程 歡， 張東華， 張俊忠， 劉 麗

(西南林業(yè)大學(xué)保護(hù)生物學(xué)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

1 材料與方法

1.1 樣品采集

蘋果砧木M9T337(以下簡(jiǎn)稱為T337)為二年生苗木，于2019年10月取自云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)樹木園。蘋果園的肥、水、修剪等管理方法參照常規(guī)措施。園中隨機(jī)挖取無明顯病蟲害的植株4株，去除腐葉后，分別將根、枝、葉放入不同的無菌樣品袋中混合均勻，再隨機(jī)選取樣品進(jìn)行表面消毒處理，根(G)、枝(Z)、葉(Y)樣品分別命名為G1～G4、Z1～Z4、Y1～Y4。

1.2 表面消毒

用無菌水將蘋果根、枝、葉沖洗干凈，用無菌紙吸干水分后，用75%乙醇浸泡30 s，將根、枝條和葉片分別用0.1%氯化汞振蕩浸泡60、60、30 s，再用無菌水沖洗4次，最后用無菌濾紙吸干表面的水分。取最后1次清洗蘋果組織的100 μL無菌水涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)72 h，用于檢測(cè)滅菌效果。

1.3 總DNA的提取及擴(kuò)增

對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒后，加入液氮充分研磨，取適量轉(zhuǎn)入滅菌EP管中，參照OMEGA試劑盒[Omega Mag-bind soil DNA kit(M5635-02)]說明書進(jìn)行總DNA的提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA純度和濃度。

1.4 擴(kuò)增子測(cè)序

通過Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序靶標(biāo)DNA為16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)(引物為343F、798R)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)(引物為ITS5、ITS2)。將目標(biāo)條帶用凝膠純化后構(gòu)建文庫，在根、枝、葉引物序列前插入6個(gè)堿基組成的標(biāo)簽序列，以區(qū)分根、枝、葉樣品。由上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

用FLASH、QIIME軟件分別對(duì)不同樣品的讀長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接、過濾。用VSEARCH軟件檢測(cè)并去除嵌合體序列，然后用UPARSE算法對(duì)優(yōu)化序列在97%的相似性水平上進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類。用Greengene等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，去除注釋為葉綠體、線粒體及非細(xì)菌界和真菌的OTUs。分別對(duì)細(xì)菌、真菌的OTUs進(jìn)行α-多樣性、β-多樣性分析，同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。最后用PICRUSt軟件進(jìn)行功能和代謝途徑的預(yù)測(cè)，并參照MetaCyc數(shù)據(jù)庫(Encyclopedia of Metabolic Pathway)進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生菌的OTUs分布及其多樣性分析

蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生細(xì)菌的OTUs共有11 386個(gè)。其中根、枝、葉共有134個(gè)(占3.53%)OTUs，特有OTUs數(shù)分別為9 175個(gè)(占80.51%)、500個(gè)(占4.39%)、749個(gè)(占6.58%)(圖1)。由此可見，不同部位的內(nèi)生細(xì)菌種類組成差異很大，且根部細(xì)菌的種類組成特異性高于葉、枝?；贠TUs數(shù)量及相對(duì)豐度，對(duì)不同部位蘋果樹內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行α-多樣性分析，結(jié)果表明，Chao1指數(shù)、香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)及物種豐富度(observed species)指數(shù)均表現(xiàn)為根部顯著高于枝部、葉部，而枝部和葉部間無顯著差異(表1)，可見根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性、物種豐富度顯著高于枝部、葉部。

蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生真菌的OTUs共有2 718個(gè)，其中根、 枝、 葉部共有221個(gè)(占8.13%)OTUs，特有OTUs分別為1 187個(gè)(占43.67%)、295個(gè)(占10.85%)、603個(gè)(占22.19%)(圖2)，說明不同部位內(nèi)生真菌的種類組成差異較大?；贠TUs數(shù)量及相對(duì)豐度分析內(nèi)生真菌α-多樣性可知，Simpson指數(shù)表現(xiàn)為根部、葉部均顯著高于枝部，但根部與葉部間的差異不顯著。Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)及Observed species指數(shù)均表現(xiàn)為在根、枝、葉3個(gè)部位差異顯著，且根>葉>枝?？傮w趨勢(shì)都是根部?jī)?nèi)生真菌多樣性、物種豐富度最高，枝部最低(表2)。綜合表1、表2的結(jié)果可知，蘋果砧木T337根部?jī)?nèi)生細(xì)菌Chao1指數(shù)明顯高于內(nèi)生真菌，由此推測(cè)其根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的物種豐富度高于內(nèi)生真菌。

表1 內(nèi)生細(xì)菌的α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果

表2 內(nèi)生真菌的α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果

基于UniFrac距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果顯示，對(duì)于蘋果砧木T337組織樣品而言，無論是內(nèi)生細(xì)菌還是內(nèi)生真菌都依據(jù)植物的部位在空間排布上呈現(xiàn)明顯的聚類(圖3)。枝與葉的內(nèi)生細(xì)菌群落通過主成分1聚類，枝與根間通過主成分2聚類，其中主成分1的差異貢獻(xiàn)率為27.45%，主成分2的差異貢獻(xiàn)率為18.36%。

基于Jaccard距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果(圖3-b)顯示，不同部位內(nèi)生真菌主坐標(biāo)分析的主成分1、主成分2對(duì)樣品的差異貢獻(xiàn)率分別為17.5%、15.9%，其中主成分1是差異的主要來源，通過主成分1即可將葉與枝內(nèi)生真菌群落聚類，葉、根內(nèi)生真菌群落通過主成分2聚類。此外，無論是內(nèi)生細(xì)菌還是真菌，其枝部組內(nèi)樣品間群落結(jié)構(gòu)都具有更高的相似性。

2.2 蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生菌在門水平上的組成和相對(duì)豐度

種群歸類結(jié)果顯示，蘋果砧木T337根部所得內(nèi)生細(xì)菌OTUs序列分屬21個(gè)門、52個(gè)綱、75個(gè)目、154個(gè)科、319個(gè)屬，枝部所得內(nèi)生細(xì)菌OTUs序列分屬12個(gè)門、24個(gè)綱、40個(gè)目、82個(gè)科、117個(gè)屬，葉部所得內(nèi)生細(xì)菌OTUs序列分屬13個(gè)門、23個(gè)綱、36個(gè)目、69個(gè)科、93個(gè)屬；根部所得內(nèi)生真菌OTUs序列分屬8個(gè)門、32個(gè)綱、88個(gè)目、195個(gè)科、332個(gè)屬，枝部所得內(nèi)生真菌OTUs序列分屬4個(gè)門、24個(gè)綱、85個(gè)目、123個(gè)科、163個(gè)屬，葉部所得內(nèi)生真菌OTUs序列分屬3個(gè)門、23個(gè)綱、79個(gè)目、139個(gè)科、213個(gè)屬。

由圖4可以看出，在門水平上，對(duì)相對(duì)豐度≥1% 的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，根部相對(duì)豐度較高的菌門依次為放線菌門(Actinobacteria，45.227%)、變形菌門(Proteobacteria，40.618%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3.091%)、酸桿菌門(Acidobacteria，2.593%)和Candidatus_Saccharibacteria(尚無統(tǒng)一的中文名，1.178%)；枝部相對(duì)豐度較高的菌門依次為變形菌門(42.063%)、放線菌門(12.329%)、擬桿菌門(4.503%)；葉部相對(duì)豐度較高的菌門依次為變形菌門(37.168%)、放線菌門(7.338%)和擬桿菌門(4.913%)。疣微桿菌門(Verrucomicrobia，0.123%)、衣原體門(Chlamydiae，0.020%)、Parcubacteria(尚無統(tǒng)一的中文名，0.007%)、Microgenomates(尚無統(tǒng)一的中文名，0.003%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.002%)、梭桿菌門(Fusobacteria，0.001%)、Spirochaetes(尚無統(tǒng)一的中文名，0.001%)是根部特有的菌門。由此可以看出，在門分類水平上，枝部、葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成更加相似，根部的最優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門，枝部、葉部的最優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，但變形菌門在根、枝、葉3個(gè)部位的相對(duì)豐度均大于35%。

由圖5可以看出，內(nèi)生真菌在根部、枝部、葉部相對(duì)豐度≥1%的菌為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidomycota)；根部、枝部、葉部最具優(yōu)勢(shì)的菌門均為子囊菌門(68.410%、64.500%、56.180%)，次優(yōu)勢(shì)門為擔(dān)子菌門(11.700%、0.581%、11.530%)。由此可見，枝部擔(dān)子菌門內(nèi)生真菌明顯少于根部、葉部。Olpidiomycota(0.034%)、被孢霉門(Mortierellomycota)(0.020%)、 壺菌門(Chytridiomycota)(0.014%)和隱真菌門(Rozellomycota)(0.001%)是根部特有的菌門。球囊菌門(Glomeromycota)只存在于枝部、根部。

2.3 蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生菌在屬水平上的組成和相對(duì)豐度

由圖6可知，在屬水平上，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)屬依次為鞘氨醇單胞菌(，5900)、類諾卡氏菌(，4.492%)、分直桿菌屬(，4003)、動(dòng)孢菌屬(，3422)、甲基桿菌屬(，3311)、大理石雕菌屬(，3063)、慢生型大豆根瘤菌(，2870)、弗萊德門菌屬(，2480)、不動(dòng)桿菌屬(，2303)、(1957)；枝部?jī)?nèi)生細(xì)菌相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)屬依次為不動(dòng)桿菌屬(9431)、甲基桿菌屬(7320)、鞘氨醇單胞菌(6221)、弗萊德門菌屬(4711)、(3944)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2845)、貪銅菌屬(，2337)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1670)、薄層菌屬(，1325)、微生物弧菌屬(，1059)；葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)屬依次為甲基桿菌屬(22174)、鞘氨醇單胞菌(7175)、薄層菌屬(，3430)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1227)、不動(dòng)桿菌屬(0654)、微生物弧菌屬(0326)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0280)、弗萊德門菌屬(0262)、貪銅菌屬(0212)、根瘤菌屬(，0149)。根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的特有屬最多，有187個(gè)，其中相對(duì)豐度≥1的是假諾卡氏菌屬(，1913)；枝部特有屬有5個(gè)，分別為(尚無統(tǒng)一的中文名，0006)、羅氏菌屬(，0006)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0004)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0004)、泛菌屬(，0004)；葉部特有屬有6個(gè)，分別為(尚無統(tǒng)一的中文名，0076)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0035)、叢毛單胞菌(，0005)、沙雷氏菌屬(，0005)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0003)、蜂窩囊菌屬(，0002)。另外，在根、枝、葉中還存在許多未歸類的細(xì)菌(相對(duì)豐度分別為35885、50185、59884)。

由圖7可知，在屬水平上，根部?jī)?nèi)生真菌相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)屬依次為亞隔孢殼屬(，7177)、枝孢屬(，5077)、(尚無統(tǒng)一的中文名，5001)、異莖點(diǎn)霉屬(，3983)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2888)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2757)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2171)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2003)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1849)、外瓶霉屬(，1752)；枝部?jī)?nèi)生真菌相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)屬依次為(11804)、橫斷孢屬(，2635)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0661)、鏈格孢屬(，0316)、拉奇枝孢霉(，0238)、擔(dān)孢酵母屬(，0221)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0210)、亞隔孢殼屬(，0182)、枝孢屬(，0181)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0147)；葉部?jī)?nèi)生真菌相對(duì)豐度排名前十的菌屬依次為殼針孢屬(，22783)、鏈格孢屬(6777)、枝孢屬(6109)、亞隔孢殼屬(，6103)、(尚無統(tǒng)一的中文名，3571)、(尚無統(tǒng)一的中文名，2728)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1432)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1196)、(尚無統(tǒng)一的中文名，1170)、隱球菌屬(，1137)。根部?jī)?nèi)生真菌特有屬最多，有121個(gè)，其中相對(duì)豐度≥005的屬依次為根念珠屬(，0145)、卡普龍屬(，0115)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0106)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0093)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0081)、木霉屬(，0064)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0063)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0062)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0055)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0052)；枝部特有屬有7個(gè)，其中相對(duì)豐度≥0001的依次為(尚無統(tǒng)一的中文名，0007)、高氏白粉菌屬(，0001)；葉部特有屬有35個(gè)，其中相對(duì)豐度≥001的屬依次為假尾孢屬(，0025)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0017)、(尚無統(tǒng)一的中文名，0013)。另外，在根、枝、葉中還存在許多未歸類的真菌(相對(duì)豐度分別為41031、82036、39467)。

2.4 功能預(yù)測(cè)分析

為了探究蘋果砧木T337不同組織部位內(nèi)生菌群的功能，本研究基于16S rRNA和ITS序列，采用PICRUSt2軟件對(duì)內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，從內(nèi)生細(xì)菌中共預(yù)測(cè)到417個(gè)MetaCyc代謝通路，其中在植株不同部位間二級(jí)功能通路差異顯著的有35個(gè)通路(<0.05)；從內(nèi)生真菌中共預(yù)測(cè)到73個(gè)MetaCyc代謝通路，其中在不同組織部位間二級(jí)功能通路差異顯著的有19個(gè)通路(<0.05)。內(nèi)生菌群的預(yù)測(cè)功能分別隸屬于生物合成、降解/利用/同化、前體代謝產(chǎn)物和能量的產(chǎn)生、聚糖途徑、其他代謝共5個(gè)方面(表3、表4)。

進(jìn)一步分析內(nèi)生細(xì)菌的功能發(fā)現(xiàn)，生物合成通路的相對(duì)豐度總體上高于其他通路，其中氨基酸合成通路的相對(duì)豐度最高，達(dá)到10%左右，其次為輔助因子、維生素合成通路的相對(duì)豐度，均達(dá)8%以上。內(nèi)生細(xì)菌的氨基酸生物合成、芳香族化合物合成、核苷酸合成、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成及細(xì)胞結(jié)構(gòu)合成等通路的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為葉部、枝部顯著高于根部，而枝部和葉部間無顯著差異。反之，上述生物大分子的分解反應(yīng)對(duì)應(yīng)的二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度表現(xiàn)為根部顯著高于葉部、枝部。在分解反應(yīng)方面，無機(jī)鹽、高分子化合物降解等二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度表現(xiàn)為枝部、葉部顯著高于根部。在碳水化合物生物合成和降解功能方面，相對(duì)豐度均表現(xiàn)為葉部、枝部顯著高于根部。在能量代謝方面，發(fā)酵、糖酵解、無糖磷酸化、光合作用和呼吸作用等二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度表現(xiàn)為枝部、葉部顯著高于根部。異丙醇和甲基酮的合成、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)等二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度則表現(xiàn)為根部顯著高于枝部、葉部。嘧啶脫氧核糖核苷酸磷酸化的二級(jí)功能通路表現(xiàn)為枝部、葉部顯著高于根部，其合成功能的相對(duì)豐度則是根部顯著大于枝部、葉部(表3)。

表3 不同部位內(nèi)生細(xì)菌預(yù)測(cè)的MetaCyc二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度

對(duì)蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生真菌群落功能的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，大多數(shù)代謝通路的相對(duì)豐度在葉部和根部間存在顯著差異。內(nèi)生真菌核苷酸合成二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度最高，達(dá)到44%左右，其次為脂肪酸和脂質(zhì)的合成二級(jí)功能通路，其相對(duì)豐度達(dá)28%左右。在生物合成方面，內(nèi)生真菌的碳水化合物生物合成、核苷酸合成等二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度表現(xiàn)為葉部顯著高于根部。在輔助因子和維生素的合成及脂肪酸、脂質(zhì)的合成二級(jí)功能通路上，相對(duì)豐度則表現(xiàn)為根部、枝部顯著高于葉部。但內(nèi)生真菌相應(yīng)的氨基酸降解、脂肪酸和脂質(zhì)降解、核苷酸降解等分解反應(yīng)二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度也同樣表現(xiàn)為葉部最高，這與內(nèi)生細(xì)菌的功能預(yù)測(cè)規(guī)律不同。在能量代謝方面，甲基酮生物合成及呼吸作用等二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度仍以葉部最高。在磷脂酶代謝及嘧啶脫氧核糖核苷酸磷酸化等二級(jí)功能通路上的相對(duì)豐度則是根部、枝部顯著高于葉部(表4)。

表4 不同部位內(nèi)生真菌預(yù)測(cè)的MetaCyc二級(jí)功能通路的相對(duì)豐度

3 討論

微生物與植物相互依存的狀態(tài)被認(rèn)為是植物在自然界的真實(shí)存在狀態(tài)，植物內(nèi)生菌在生態(tài)作用上對(duì)宿主植物十分有利，并在此過程中形成了地域特異性、宿主保守性及組織專一性等適應(yīng)性特點(diǎn)。在植物不同組織間內(nèi)生菌多樣性的研究中，有研究認(rèn)為， 內(nèi)生菌在植物地下部分的豐度高于地上部分，而地上部分的種類要多于地下部分。也有研究認(rèn)為，植物組織內(nèi)生菌多樣性在不同宿主植物間并不具有一致性。本研究利用高通量測(cè)序方法分析了蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生菌的多樣性，結(jié)果表明，蘋果砧木T337根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的豐富度、多樣性都顯著高于枝部、葉部，內(nèi)生真菌的則表現(xiàn)出根>葉>枝。對(duì)巨菌草、牛至及水稻的研究也發(fā)現(xiàn)，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性均高于其他組織。翅堿蓬根中內(nèi)生真菌群落的多樣性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于枝和葉。上述研究結(jié)果表明，內(nèi)生微生物在地下部分有更高的多樣性和豐富度，這與植物內(nèi)生菌的來源息息相關(guān)，植物內(nèi)生菌大部分來源于根際土壤微生物，后經(jīng)根系運(yùn)輸?shù)街仓昶渌课?，但大氣中的微生物也參與了內(nèi)生細(xì)菌種群的構(gòu)建。

放線菌門、變形菌門和擬桿菌門是蘋果砧木T337根部、枝部和葉部的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，其中放線菌門在蘋果砧木T337根部樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物內(nèi)生細(xì)菌的最優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，如番茄、黑果枸杞、牡丹、玉米、小麥等植物內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門均為變形菌門。但放線菌門在龍膽草等多種植物根際土壤中為最優(yōu)菌門。變形菌門是蘋果砧木T337枝部、葉部的最優(yōu)菌門，在根部該菌門雖然不是最優(yōu)菌門，但其相對(duì)豐度并不亞于枝部、葉部。變形菌門細(xì)菌可被用來促進(jìn)氮肥的利用。Lupatini等研究發(fā)現(xiàn)，放線菌門細(xì)菌不但與磷酸鹽、磷酸鹽代謝相關(guān)，還可以產(chǎn)生農(nóng)用抗生素、維生素，這暗示著開發(fā)蘋果氮、磷吸收內(nèi)生菌的潛力部位為蘋果根部。疣微桿菌門只存在于T337根部，同時(shí)也是巨菌草根部的特有菌門。

蘋果砧木T337內(nèi)生細(xì)菌屬水平的分析結(jié)果顯示，不同部位優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度存在顯著差異。鞘氨醇單胞菌屬為根部最優(yōu)菌屬，研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬也是玉米根部的最優(yōu)屬，在其他作物中雖然不是最優(yōu)屬，但是也會(huì)有益于植物生長(zhǎng)。Khan等從非洲山毛豆葉片中分離的sp. LK11可以產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(IAA)，從而增加植物生物量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。不動(dòng)桿菌屬為枝部的最優(yōu)屬，且廣泛分布于植物中。Shi等從甜菜根部分離出的約氏不動(dòng)桿菌可以促進(jìn)土壤中微量元素的吸收，還可以產(chǎn)生生長(zhǎng)素、溶解磷酸鹽，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。且不動(dòng)桿菌屬在林木宿主中被鑒定到的頻率高于農(nóng)作物。甲基桿菌屬是葉部的最優(yōu)勢(shì)屬，且在內(nèi)生細(xì)菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。甲基桿菌屬也是林木楊樹和柳樹葉、枝條的優(yōu)勢(shì)屬，且作為甲基細(xì)菌可以在光合作用中為植物提供碳源，并誘導(dǎo)更高的光合作用活性。甲基桿菌屬為自生固氮微生物，能參與植物的固氮，葉片中內(nèi)生細(xì)菌可以通過固定大氣中的氮或者保護(hù)植物免受病原菌的感染等機(jī)制影響植物生產(chǎn)力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。假諾卡氏菌屬為植物根部特有菌屬，麻瘋樹根部也存在假諾卡氏菌屬細(xì)菌，前人研究發(fā)現(xiàn)，假諾卡氏菌屬微生物主要與纖維素降解、抗生素合成有關(guān)，纖維素酶可以降解細(xì)胞壁，使植物根部和根際的微生物發(fā)生交換，且根系分泌物可以調(diào)節(jié)土壤通透性，從而間接地調(diào)節(jié)土壤對(duì)水分、溫度的需求，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)，根系分泌物還可以產(chǎn)生一些重要的酶類和維生素，為植物提供營(yíng)養(yǎng)。動(dòng)孢菌屬、只存在于根部、枝部，但豐度較小，具體生物學(xué)功能還有待研究。動(dòng)孢菌屬是雷公藤枝部的優(yōu)勢(shì)屬，研究發(fā)現(xiàn)，在三七地上部分的豐度高于地下部分，但是在蘋果砧木T337的地上部位葉片中不存在。在以往的研究中，研究者從玉米、甘蔗、鐵皮石斛、莽椒組織中都會(huì)分離到假單胞菌屬()，且為優(yōu)勢(shì)屬，但在蘋果T337中，卻不是優(yōu)勢(shì)屬。由此可見，內(nèi)生菌群落組成不僅由組織部位決定，而且可以通過植物-微生物組共同進(jìn)化來解釋。根瘤菌屬為葉部樣品的優(yōu)勢(shì)屬，它廣泛存在于豆科植物中，可以與植物共生并且具有固氮功能。

子囊菌門和擔(dān)子菌門是蘋果砧木T337根部、枝部和葉部的優(yōu)勢(shì)真菌門，且Ascomycota在根部、枝部和葉部中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。另外，擔(dān)子菌門在根部、葉部的相對(duì)豐度也較高?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，多數(shù)植物的最優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌為子囊菌門。Olpidiomycota、被孢霉門、隱真菌門和壺菌門是蘋果砧木T337根部的特有菌門。Rozellomycota在許多根際土壤中已有報(bào)道，例如茶樹根際土壤。由于植物-內(nèi)微生物-土壤微生物的相互作用，大多數(shù)內(nèi)生菌來源于土壤微生物，這可能是導(dǎo)致根部特有門多于枝部、葉部的原因。蘋果砧木T337內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬種類和豐度隨部位不同差異較明顯。內(nèi)生真菌根部最優(yōu)屬為，該屬真菌可以分離獲得很多化合物，且對(duì)我國醫(yī)療研究的發(fā)展具有很重要的作用；枝部最優(yōu)屬為，也是具柄重樓的優(yōu)勢(shì)屬，但不是最優(yōu)屬，葉部最優(yōu)屬為殼針孢屬，且在蘋果砧木337內(nèi)生真菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，廣泛存在于植物葉片中，在T337中是否存在生物學(xué)功能還有待研究。除了關(guān)注不同部位內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬外，特有的豐度較低的屬也在整個(gè)微生物組中扮演著重要角色。Harrison等研究發(fā)現(xiàn)，稀有內(nèi)生菌會(huì)影響宿主大小、葉面積、葉片氮含量等，因此微生物組中豐度較小的內(nèi)生菌也是不能忽視的。蘋果砧木T337根部、枝部、葉部存在大量豐度較小的特有屬，其中木霉屬是蘋果砧木T337根部的特有屬，該屬同樣在杜鵑蘭根部被檢測(cè)到。賀字典等研究發(fā)現(xiàn)，木霉屬不但可以拮抗多種植物病原菌，且可以促進(jìn)辣椒根際土壤難溶性磷轉(zhuǎn)化成速效性磷，從而促進(jìn)辣椒植株生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。T337根部、枝部、葉部樣品中都存在一定比例的植物病原菌屬，尤其是葉部，這些真菌可能以條件性潛伏狀態(tài)存在于植物組織中，也可能是有其他生物學(xué)功能，有待進(jìn)一步研究證明。值得注意的是，蘋果內(nèi)生細(xì)菌和真菌中存在大量不能歸類的序列，其中葉部未歸類的內(nèi)生細(xì)菌最多，占比大于50%，枝部未歸類的內(nèi)生真菌最多，占比達(dá)到80%；暗示著相應(yīng)部位可能存在大量新類群。這也說明植物內(nèi)生菌在研究方法上尚有很大的改進(jìn)空間，研究者需從多方面進(jìn)行改進(jìn)，如多重16S rDNA測(cè)序、內(nèi)生微生物的富集等。

PICRUSt軟件是由美國哈佛大學(xué)的Curtis Huttenhower課題組開發(fā)的菌群代謝功能預(yù)測(cè)工具，通過將現(xiàn)有的基因測(cè)序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫相對(duì)比，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物代謝功能的預(yù)測(cè)。近年來，升級(jí)后的PICRUSt2功能預(yù)測(cè)的結(jié)果相比于PICRUSt更接近宏基因組的結(jié)果，從而提升了功能預(yù)測(cè)的精確度。且目前PICRUSt2輸出的主要高水平預(yù)測(cè)為MetaCyc數(shù)據(jù)庫通路。雖然PICRUSt2預(yù)測(cè)偏向于現(xiàn)有的參考基因，罕見的特定功能不太可能被識(shí)別出來，但是隨著高質(zhì)量可用基因數(shù)量的持續(xù)增加，這個(gè)限制對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的影響也會(huì)逐漸減少。PICRUSt功能預(yù)測(cè)已經(jīng)被應(yīng)用在番茄和黑果枸杞等植物上，且可以采用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)內(nèi)生微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，古麗尼沙·沙依木等基于FAPROTAX數(shù)據(jù)庫對(duì)不同品種蘋果植株內(nèi)生微生物功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。本研究選用MetaCyc數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，因?yàn)镸etaCyc包含比KEGG更廣泛的數(shù)據(jù)庫屬性集，包括從化合物到其所調(diào)節(jié)的酶的關(guān)系、自發(fā)反應(yīng)的識(shí)別及預(yù)期的代謝途徑分類范圍等。

本研究通過PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析不同部位蘋果砧木T337的功能差異，益生功能信息的合成功能表現(xiàn)為葉部、枝部的相對(duì)豐度顯著高于根部，相應(yīng)的生物大分子的分解功能則表現(xiàn)為根部的相對(duì)豐度顯著高于枝部、葉部。前人研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞根、莖、葉和果內(nèi)生細(xì)菌基因中包含氨基酸類、脂類、維生素、多糖、萜類和酮類及其他次生代謝產(chǎn)物等與植物成分生物合成有關(guān)的通路。蘋果T337也包含氨基酸、脂類、次級(jí)代謝產(chǎn)物等的合成通路。通過基因功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，莽椒、鮮廣椒中內(nèi)生細(xì)菌的碳水化合物運(yùn)輸與代謝功能相對(duì)較強(qiáng)，而蘋果T337內(nèi)生細(xì)菌的氨基酸代謝功能是最強(qiáng)的，其次是輔助因子、維生素的合成。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，牡丹葉片中內(nèi)生細(xì)菌光合作用豐度顯著高于根組織，此結(jié)論與蘋果T337的結(jié)果一致。植物的葉片主要是進(jìn)行光合作用，相應(yīng)的，葉部的內(nèi)生細(xì)菌也是合成功能、光合作用功能的相對(duì)豐度更高。植物根為植物提供營(yíng)養(yǎng)元素，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的分解功能的相對(duì)豐度較高。上述結(jié)論佐證了植物內(nèi)生細(xì)菌與植物組織間相輔相成的功能關(guān)系，因此對(duì)蘋果砧木T337不同部位內(nèi)生微生物組的研究為今后內(nèi)生微生物與植物的互作研究和植物健康有益微生物的篩選提供了參考。

4 結(jié)論

不同部位蘋果砧木T337都具有豐富的內(nèi)生菌資源。在根部、枝部、葉部3個(gè)組織部位中，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌物種豐富度、多樣性最高，枝部最低；在群落組成上，T337根部?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門為放線菌門，枝部、葉部為變形菌門；優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門在3個(gè)組織部位相同，均為子囊菌門；在屬水平上，3個(gè)組織部位內(nèi)生微生物都各有不同的優(yōu)勢(shì)菌屬。無論是內(nèi)生細(xì)菌還是內(nèi)生真菌，特有菌屬均為根部組織最多。在內(nèi)生菌中，未歸類的細(xì)菌葉部最多，未歸類的真菌枝部最多。功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌分解功能在根部樣品中顯著高于枝部、葉部，合成功能則相反；內(nèi)生細(xì)菌更多地參與氨基酸的生物合成，內(nèi)生真菌更多地參與核苷酸的生物合成。