馬永潔，李瑋琪，張春梅，普 俊，牙甫禮,3,*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；2.河口海關(guān)，云南 河口 661300；3.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，云南 大理 671000）

心血管疾病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)致死率最高的疾病。血小板作為動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的關(guān)鍵細(xì)胞介質(zhì)，在心血管疾病的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。在某些病理情況下，如高脂血癥、冠心病等，患者循環(huán)血液中的血小板可被凝血酶和二磷酸腺苷等可溶性激動(dòng)劑激活，活化的血小板會(huì)釋放一系列的內(nèi)容物，進(jìn)而參與促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成和發(fā)展。這些內(nèi)容物主要分為3 類，包括α顆粒、致密顆粒和溶酶體顆粒。其中，血小板α顆粒的含量最為豐富，包括膜結(jié)合蛋白CD62P、CD40L等，以及可溶性蛋白如血小板因子-4（platelet factor-4，PF4）、趨化因子配體-5（chemokine ligand 5，CCL5）、-球蛋白等，這些炎癥分子可促進(jìn)血小板聚集，募集并活化白細(xì)胞。此外，ATP、二磷酸腺苷、鈣離子和焦磷酸鹽是致密顆粒的重要內(nèi)容物，對(duì)于介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)起重要作用。血小板溶酶體顆?？赏ㄟ^(guò)膜蛋白（如CD63）和一些水解酶（如葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等）參與血小板的活化和聚集。大量的研究證實(shí)，控制血小板活化是抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成、防治心血管疾病發(fā)生發(fā)展的有效策略之一。

膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)是預(yù)防心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵途徑之一。姜黃素是一種天然活性多酚類化合物，主要來(lái)源于姜科植物根莖。研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗癌和保護(hù)心血管等多種生物學(xué)活性。然而，膳食補(bǔ)充姜黃素時(shí)，其生物利用度較低（通常小于1%），這是限制其臨床應(yīng)用的主要因素之一。研究表明，姜黃素經(jīng)口攝入后，在腸道微生物的作用下迅速轉(zhuǎn)化為各種代謝物，例如二氫姜黃素、四氫姜黃素（tetrahydrocurcumin，THC）、六氫姜黃素、八氫姜黃素等。其中，THC被認(rèn)為是最重要、也是活性最高的腸道代謝物，由于具有較高的生物利用度和穩(wěn)定性，THC可能有潛力開發(fā)成為預(yù)防或者治療許多慢性疾病的重要物質(zhì)。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，膳食補(bǔ)充THC在緩解小鼠過(guò)敏性哮喘方面要優(yōu)于姜黃素。在血小板功能的調(diào)控方面，Mayanglambam等研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在體外能抑制血小板的活化；本課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)也表明姜黃素可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血小板凋亡。但是，THC對(duì)血小板活化和聚集的影響尚不清楚，本研究旨在探討THC對(duì)人血小板活化和聚集的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THC、凝血酶、Fluo-4/AM、熒光素酶試劑美國(guó)Sigma-Aldrich公司；FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD62P抗體、FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD63抗體、CCL5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國(guó)eBioscience公司；PF4商用ELISA試劑盒美國(guó)R&D Systems公司；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒美國(guó)Roche公司；磷酸肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、一抗phospho-PI3K（Tyr）、phospho-Akt（Ser）、Akt、-actin、二抗羊抗兔美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P 美國(guó)Selleck Chemical公司；瓊脂糖凝膠CL-2B美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫冰箱 青島海爾有限公司；CytoFlex流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman Coulter公司；低溫高速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG LABTECH公司；血小板聚集儀 北京泰利康信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對(duì)象的篩選

研究對(duì)象從大理大學(xué)校內(nèi)招募，要求是年齡在25～40 歲之間的健康成人。如果志愿者現(xiàn)在或曾經(jīng)患有心血管疾病、惡性腫瘤、免疫缺陷病等病史，或?yàn)E用藥物、酗酒、吸煙半年以上，或在兩周內(nèi)服用過(guò)抗血小板的藥物（如阿司匹林等），或補(bǔ)充維生素等膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，則不被納入作為本研究的研究對(duì)象。所有志愿者均自愿參與該項(xiàng)目，并均簽署書面知情同意書。

1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備過(guò)程

在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，通過(guò)靜脈穿刺的方法，抽取并制備枸櫞酸鈉抗凝全血，然后300×、22 ℃離心7 min，血液分3 層，從下往上依次為紅細(xì)胞層、白細(xì)胞層和富血小板血漿層，為了避免吸到白細(xì)胞層，小心吸取并收集上層約2/3的富血小板血漿。將富血小板血漿慢慢滴入裝有瓊脂糖凝膠CL-2B的層析柱，可從富血小板血漿中分離得到純度高（98%以上）、結(jié)構(gòu)完整的純化血小板（即血小板懸液），具體方法參照文獻(xiàn)[10,22-23]。本研究完全按照《赫爾辛基宣言》相關(guān)準(zhǔn)則進(jìn)行，并已通過(guò)大理大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3.3 血小板乳酸脫氫酶漏出率的測(cè)定

采用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定血小板乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出率，并以該指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響。首先，取健康人純化血小板與不同濃度的THC（0.1、0.5、1、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L，溶劑為0.05%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或溶劑對(duì)照（0.05%DMSO）預(yù)孵育40 min，然后離心（12 000×、5 min、22 ℃），用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（）。同時(shí)，將10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）作為陽(yáng)性對(duì)照組，也與血小板共同孵育40 min，用來(lái)刺激血小板全部釋放LDH，相同條件下測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（）。血小板LDH漏出率按式（1）計(jì)算。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

本研究涉及的實(shí)驗(yàn)組別有：1）靜息組：指不經(jīng)任何處理的血小板懸液，既不經(jīng)凝血酶激活，也不經(jīng)DMSO處理；2）模型組：即溶劑對(duì)照組（血小板懸液中加入0.05% DMSO，下同）；3）THC組：血小板懸液中分別加入0.5、1、10 μmol/L THC。除了靜息組以外，模型組和THC組的血小板均經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)活化。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板表面CD62P和CD63的表達(dá)量

純化血小板（5×10個(gè)/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對(duì)照在室溫下共同孵育40 min，用FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD62P抗體或CD63抗體標(biāo)記血小板20 min，然后在1 mmol/L Ca存在的條件下，用凝血酶（酶活力不低于2 000 NIH Units/mg蛋白）激活血小板2 min，而靜息組血小板無(wú)需凝血酶激活，然后用體積分?jǐn)?shù)1%的多聚甲醛溶液固定，最后利用CytoFLEX流式細(xì)胞儀測(cè)定血小板表面CD62P和CD63的表達(dá)量。

1.3.6 血小板PF4和CCL5釋放量的測(cè)定

用PF4和CCL5的商業(yè)ELISA試劑盒測(cè)定血小板PF4和CCL5的釋放水平，具體方法參照制造商提供的說(shuō)明書進(jìn)行。純化血小板（1×10個(gè)/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對(duì)照預(yù)孵育40 min，然后在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min。在12 000×、4 ℃的條件下離心5 min，收集上清液，用ELISA試劑盒的方法測(cè)定上清液中PF4和CCL5水平。當(dāng)探討PI3K/Akt信號(hào)通路在THC調(diào)控PF4和CCL5釋放中的作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組，即靜息組、模型組、THC（10 μmol/L）組以及THC+740 Y-P組，其中THC+740 Y-P組為THC（10 μmol/L）和PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P（25 μg/mL）與血小板共同孵育40 min，除了靜息組外，各組血小板用凝血酶激活，然后分別檢測(cè)這4個(gè)組中血小板PF4和CCL5的釋放水平。

1.3.7 血小板ATP釋放量和血小板最大聚集率的測(cè)定

將人純化血小板（2.5×10個(gè)/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對(duì)照預(yù)處理40 min，然后加入熒光素酶試劑與血小板共同孵育2 min，在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板，利用血小板聚集儀記錄ATP釋放量和血小板最大聚集率，THC組聚集抑制率按公式（2）計(jì)算，由自帶軟件生成THC組聚集抑制率（與模型組相比）隨THC濃度變化的曲線并計(jì)算出血小板最大聚集的半數(shù)抑制率。具體方法參照文獻(xiàn)[24]。探討PI3K/Akt信號(hào)通路在THC調(diào)控血小板聚集中的作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)組，即靜息組、模型組、THC（10 μmol/L）組、740 Y-P組以及THC+740 Y-P組，其中740 Y-P組為血小板懸液用PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P（25 μg/mL）孵育40 min，THC+740 Y-P組為THC（10 μmol/L）和740 Y-P（25 μg/mL）一同與血小板共同孵育40 min，除了靜息組外，各組血小板用凝血酶激活，然后檢測(cè)血小板最大聚集率。

1.3.8 血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定

將純化血小板懸液與Fluo-4/AM（0.2 μg/mL）在37 ℃避光孵育30 min 后，離心（3 000×、5 min、37 ℃）沉淀血小板，洗滌后重懸血小板，調(diào)整血小板濃度至3×10個(gè)/mL，然后與不同濃度的THC在37 ℃避光孵育40 min，使用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min，然后利用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm的條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定，并計(jì)算各組的熒光強(qiáng)度與靜息組的熒光強(qiáng)度的比值（即Fluo-4熒光強(qiáng)度比值），以此表征血小板內(nèi)鈣離子濃度。

1.3.9 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

將人純化血小板（2.5×10個(gè)/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對(duì)照在體外共同孵育40 min，在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板5 min后，離心（12 000×、15 min、4 ℃），棄上清液，在冰上用細(xì)胞裂解液對(duì)血小板裂解30 min，然后離心（12 000×、15 min、4 ℃），收集上清液得到血小板蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測(cè)血小板PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用Newman-Keuls test法進(jìn)行組間兩兩比較，雙側(cè)＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。所有實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果至少來(lái)自3個(gè)獨(dú)立的志愿者樣本。

2 結(jié)果與分析

2.1 THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

如圖1所示，與陽(yáng)性對(duì)照組（10% SDS）相比，溶劑對(duì)照組（0.05% DMSO）以及不同濃度的THC（0.1～320 μmol/L）組中血小板的LDH漏出率高度顯著降低（＜0.001）。THC在0.1～80 μmol/L的濃度范圍內(nèi)LDH漏出率與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（＞0.05），因此可以認(rèn)為，在這個(gè)濃度范圍內(nèi)，THC對(duì)健康人純化血小板無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用。但是160 μmol/L和320 μmol/L濃度的THC呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性作用，因?yàn)槠銵DH漏出率與對(duì)照組相比顯著或極顯著升高（＜0.05、＜0.01）。另外，綜合對(duì)比其他研究報(bào)道中所用THC濃度，最終選擇0.5、1 μmol/L和10 μmol/L進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響Fig. 1 Cytotoxic effect of THC on platelets

2.2 THC對(duì)血小板CD62P的表達(dá)量以及PF4和CCL5釋放量的影響

如圖2A所示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可分別顯著（＜0.05）和高度顯著（＜0.001）抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板表面CD62P的表達(dá)，低濃度（0.5 μmol/L）的THC并不能顯著抑制CD62P的表達(dá)（＞0.05）。如圖2B、C所示，與模型組相比，凝血酶誘導(dǎo)的血小板PF4的釋放水平也被1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC顯著抑制（＜0.05、＜0.001）；10 μmol/L濃度的THC可極顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板CCL5的分泌（＜0.01）。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板α顆粒的釋放。

圖2 THC對(duì)血小板表面CD62P表達(dá)量（A）以及PF4（B）和CCL5（C）釋放的影響Fig. 2 Effect of THC on platelet surface expression of CD62P (A) and the release of PF4 (B) and CCL5 (C)

2.3 THC對(duì)血小板ATP釋放量和胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

如圖3所示，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可極顯著降低凝血酶誘導(dǎo)的血小板ATP釋放水平和胞內(nèi)鈣離子濃度（＜0.01），但是0.5 μmol/L的THC并不能顯著降低ATP釋放量和胞內(nèi)鈣離子濃度（＞0.05）。THC對(duì)ATP釋放水平和胞內(nèi)鈣離子的抑制作用在1 μmol/L濃度組和10 μmol/L濃度組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板致密顆粒的釋放。

圖3 THC對(duì)血小板ATP釋放量（A）和胞內(nèi)鈣離子濃度（B）的影響Fig. 3 Effect of THC on platelet ATP release (A) and intracellular calcium concentrations (B)

2.4 THC對(duì)血小板CD63表達(dá)的影響

如圖4所示，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，凝血酶可明顯促進(jìn)血小板表面CD63的表達(dá)，10 μmol/L濃度的THC高度顯著抑制血小板表面CD63的表達(dá)（＜0.001），但是0.5 μmol/L和1 μmol/L濃度的THC并不能顯著抑制CD63的表達(dá)（＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明10 μmol/L THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板溶酶體顆粒的釋放。

圖4 THC對(duì)血小板表面CD63表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of THC on platelet surface expression of CD63

2.5 THC對(duì)血小板聚集的影響

如圖5A所示，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可高度顯著降低凝血酶誘導(dǎo)的血小板最大聚集率（＜0.001），而且兩組的血小板最大聚集率之間無(wú)顯著差異（＞0.05）。0.5 μmol/L的THC對(duì)血小板最大聚集率與模型組相比無(wú)顯著差異（＞0.05）。THC在0.1～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)血小板最大聚集抑制率的影響見圖5B，THC在0.5～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)，血小板最大聚集抑制率隨著濃度的增加而升高，THC抑制血小板最大聚集的半數(shù)抑制濃度為（0.74±0.03）μmol/L。

圖5 THC對(duì)血小板聚集的影響Fig. 5 Effect of THC on platelet aggregation

2.6 THC對(duì)血小板PI3K/Akt信號(hào)通路活化的影響

如圖6所示，凝血酶可明顯促進(jìn)血小板PI3K（Tyr）和Akt（Ser）發(fā)生磷酸化。與模型組相比，0.5、1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可顯著下調(diào)凝血酶誘導(dǎo)的血小板PI3K的磷酸化水平（＜0.01、＜0.001、＜0.001），其中1 μmol/L和10 μmol/L THC兩組間則無(wú)顯著差異（＞0.05）。與模型組相比，凝血酶誘導(dǎo)的血小板Akt磷酸化水平可被1 μmol/L和10 μmol/L的THC所抑制（＜0.05、＜0.001），而且兩組之間無(wú)顯著差異（＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。

圖6 THC對(duì)血小板PI3K/Akt信號(hào)通路活化的影響Fig. 6 Effect of THC on platelet PI3K/Akt signaling pathway

2.7 THC經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)血小板活化和聚集的影響

如圖7所示，PI3K的特異性激動(dòng)劑740 Y-P可部分逆轉(zhuǎn)THC對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板PF4和CCL5的釋放和血小板聚集的抑制作用，因?yàn)門HC+740 Y-P組相對(duì)于單獨(dú)的THC（10 μmol/L）組血小板PF4和CCL5的釋放水平以及血小板最大聚集率顯著或極顯著升高（＜0.05、＜0.01），但是相對(duì)于模型組顯著降低（＜0.05、＜0.01）。說(shuō)明THC對(duì)血小板活化和聚集的影響與其下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

圖7 THC經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)血小板活化和聚集的影響Fig. 7 THC regulated platelet activation and aggregation through PI3K/Akt signaling pathway

3 討 論

血小板異?；罨途奂纱龠M(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。膳食補(bǔ)充姜黃素可發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和保護(hù)心血管疾病的作用，但是具體機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素的主要腸道代謝物THC在體外可顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化和聚集，提示THC在抗血小板高反應(yīng)性方面具有潛在的實(shí)用價(jià)值。

研究已經(jīng)證實(shí)，心血管疾病患者循環(huán)血液中高濃度的凝血酶和二磷酸腺苷等可直接激活血小板，活化的血小板分泌大量的顆粒物質(zhì)，內(nèi)含有重要的炎癥因子，這些因子是介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)。例如，活化的血小板表面可表達(dá)大量的CD62P，CD62P是α顆粒中最重要的分子之一，它可通過(guò)與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）相結(jié)合發(fā)揮直接與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附的作用，進(jìn)而使白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生活化，并促進(jìn)其凋亡，這對(duì)于血小板促進(jìn)早期的動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成極為關(guān)鍵。研究表明，血小板基因敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成量顯著減少，這與基因敲除小鼠中血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間的相互黏附受到抑制密切相關(guān)。另外，血小板分泌的PF4和CCL5可促進(jìn)血小板活化和聚集，并能募集單核細(xì)胞到達(dá)損傷的血管內(nèi)皮處，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化和分化。Mayanglambam等通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板表面CD62P的表達(dá)和血小板聚集反應(yīng)，但是其腸道代謝物THC對(duì)血小板活化和聚集的影響尚鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，THC可顯著抑制血小板活化，如抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板表面CD62P和CD63的表達(dá)，同時(shí)抑制血小板PF4、CCL5和ATP的釋放。這些對(duì)于THC抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，以及防治心血管疾病發(fā)展可能具有重要意義，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，THC對(duì)血小板活化和聚集、血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用和動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的影響仍值得進(jìn)一步探討。

調(diào)控血小板活化和聚集的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在其中起重要作用。當(dāng)血小板受到激動(dòng)劑激活時(shí)，引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進(jìn)而促進(jìn)下游PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，從而進(jìn)一步激活血小板整合素αIIbβ3的活化，引起血小板顆粒物的釋放和血小板聚集增加。通過(guò)敲除血小板基因或者，則使血小板不能很好地發(fā)生活化和聚集。PI3K/Akt信號(hào)通路在THC抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化中起重要作用，但是其在THC調(diào)控血小板功能方面的機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)THC可顯著降低模型組胞內(nèi)鈣離子濃度，并下調(diào)PI3K和Akt的磷酸化水平，而且PI3K的特異性激動(dòng)劑740 Y-P可部分逆轉(zhuǎn)THC對(duì)血小板活化和聚集的抑制作用，證明THC抑制血小板活化和聚集與其下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明其他信號(hào)通路也可能參與其中。之前的研究表明，姜黃素可通過(guò)糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）/脾源性酪氨酸蛋白激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）/磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）信號(hào)通路抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化和聚集，而THC是否也對(duì)這條信號(hào)通路起調(diào)控作用需要今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本課題組之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每天以800 mg/kg飼料的劑量給小鼠膳食補(bǔ)充姜黃素和THC，喂養(yǎng)25 d后，姜黃素組和THC組小鼠血漿中THC的濃度分別為0.2 μmol/L和0.9 μmol/L，而且在這個(gè)劑量下，小鼠未觀察到明顯的毒副反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中小鼠血漿的THC濃度，選擇的THC濃度范圍為0.5～10.0 μmol/L，該濃度范圍涵蓋生理劑量和藥理劑量，并且與其他報(bào)道的體外研究中所使用的THC濃度接近。日常生活中經(jīng)常食用咖喱的人群中，姜黃素的日攝入量可達(dá)10 g，而THC作為姜黃素的主要腸道代謝物，其對(duì)人體的安全性可以確定。本研究發(fā)現(xiàn)THC可抑制血小板活化和聚集，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，膳食補(bǔ)充THC是否影響凝血過(guò)程仍值得深入探討；另外，THC是否有望開發(fā)成為安全的抗血小板藥物也需更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。目前國(guó)內(nèi)外在THC量化生產(chǎn)方面進(jìn)行了不斷地探索，其體外合成途徑主要有化學(xué)合成和生物合成。在化學(xué)合成方法中，主要是通過(guò)利用姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素進(jìn)行氫化而得到，或者采用新型催化劑在室溫下直接將姜黃素還原為THC，此方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。在生物合成方法中，有酵母生物轉(zhuǎn)化法和大腸桿菌合成法等。目前微生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行THC的生產(chǎn)已成為研究的熱點(diǎn)，它可能成為今后提高THC工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素的腸道代謝物THC能夠顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的人血小板活化和聚集，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)?？傊狙芯繌臓I(yíng)養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為姜黃素和THC防治心血管疾病提供了一定的理論依據(jù)。