路宗博，張盈月，葛科立，張金玉，薛美蘭，葛銀林

（青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266073）

肥胖是由多種因素導致的慢性代謝性疾病，表現(xiàn)為脂肪在體內(nèi)過多堆積和異常分布。下丘腦對機體能量平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，下丘腦炎癥和肥胖之間有密切關系，抑制下丘腦炎癥有助于抵抗肥胖的發(fā)生與發(fā)展。下丘腦神經(jīng)核團的肽能神經(jīng)元可以合成并釋放對能量代謝和攝食行為進行調(diào)節(jié)的神經(jīng)肽。炎癥反應在糖脂代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，抑制炎癥反應有利于改善糖脂代謝。

-3多不飽和脂肪酸（-3 polyunsaturated fatty acids，-3 PUFAs）是人體必需脂肪酸，有研究顯示，其具有抗炎作用，可以抑制炎性因子白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的釋放，阻斷機體過度炎癥反應，也可能通過下調(diào)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關基因表達而抑制炎癥反應。攝入富含-3 PUFAs的膳食可以減輕胰島素抵抗和降低肥胖癥患病率，能夠有效改善糖脂代謝異常的情況。Kang將秀麗隱桿線蟲（）的基因轉(zhuǎn)入C57BL/6小鼠，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，使其可以將-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為-3 PUFAs，增加內(nèi)源性-3 PUFAs的含量，小鼠成為研究-3 PUFAs作用的最佳模型。前期研究發(fā)現(xiàn)，相同飼養(yǎng)條件下，小鼠體質(zhì)量以及Lee’s指數(shù)顯著低于野生型小鼠，且小鼠下丘腦組織中的炎癥因子、、、、的mRNA相對表達量明顯下調(diào)，mRNA相對表達量明顯上調(diào)，表明小鼠下丘腦中的炎癥反應明顯低于野生型小鼠。這提示內(nèi)源性-3 PUFAs含量的增加與減輕小鼠下丘腦炎癥并抵抗肥胖有關，但其機理目前尚不明確。

外泌體是一種包含蛋白質(zhì)、核酸（DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等）和脂質(zhì)等內(nèi)容物的囊泡結構，對于外泌體參與疾病發(fā)生發(fā)展影響的具體分子機制，目前研究還不夠透徹。外泌體可以通過參與細胞間通訊、細胞增殖與遷移等過程，影響受體細胞基因的表達和功能的改變，進而廣泛參與眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展。其中，研究最多的就是外泌體內(nèi)容物中的miRNA，雖然以當前的技術水平還很難排除外泌體中其他內(nèi)容物對受體細胞的影響，但是miRNA仍被視為外泌體中最關鍵的功能元件。研究表明，細胞釋放的外泌體miRNA有兩種類型的功能，一種是直接與靶基因mRNA特異結合，影響受體細胞中基因的表達；另一種方式是作為特異受體的激動劑發(fā)揮配體作用從而直接與蛋白質(zhì)相互作用。外泌體miRNA可以與相鄰細胞直接反應或者通過體液循環(huán)到達受體細胞發(fā)揮作用。推測可能是下丘腦神經(jīng)干細胞來源的外泌體經(jīng)腦脊液等渠道，影響臨近小膠質(zhì)細胞和下游與脂質(zhì)代謝相關細胞的基因表達，從而發(fā)揮抑制下丘腦炎癥并抵抗肥胖的作用。

本實驗以轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，以野生型C57BL/6小鼠為對照，研究內(nèi)源性-3 PUFAs對下丘腦神經(jīng)干細胞來源的外泌體miRNA的調(diào)節(jié)作用，探究-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥及肥胖的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

本課題組所飼養(yǎng)的SPF級轉(zhuǎn)基因小鼠（雜合）由美國哈佛醫(yī)學院康景軒教授建立及贈送，野生型C57BL/6小鼠由轉(zhuǎn)基因小鼠傳代獲得。將上述小鼠置于青島大學生物醫(yī)學中心的實驗動物中心進行飼養(yǎng)。動物實驗通過青島大學生物醫(yī)學中心倫理委員會審查。

DNA提取酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、氯仿；異戊醇 國藥集團化學試劑有限公司；T3 Super PCR Mix 北京擎科生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒 上海雅酶生物科技有限公司；一抗兔抗鼠CD63、標記山羊抗兔IgG二抗 美國Abcam公司；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQTMSYBRColor qPCR Master Mix南京諾唯贊生物科技有限公司；NEBNextPoly(A) mRNA Magnetic Isolation Module 美國New England Biolabs公司；Ribo-ZeroMagnetic Gold Kit (Human/Mouse/Rat)美國Epicentre公司；NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina、TruSeq Rapid SR Cluster Kit 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 小鼠的飼養(yǎng)及基因型鑒定分組

將轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型C57BL/6小鼠進行雜交，待雌鼠懷孕后單獨飼養(yǎng)，直至幼鼠出生。對同窩新生幼鼠進行標記后剪取新生幼鼠尾尖1～2 mm，用酚-氯仿法提取組織的基因組DNA。通過普通PCR法擴增基因，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，將新生幼鼠分為轉(zhuǎn)基因組與野生型C57BL/6組（WT組）。

1.3.2 小鼠下丘腦神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及細胞鑒定

分別取轉(zhuǎn)基因組與WT組新生幼鼠各3 只，用體積分數(shù)75%乙醇溶液進行體表消毒后，在超凈工作臺進行解剖，獲得其下丘腦組織。用移液器槍頭將下丘腦組織在細胞篩中進行充分研磨，然后用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4，下同）重懸洗滌。3 000 r/min離心5 min后，棄上清液，用神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基將細胞重懸，按照5×10個/mL的密度接種于T75一次性培養(yǎng)瓶中，進行原代培養(yǎng)。

在37 ℃ CO恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后傳代，同時取部分細胞進行形態(tài)學及蛋白水平的鑒定。在光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，與ATCC細胞庫中的下丘腦神經(jīng)干細胞（hypothalamus neural stem cells，htNSCs）形態(tài)學信息進行比對，鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為htNSCs。此外，取部分細胞進行蛋白質(zhì)提取，然后通過Western blotting對神經(jīng)干細胞標志蛋白Nestin進行表達鑒定。

1.3.3 htNSCs來源的外泌體提取與鑒定

對于攜手共建瀾湄合作命運共同體，云南省人民政府副省長任軍號提出三點倡議：一是提升區(qū)域經(jīng)濟整體競爭力，積極推動落實《瀾湄國家關于加強跨境經(jīng)濟合作的部長級聯(lián)合聲明》，共同編制《瀾湄國家跨境經(jīng)濟合作五年發(fā)展規(guī)劃》，實施《瀾湄區(qū)域合作智能貿(mào)易網(wǎng)絡倡議》。二是基礎先行，不斷加快瀾湄合作互聯(lián)互通建設，推動各類互聯(lián)互通便利化措施取得實效。三是親誠惠容，不斷深化交流合作，使瀾湄合作的成果更多惠及民眾。

收集組、WT組htNSCs培養(yǎng)上清液，每個樣本取細胞上清液50 mL，差速超速離心法提取外泌體進行鑒定。500×離心5 min，從細胞上清液樣品中去除細胞。轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，2 000×離心10 min，再將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10 000×離心30 min，去除脫落的微泡。上清液用0.22 μm的過濾膜過濾，100 000×離心2 h，沉淀中加1×PBS，吹打混勻。重復上一步驟一次，用50～100 μL 1×PBS重溶外泌體，-80 ℃保存。采用透射電子顯微鏡觀察外泌體微結構，從-80 ℃冰箱取出樣本的PBS懸液解凍，用鑷子輕輕夾取一枚銅網(wǎng)，用銅網(wǎng)在樣本的PBS懸液中撈取2～3 次，使樣本附于銅網(wǎng)上，吸取1%的磷鎢酸滴加到銅網(wǎng)上，染色2～10 s，用滅菌的濾紙片吸去多余的懸液與染色液，輕輕將銅網(wǎng)放置于透射電子顯微鏡樣品槽中進行觀察；采用NTA技術測定樣本濃度與粒徑分布，該技術依賴于Nanosight平臺，可以根據(jù)觀察到的樣本中顆粒的運動軌跡得到顆粒的粒徑數(shù)據(jù)，并利用平臺對所有樣本顆粒做跟蹤分析，最終得出樣本的粒徑數(shù)量分布情況與顆粒物的濃度數(shù)據(jù)；利用Western blotting進行外泌體表面標志蛋白CD63的表達鑒定。

1.3.4 miRNA高通量測序及miRNA差異表達分析

提取外泌體總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000超微量分光光度計質(zhì)檢定量后，構建文庫，采用2100芯片生物分析儀進行文庫質(zhì)量測定，測序文庫在0.1 mol/L NaOH溶液作用下變性成單鏈DNA，在Illumina NextSeq 500測序儀上進行51個循環(huán)測序。使用edgeR軟件包進行組間miRNAs的差異表達分析。通過設定閾值為1.5 倍差異（fold change）、≤0.05且組內(nèi)CPM平均值≥1來篩選差異表達miRNA。對比小鼠與WT組野生型C57BL/6小鼠htNSCs來源的外泌體差異表達的miRNA。

1.3.5 差異表達miRNA的靶基因預測及靶基因功能富集分析

基于已知的和新預測的miRNA，根據(jù)種子區(qū)與靶基因3’ UTR區(qū)的互補關系，結合自由能的情況預測miRNA的靶基因。將差異表達的miRNA在miRDB和TargetScan兩個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預測。通過基因本體（gene ontology，GO）分析，找出差異表達的miRNA靶基因和哪些具體的功能條目聯(lián)系最大，重點關注和炎癥及肥胖相關的生物學過程條目。采用R軟件包ClusterProfiler分析，根據(jù)＜0.05且出現(xiàn)在相應富集條目中的差異表達基因數(shù)目（Count）＞1的標準篩選顯著富集的KEGG通路。

1.3.6 qPCR測定預測的靶基因相對表達量

取分離上清液后的htNSCs，提取RNA，用超微量分光光度計檢測RNA樣品濃度，取等質(zhì)量RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄。以為內(nèi)參基因，采用qPCR法檢測組和WT組小鼠之間相關靶基因mRNA的相對表達量。反轉(zhuǎn)錄、qPCR體系及程序按諾唯贊試劑盒構建。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.01軟件進行分析，各組間數(shù)據(jù)的比較采用檢驗，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠基因型鑒定及分組結果

利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結果如圖1所示，2、5、8泳道在預期位置出現(xiàn)單一高亮條帶，證明新生幼鼠為轉(zhuǎn)基因小鼠，1、3、4、6、7、9泳道在預期位置無條帶，證明新生幼鼠為野生型C57BL/6小鼠。

圖1 新生幼鼠基因型鑒定結果Fig. 1 Genotype identification of newborn mice

2.2 小鼠htNSCs的鑒定結果

光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結果顯示，該神經(jīng)球外圍分布有一層大小較均勻、折光性好的細胞（圖2A），符合htNSCs形態(tài)學特征；將該細胞裂解后提取蛋白，經(jīng)Western blotting鑒定，結果如圖2B所示，細胞表達了神經(jīng)干細胞的標志蛋白Nestin，即證明該細胞為htNSCs。

圖2 小鼠htNSCs鑒定結果Fig. 2 Identification of hypothalamic neural stem cells (htNSCs)

2.3 htNSCs來源的外泌體鑒定結果

樣本的粒徑分布結果如圖3A所示，樣本粒徑集中分布在110 nm左右，該粒徑樣本占比為97.9%，符合外泌體的粒徑特征。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察樣本發(fā)現(xiàn)了茶托型或一側(cè)凹陷的半球形的典型外泌體結構（圖3B），且直徑在110 nm左右，符合外泌體結構特征。通過Western blotting實驗對外泌體標志蛋白CD63進行表達鑒定，結果如圖3C所示，樣本中有外泌體表面標志蛋白CD63表達，表明該樣本中含有外泌體。綜上，經(jīng)多種方式鑒定，判定所提取樣本為外泌體，可以繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

圖3 外泌體鑒定結果Fig. 3 Results of exosome identification

2.4 htNSCs來源外泌體差異表達miRNA聚類分析結果

層次聚類是一種廣泛應用于miRNA表達數(shù)據(jù)分析的聚類方法，表達模式相似的miRNA和生物學性質(zhì)相近的樣本會聚到一個簇中。本實驗根據(jù)組間比較獲得的顯著表達miRNA的CPM值進行聚類分析，樹狀圖結構展示了miRNA和樣本的表達模式的關系。由聚類熱圖可以發(fā)現(xiàn)，兩組樣本聚類明顯（圖4）。

圖4 miRNA聚類熱圖Fig. 4 Cluster heat map of miRNAs

2.5 htNSCs來源外泌體差異表達的miRNA分析

火山圖可以對不同樣本組間差異表達基因進行圖形化展示，使用兩個條件篩選得到差異表達的miRNA并繪制火山圖。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，與WT組相比，組顯著上調(diào)的miRNA有65 條，顯著下調(diào)的miRNA有40 條。

圖5 htNSCs來源外泌體差異表達的miRNA火山圖Fig. 5 Volcanic maps of differentially expressed miRNAs in exosomes derived from htNSCs

2.6 小鼠差異表達的miRNA靶基因預測

根據(jù)miRDB、Targetscan數(shù)據(jù)庫資料及文獻[18-23]，篩選得到7 條可能與下丘腦炎癥、脂質(zhì)代謝及相關的miRNA，其靶基因及靶基因功能見表2。

表2 htNSCs來源的外泌體中可能與下丘腦炎癥及脂質(zhì)代謝相關的miRNATable 2 miRNAs in htNSCs-derived exosomes that may be associated with hypothalamic inflammation and lipid metabolism

2.7 預測的靶基因mRNA相對表達量

對差異表達的miRNA的靶基因mRNA表達量進行qPCR測定，如圖6所示，組與WT組相比，基因、-、表達量顯著下調(diào)，相對表達量分別是0.264±0.014（＜0.01）、0.762±0.038（＜0.05）、0.211±0.100（＜0.01）；基因、、、、表達量極顯著上調(diào)（＜0.01），相對表達量分別是2.457±0.057、2.603±0.044、3.006±0.167、3.053±0.378、2.772±0.357。其中，TLR-4、IL-6、IL-1α均為炎癥因子，其基因表達量降低，表明內(nèi)源性的-3PUFAs可以抵抗炎癥反應?；?、、、均為脂質(zhì)代謝通路關鍵基因，表達量均有所上調(diào)，對脂質(zhì)代謝具有重要調(diào)控作用。

圖6 htNSCs來源外泌體差異表達miRNA靶基因水平Fig. 6 Expression levels of differentially expressed miRNA target genes in htNSCs derived exosomes

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)3 PUFAs水平增加可以改善能量代謝控制小鼠的體質(zhì)量，其機理可能是-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥因子、趨化因子的表達，緩解下丘腦炎癥反應，維持下丘腦能量平衡，進而維持機體全身能量平衡抵抗肥胖的發(fā)生。吳聰?shù)妊芯堪l(fā)現(xiàn)體內(nèi)-3 PUFAs水平的增加可影響小鼠外周血外泌體中miRNA的表達，且與野生型C57BL/6小鼠相比有顯著差異表達的miRNA所調(diào)控的靶基因大多集中在調(diào)控脂質(zhì)代謝的分子通路中，這與本實驗得到的結果相印證，本實驗得到的具有差異表達的小鼠htNSCs來源的7 條外泌體miRNA均在炎癥反應及脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。

miR-17-92基因簇編碼6個miRNA，包括miR-17-5P、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a-1，有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc和E2F1可以直接調(diào)節(jié)miR-17-92基因簇的表達。此外，IL-6可以通過將與其啟動子區(qū)域直接結合來調(diào)節(jié)miR-17-92基因簇的表達，說明miR-17-92基因簇與炎癥之間存在潛在聯(lián)系。本實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型C57BL/6小鼠相比具有差異表達的miR-17-92基因簇編碼的6個miRNA均表現(xiàn)出差異表達，3個炎癥因子相關基因、、的mRNA都出現(xiàn)表達量下降，表明-3 PUFAs可以通過改變htNSCs來源的外泌體中miRNA的表達，調(diào)節(jié)炎癥因子相關基因的表達，從而抑制下丘腦炎癥。

此外，這些差異表達的miRNA靶基因在脂質(zhì)代謝中具有非常關鍵的作用。例如miR-694-5p的靶基因，該基因產(chǎn)物在AMPK信號通路中非常關鍵，研究發(fā)現(xiàn)miR-24可以通過胰島素誘導基因1（）/固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1（）通路軸調(diào)控PUFAs的生物合成。本實驗中小鼠基因表達量極顯著上調(diào)，說明差異表達的miRNA對基因具有調(diào)節(jié)作用，但是其具體分子機制還需要進一步研究。脂肪?；ワ柡兔福╢atty acid desaturase，F(xiàn)ads）對碳鏈較長的不飽和脂肪酸的合成具有十分重要的作用，其中的上游基因是。硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）的表達或活性改變可影響細胞內(nèi)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例。本實驗中小鼠基因表達量也顯著上調(diào)，表明差異表達的miRNA對于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸代謝具有重要作用。周飛等發(fā)現(xiàn)-3 PUFAs在能夠抑制小鼠體質(zhì)量增長的同時，還可以顯著降低小鼠的血糖和血脂水平，也可以反映出-3 PUFAs對于脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用。

綜上，內(nèi)源性-3 PUFAs水平的增加影響了htNSCs來源的外泌體中miRNA的表達，差異表達的miRNA不僅可以調(diào)控、、等炎癥因子基因的表達，還可以調(diào)控脂質(zhì)代謝中的、等關鍵基因的表達，印證了本課題組前期小鼠體內(nèi)增加的-3 PUFAs通過抑制下丘腦炎癥、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來抵抗肥胖的結論。這提示調(diào)節(jié)htNSCs的外泌體內(nèi)miRNA可以改變下游相關基因的表達，可能是-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥和抵抗肥胖的機理之一。這些差異表達的miRNA有望成為診斷代謝異常與肥胖的參考標志物及潛在治療靶標。接下來將對-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥和抵抗肥胖的具體機制開展進一步研究。