黃欣莉，韓延超，陳杭君，房祥軍，吳偉杰，劉瑞玲，郜海燕

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021）

香菇（）又稱冬菇、香覃，具有獨特的香氣和口味，富含膳食纖維、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)，有益于人體健康，食用和藥用價值很高。市場上銷售的香菇以新鮮香菇為主。香菇貯藏過程中的溫度、濕度、氣體等外界環(huán)境的改變均會影響香菇的貯藏品質(zhì)。新鮮香菇在采后易發(fā)生褐變，香菇的褐變不僅影響其商業(yè)價值，也會造成其感官品質(zhì)的下降和營養(yǎng)成分的損失。褐變問題是香菇保鮮加工中亟待解決的問題。目前控制香菇褐變有化學保鮮劑處理、熱處理、微波、紫外照射、臭氧處理、涂膜等方法。

香菇褐變常伴隨著酶促反應，當果蔬衰老或受外界條件的影響時，細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，在有氧氣存在的條件下，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）與底物接觸，從而使組織褐變，可以降低果蔬組織的PPO活力，抑制呼吸作用，延長保質(zhì)期。1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）處理抑制香菇PPO的活力，保持香菇色澤，減緩香菇褐變。氬氣能夠有效控制香菇呼吸強度、褐變度及PPO活力的升高，降低香菇褐變的速度，有利于香菇的保鮮。

近年來研究表明，果蔬褐變的發(fā)生可能是由于能量供應有限或產(chǎn)生速率慢，能量缺乏和氧自由基共同作用可能導致細胞膜損傷，從而引起褐變的發(fā)生。Chen Mengyin等研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）處理能延緩龍眼果皮細胞膜通透性的增加，較好地維持細胞膜中酚類物質(zhì)與PPO在細胞中的區(qū)室化分布，有效降低龍眼果實果皮褐變指數(shù)。王甜的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理的荔枝果實呈現(xiàn)出較高ATP含量和能荷水平，這有利于維持果實細胞膜完整性，延緩荔枝果實褐變和衰老。在食用菌方面也有類似的報道，利用麥角硫因處理雙孢蘑菇可以提高雙孢蘑菇能量代謝相關(guān)酶活力，保證線粒體的ATP合成能力，并保持細胞膜的完整性，從而延緩采后雙孢蘑菇褐變和衰老；此外，利用負離子水處理40 min可使香菇保持相對穩(wěn)定的能荷水平，有助于細胞自我修復，維持代謝穩(wěn)態(tài)，同時可以延緩香菇的褐變與衰老。

本實驗首先通過研究不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對采后香菇在貯藏期間呼吸與褐變相關(guān)酶活力的影響，確定最佳1-MCP處理劑量，進一步探討1-MCP處理對香菇子實體能量代謝的影響，以期揭示能量代謝在香菇褐變過程中的調(diào)控作用，為香菇采后褐變控制和保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘L901’香菇 浙江武義創(chuàng)新食用菌有限公司。

1-MCP泡騰片劑（有效成分質(zhì)量分數(shù)0.18%）上海利統(tǒng)生化制品有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鉀、乙醇 上海凌鋒化學試劑有限公司；鄰苯二酚 上海麥克林生化科技有限公司；細胞色素c上海源葉生物技術(shù)有限公司；二甲基對苯二胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；氫-鉀ATP酶、鈉-鉀ATP酶試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Bifugo stratos高速冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-9000紫外-可見分光光度計、e2695分析型高效液相色譜儀 美國Waters公司；Spark 10M多功能酶標儀瑞士TECAN公司；CR-400 手持色差儀 日本柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇的1-MCP氣體熏蒸處理

‘L901’香菇于2021年7月2日采收，挑選出大小、成熟度一致、表面無機械損傷和病蟲害的子實體于采收當日運至實驗室，4 ℃預冷12 h后進行1-MCP氣體熏蒸處理。

每個處理組香菇子實體鮮質(zhì)量為（250±10）g，每個處理3個重復。將子實體放入5 L密閉熏蒸箱內(nèi)，將0.69、1.39、2.08 g的1-MCP泡騰片劑分別放入盛有25、50、75 mL去離子水的燒杯中，將燒杯置于熏蒸箱底部中央，使密閉熏蒸箱內(nèi)1-MCP氣體質(zhì)量濃度分別為0.00（即對照組）、0.25、0.50、0.75 mg/L，熏蒸12 h，將熏蒸后的子實體裝入4 mm厚的聚乙烯保鮮袋（340 mm×240 mm）中，于4 ℃下貯藏，在貯藏的0、3、6、9、12 d隨機取樣測定相關(guān)指標。

1.3.2 色澤的測定

用CIELab法測定香菇菌蓋處色澤，每個處理測定10個香菇子實體，每個子實體測定3 次，取平均值，得到香菇菌蓋的*、*、*值。采用Photoshop軟件擬合*、*、*值得到模擬顏色。Δ代表貯藏結(jié)束時香菇與第0天香菇的色差，采用CIE 1976公式（式（1））進行計算，Δ可以反映香菇樣品色澤變化程度。

1.3.3 褐變度的測定

參照文獻[17]的方法進行測定，稱取2 g香菇子實體樣品，加入5 mL 95%（體積分數(shù)）乙醇溶液研磨成勻漿，10 000 r/min離心20 min后取上清液，測定420 nm波長處吸光度以表征褐變度。

1.3.4 呼吸強度的測定

參照文獻[18]的方法并稍作修改。將100 g香菇子實體放置于固定體積的真空干燥器內(nèi)，采用靜置法測定呼吸強度，重復3 次，單位為mg/（kg·h）。

1.3.5 多酚氧化酶活力的測定

PPO活力測定參照文獻[7]所述方法，稱取1 g香菇子實體樣品加入5 mL預冷的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.0，后同），4 ℃下勻漿后在12 000 r/min離心20 min，收集上清液得到粗酶液。采用1.0 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚、4.0 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）和200 μL粗酶液進行測試。將反應混合物在25 ℃水浴加熱0.5 min，以等體積磷酸鈉緩沖液代替酶液作為空白對照，采用分光光度計測定420 nm波長處測吸光度，每30 s記錄1 次。以每克樣品（均以鮮質(zhì)量計，后同）每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活力單位U，單位為U/g，重復3 次。

1.3.6 ATP、AMP、ADP含量和能荷水平的測定

參照文獻[19]的方法，將2.50 g香菇子實體樣品在液氮中快速冷凍后均質(zhì)成粉末，加入10.0 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液冰浴1 min，以提取磷酸腺苷。于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取6 mL上清液，用1 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為6.6±0.1。將中和后的上清液冰浴靜置30 min，然后在4 ℃條件下，4 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后定容至10 mL，備用。

高效液相色譜條件：流動相為磷酸緩沖液（pH 7.0），流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長為254 nm。采用外標法測定ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）的含量，重復6 次，單位為mg/g。能荷水平按公式（2）計算。

1.3.7 能量代謝相關(guān)酶活力測定

細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力：參照文獻[20]的方法略有改動。1 g香菇子實體樣品加入9 mL 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液，含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L聚乙烯吡啶烷酮，4 ℃、4 000 r/min離心10 min。收集上清液，在4 ℃下12 000 r/min離心20 min。用洗滌緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸）洗滌2 次。最后的沉淀物用洗滌緩沖液溶解，得到線粒體粗酶液。取0.4 mL的線粒體粗酶液，加入1.5 mL 0.4 mg/L細胞色素c，再加入1.5 mL 4 mg/L二甲基對苯二胺溶液，在37 ℃下保溫2 min，以未加酶液的反應體系為空白對照，測定在550 nm波長處的吸光度。以每克樣品每分鐘OD值變化0.01為1個酶活力單位U，最終結(jié)果以U/g表示，重復3 次。

SDH活力：使用SDH酶試劑盒測定，以每克組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為1個活力單位U，最終結(jié)果以U/g表示，重復3 次。

ATP酶活力：使用氫-鉀ATP酶試劑盒、鈉-鉀ATP酶試劑盒測定，以每小時每克組織的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷為1個活力單位U，最終結(jié)果以U/g表示，重復3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進行計算，設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 24軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性檢驗分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對香菇色差和褐變度的影響

由圖1可知，與0 d相比，隨著貯藏期的增加，香菇發(fā)生褐變，貯藏期越長，香菇褐變越嚴重，與0 d香菇的顏色差異越明顯。與對照組相比，在貯藏期間1-MCP處理組的香菇色澤變化較小，且0.50 mg/L處理組的香菇色差在貯藏期內(nèi)一直處于最低水平。在貯藏末期，各處理組的香菇均已處于生命末期，失去商品價值，色澤變化較小。圖1B顯示，香菇隨著貯藏時間的延長，褐變度不斷上升，但經(jīng)1-MCP處理的香菇褐變度均低于對照組。貯藏過程中，前3 d對照組香菇褐變比較明顯，之后至貯藏末期褐變度略有增加；1-MCP處理的香菇褐變度增加緩慢，但當1-MCP處理質(zhì)量濃度過高時，也會促使褐變度增加。其中0.25 mg/L和0.50 mg/L 1-MCP處理的香菇褐變度在整個貯藏期內(nèi)均顯著低于對照組（＜0.05）。由此可見，1-MCP處理可以延緩香菇色澤的不良變化，0.25 mg/L和0.50 mg/L 1-MCP處理抑制效果較好。

圖1 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇色差和褐變度的影響Fig. 1 Effects of treatment with different 1-MCP concentrations on the color difference and browning degree of Lentinus edodes

2.2 1-MCP處理對香菇呼吸強度的影響

由圖2可知，1-MCP處理能降低香菇的呼吸強度，且0.50 mg/L的1-MCP處理能明顯抑制香菇呼吸強度。在0～12 d內(nèi)，各處理香菇的呼吸強度總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律，自第6天后，香菇的呼吸強度均開始下降。對照組香菇的呼吸強度在貯藏期間一直維持較高水平。對照組、0.25、0.50、0.75 mg/L處理組香菇呼吸強度峰值分別為86.39、87.85、66.00、70.25 mg/（kg·h），對照組、0.25、0.75 mg/L 1-MCP處理組的呼吸高峰出現(xiàn)在第3天，0.50 mg/L處理組的呼吸強度在第6天達到峰值。香菇為典型的呼吸躍變型食用菌，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，1-MCP處理能夠明顯降低香菇的呼吸強度，減弱香菇在采后的呼吸作用。

圖2 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇呼吸強度的影響Fig. 2 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on the respiration intensity of Lentinus edodes

2.3 1-MCP處理對香菇多酚氧化酶活力的影響

PPO能催化多種酚底物的氧化，隨著貯藏時間的延長，果蔬膜結(jié)構(gòu)逐漸破損，從而打破了PPO和酚類物質(zhì)的區(qū)域化分布，使其相互接觸生成褐變物，而引起果蔬褐變。圖3為香菇貯藏期間PPO活力的變化情況。整個貯藏期間，PPO活力不斷升高，造成香菇褐變程度加劇。經(jīng)1-MCP處理后的香菇PPO活力始終低于對照組，貯藏6 d后出現(xiàn)顯著性差異（＜0.05），表明1-MCP處理可以抑制PPO活力增加，推遲PPO活力的高峰出現(xiàn)時間，且1-MCP處理組的PPO活力峰值顯著低于無處理組（＜0.05）。實驗結(jié)果表明，1-MCP處理能顯著抑制PPO活力，阻礙黑色素物質(zhì)的產(chǎn)生與積累。

圖3 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇PPO活力的影響Fig. 3 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on PPO activity of Lentinus edodes

2.4 1-MCP處理對香菇ATP、AMP、ADP含量和能荷的影響

ATP含量減少及能荷水平的下降意味著維持細胞生命活動所需要的能量不足，使果蔬采后生理代謝瓦解，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而加速品質(zhì)劣化。圖4A顯示香菇在貯藏過程中ATP含量先上升后下降，1-MCP處理的香菇ATP含量顯著高于對照組（＜0.05）。圖4B顯示在對照組和0.25 mg/L 1-MCP處理下，香菇的ADP含量呈先上升后下降的趨勢，0.50 mg/L和0.75 mg/L質(zhì)量濃度下，ADP的含量總體呈下降的趨勢。如圖4C所示，香菇的AMP含量均隨貯藏時間的延長而呈現(xiàn)上升的趨勢，對照組香菇由于貯藏0 d時ATP含量低于其他處理組，其AMP含量也處于較低水平，在貯藏后期迅速上升，而經(jīng)1-MCP處理的香菇子實體內(nèi)AMP含量增長速度基本不變。如圖4D所示，對照組能荷總體處于較低水平，在第6天出現(xiàn)高峰后迅速降低，而1-MCP處理組香菇的能荷沒有出現(xiàn)較大波動。由此可知，1-MCP處理能夠使香菇維持較高的ATP含量并穩(wěn)定其能量水平，從而保證香菇在采后生理活動的能量供應。

圖4 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇ATP（A）、ADP（B）、AMP（C）含量和能荷（D）的影響Fig. 4 Effects of treatment with different 1-MCP concentrations on the contents of ATP (A), adenosine diphosphate (B) and adenosine monophosphate (C) and energy charge (D) of Lentinus edodes

2.5 1-MCP處理對香菇CCO、SDH活力的影響

CCO、SDH是線粒體的標志酶，其活力變化能夠反映線粒體的功能特性。如圖5A所示，香菇的CCO活力在貯藏期內(nèi)先上升后下降，對照組的CCO活力下降迅速，而經(jīng)過1-MCP處理的香菇CCO活力高峰均高于對照組，且出現(xiàn)時間較晚于對照組，1-MCP處理能推遲CCO活力高峰的出現(xiàn)。貯藏6 d后，對照組子實體的CCO活力下降，處理組CCO維持較高活力，顯著高于對照組（＜0.05）。由圖5B可知，對照組香菇SDH活力呈下降趨勢，而1-MCP處理組呈先上升后下降趨勢。0.25、0.50 mg/mL和0.75 mg/mL 1-MCP處理組SDH活力的峰值分別為168.25、147.49、123.37 U/g，分別高出對照組73.96%、52.49%、27.53%。處理質(zhì)量濃度越高，香菇SDH活力越高。1-MCP處理能夠保持香菇CCO活力和SDH活力，從而支撐其三羧酸循環(huán)和呼吸鏈，保障了線粒體功能，減緩了能量的下降。

圖5 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇CCO（A）和SDH（B）活力的影響Fig. 5 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on CCO (A) and SDH (B) activity of Lentinus edodes

2.6 1-MCP處理對香菇ATP酶活力的影響

跨膜ATP酶分布于各種細胞器膜上，直接參與質(zhì)子梯度能的產(chǎn)生和利用，參與能量的合成，也能使ATP水解，即水解ATP和泵出質(zhì)子。由圖6A可知，與對照組相比，1-MCP處理能明顯提高氫-鉀ATP酶活力（＜0.05），對照組和0.75 mg/L處理組的氫-鉀ATP酶活力差異不明顯。其他兩個處理組在貯藏期間，香菇的氫-鉀ATP酶保持著較高的活力。由圖6B可知，香菇的鈉-鉀ATP酶活力隨著貯藏期的增加呈先下降后上升趨勢，采收6 d后，鈉-鉀ATP酶活力開始升高，且對照組香菇的鈉-鉀ATP酶活力顯著低于其他處理組（＜0.05）。能量相關(guān)酶活力下降會降低線粒體產(chǎn)能效率，使細胞能量虧損，引起子實體褐變，由此推斷，1-MCP處理能夠使ATP酶處于較高活力，保持線粒體的產(chǎn)能效率，維持香菇子實體的能量水平。

圖6 不同質(zhì)量濃度1-MCP處理對香菇氫-鉀ATP酶（A）和鈉-鉀ATP酶（B）活力的影響Fig. 6 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on H/K-ATPase (A) and Na/K-ATPase (B) activity of Lentinus edodes

3 討 論

1-MCP處理能降低某些園藝作物表皮、果心、果肉和子實體的褐變，也可以影響青椒、柿子的色度變化。本研究也得到了類似的結(jié)果，1-MCP處理在一定程度上維持了香菇的色澤，降低了香菇的褐變度，起到了延緩香菇褐變的作用。大量研究證明了1-MCP處理能抑制果蔬的呼吸強度，通過抑制乙烯的合成從而阻礙乙烯作用于果蔬的進程，達到延緩果蔬的成熟衰老的作用，提高貯藏品質(zhì)，并且1-MCP可以抑制PPO活力。肖子寒等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1-MCP處理后的金紅蘋果果實果皮明亮鮮艷，1-MCP很好地保持了果實色澤，抑制了PPO活力，延緩了果實的成熟和果肉的褐變。本研究數(shù)據(jù)證明，1-MCP處理可以降低香菇呼吸強度和推遲呼吸高峰的出現(xiàn)時間，同時，1-MCP處理降低了PPO活力，阻礙黑色素物質(zhì)的生成。1-MCP能抑制香菇褐變，可能與1-MCP抑制的乙烯作用和PPO活力有關(guān)，延緩了香菇的衰老和酶促褐變。

能量供應在控制果實成熟、衰老和收獲后的生理失調(diào)起重要作用，而ATP酶、SDH和CCO是能量代謝和調(diào)節(jié)ATP合成的關(guān)鍵酶。能量相關(guān)酶活力下降會降低線粒體產(chǎn)能效率，使細胞能量虧損，引起果實褐變，可以通過提高SDH和CCO的活力而提高果蔬ATP含量和能荷水平。Vichaiya等發(fā)現(xiàn)ClO通過提高龍眼能量代謝相關(guān)酶活力（SDH、CCO和ATP酶），促進和維持能量產(chǎn)生，從而降低了龍眼果實在貯藏過程中的果皮褐變。本實驗結(jié)果表明，適宜濃度的1-MCP處理提高了香菇在貯藏期間的SDH、CCO和ATP酶活力，這些酶的活力影響著線粒體供能，在香菇能量產(chǎn)生過程中起著積極的作用，有利于香菇能量的產(chǎn)生與傳導。果蔬貯藏后期所需的ATP供應不足會引起膜系統(tǒng)的破壞，導致細胞代謝紊亂，引起衰老、褐變、冷害等現(xiàn)象的發(fā)生。高ATP含量和高能荷水平有助于維持膜的完整性，從而延緩膜通透性增加導致的褐變。Li Ling等研究表明，0.1 mol/L褪黑素處理延緩了雙孢菇ATP含量和能荷的降低，減弱其電子泄漏，延緩衰老褐變。本研究結(jié)果表明，1-MCP處理減緩了香菇ATP、ADP、AMP含量的下降，總體上處理組香菇ATP、ADP、AMP含量在貯藏3～9 d內(nèi)明顯高于對照組，保證了香菇子實體的能荷水平，從而維持了香菇機體正常功能。1-MCP處理減弱了香菇的呼吸強度，但提高了ATP水平，這可能是1-MCP處理香菇在貯藏期間的呼吸強度較弱、ATP消耗較慢，造成ATP的積累所致。

綜上所述，1-MCP處理能夠抑制香菇采后呼吸強度、PPO活力，調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)酶活力，維持香菇的能量狀態(tài)，從而延緩香菇褐變的發(fā)生。在本實驗條件中，0.50 mg/L的1-MCP處理能較好地降低香菇呼吸強度，顯著降低PPO活力，維持SDH、CCO和ATP酶活力，進而維持香菇的能量水平，最大程度上延緩香菇的褐變。