4DEGs的GO功能富集分析 GO數(shù)據(jù)庫總共有三大類，分別是生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞定位(CC)和分子功能(MF)，各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，所處的細(xì)胞環(huán)境，以及參與的生物學(xué)過程。通過R分析，將兩組中的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析，總共獲得43個具有顯著意義的GO條目：在BP中，有21條顯著富集條目(48.8%)，主要涉及細(xì)胞過程、代謝過程和多細(xì)胞生物的過程等；在CC中，有12條顯著富集條目(27.9%)，主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器等；在MF中，有10條顯著富集條目(23.3%)，主要涉及結(jié)合、催化活性和結(jié)構(gòu)分子活動等。

2.5DEGs的KEGG通路富集分析 首先通過對31個核心DEGs進(jìn)行 KEGG 通路的聚類分析，發(fā)現(xiàn)肌肉萎縮前后的核心DEGs所屬的信號通路主要集中于以下三大類：代謝、生物體系統(tǒng)和人類疾病，并且參與調(diào)控了能量代謝(包含3個基因)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(包含6個基因)、循環(huán)系統(tǒng)(包含4個基因)、環(huán)境適應(yīng)(包含4個基因)、代謝疾病(4個基因)等相關(guān)生理病理機(jī)制，進(jìn)一步通過富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs具體涉及的通路主要是碳代謝、果糖和甘露糖代謝等代謝途徑及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等信號通路(圖2)。

注：圓點的大小表示該條通路下DEGs的個數(shù)，圓點越大表示基因數(shù)越多，位置越靠上表示富集越明顯。

3 討 論

肌肉萎縮主要與年齡增長、運動損傷、疾病因素、營養(yǎng)不良及神經(jīng)源性等原因相關(guān)[5-7]。其中老年性肌肉萎縮不容忽視，根據(jù)一項美國的橫斷面調(diào)查顯示，60歲以上老年人肌肉萎縮的男女總發(fā)病率分別為75.5%和35.4%[8]。而隨著我國人口老齡化日趨加重，肌肉萎縮的發(fā)病率也逐年攀高[9]。肌肉萎縮給家庭和個人帶來的不良影響是巨大的，所以隨著社會對健康要求的不斷提高，已然是一個備受關(guān)注的問題[10]。因此為了進(jìn)一步明確肌肉萎縮的病理機(jī)制，研究者借助GEO數(shù)據(jù)庫中的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘分析，共獲得了31個核心DEGs，其中共同表達(dá)下調(diào)的DEGs有22個，共同表達(dá)上調(diào)的DEGs有9個，包括慢速骨骼肌型肌鈣蛋白(TNNI1)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3(FOXO3)、肌肉生長抑制素(MSTN)等關(guān)鍵基因。

TNN1是肌鈣蛋白I(TnI)的同源基因編碼的亞型之一，TnI是橫紋肌細(xì)絲中的肌鈣蛋白復(fù)合物的抑制亞單位，在鈣調(diào)節(jié)收縮和舒張中發(fā)揮核心作用[11-12]。其中TNNI1可以通過抑制鈣介導(dǎo)的肌動蛋白和肌球蛋白復(fù)合物的構(gòu)象變化來抑制肌肉收縮，其表達(dá)的高低能反映骨骼肌內(nèi)慢肌纖維的水平[13]。

FOXO3屬于叉頭基因轉(zhuǎn)錄因子家族(FOXO)的亞型，其與細(xì)胞凋亡和肌肉再生有關(guān)[14-15]。有研究報道，F(xiàn)OXO3可以通過同時調(diào)控泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)(萎縮基因)來觸發(fā)骨骼肌肉萎縮[16]。AMPK是調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體功能和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，可通過影響骨骼肌的線粒體質(zhì)量控制調(diào)節(jié)線粒體功能[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/FOXO3信號通路在骨骼肌肉萎縮中會被激活，而在阻斷AMPK/FOXO3信號通路后，則可以有效逆轉(zhuǎn)小鼠的肌肉萎縮[18]，說明 FOXO3和AMPK二者在肌肉萎縮中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

MSTN是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，可以抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化[19]。通過抑制MSTN基因的表達(dá)，能夠抑制肌肉萎縮，增強(qiáng)肌力[20]。MSTN進(jìn)入細(xì)胞核的主要途徑是Smad激活途徑和Akt抑制途徑，有研究顯示MSTN通過介導(dǎo)Akt/mTOR信號通路可引發(fā)肌肉萎縮[21-22]。另外還有一些研究發(fā)現(xiàn)PPAR參與全身炎癥反應(yīng)并且調(diào)節(jié)骨骼肌氧化代謝，而MSTN則可能通過調(diào)節(jié)PPAR來影響骨骼肌的脂肪生成[17,23]。

綜上所述，本次研究主要利用生物信息學(xué)技術(shù)分析，獲得了與肌肉萎縮病理機(jī)制相關(guān)的一些重要靶基因及信號通路，其中包含TNNI、FOXO3和MSTN等基因，這些靶點又可能通過調(diào)控AMPK、PPAR等信號通路引發(fā)肌肉萎縮，因此今后可開展針對這些特定的靶點及信號通路的相關(guān)療效及病理機(jī)制研究。