肖長長 羅丹 陳少英 胡志輝 劉蘭霞 駱九源 蘇小玲 張俊愛

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是自身免疫介導(dǎo)的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。其特征是自身抗體產(chǎn)生的抗核和/或細(xì)胞質(zhì)抗原增加,免疫復(fù)合物沉積在各個器官的微血管中,補(bǔ)體激活和整合,白細(xì)胞在多個器官中浸潤,以及各種類型的組織損傷［1-3］。50%～70%的SLE患者病程中會出現(xiàn)臨床腎臟受累,腎活檢顯示幾乎所有SLE均有腎臟病理學(xué)改變。LN對SLE預(yù)后影響甚大,腎功能衰竭是SLE的主要死亡原因之一［4］。B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞都參與狼瘡發(fā)?。?］。目前臨床上仍以激素聯(lián)合免疫抑制劑為主要的治療方案,但其治療有顯著的副作用,且仍有部分患者對傳統(tǒng)的方案不敏感,這類患者極易發(fā)展為多器官功能衰竭、終末期腎臟?。?］。因此,深入研究LN的發(fā)病免疫機(jī)制,尋找理想的LN治療靶點(diǎn)具有重要意義。B7-H4是最近發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員,屬共抑制分子,在正常組織中及細(xì)胞中有大量信使核糖核酸(mRNA)表達(dá),但是蛋白質(zhì)水平的表達(dá)較低,而在腫瘤細(xì)胞中,B7-H4 在mRNA 水平以及蛋白水平中均高表達(dá),可以通過抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌對T細(xì)胞的免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)性調(diào)控［7］。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)是參與固有免疫、啟動和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫最重要的細(xì)胞之一,是唯一能活化Naive T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)。最近研究證明,DC在LN中起著關(guān)鍵作用［8］。B7-H4介導(dǎo)的信號途徑對T、B細(xì)胞活化起負(fù)調(diào)節(jié)作用,可在DC細(xì)胞上誘導(dǎo)性表達(dá),其作用及機(jī)制尚不明確。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs) 最先是因其控制自身抗原的免疫反應(yīng)能力而被識別的,它保持自身免疫穩(wěn)定和防止自身免疫發(fā)生,Liu等［9］發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)。據(jù)此作者推測,在抗原及炎癥因子長期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC細(xì)胞下調(diào),B7-H4+DC細(xì)胞促進(jìn)NaiveT細(xì)胞向Tregs的分化減少,Tregs減少導(dǎo)致LN持續(xù)炎癥反應(yīng)過強(qiáng)。本項(xiàng)目中檢測B7-H4在外周血DC中的表達(dá),分析B7-H4+DC與Tregs的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年5～12月在本院腎內(nèi)風(fēng)濕免疫科門診及住院確診的LN患者50例作為實(shí)驗(yàn)組,所有病例均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA) 修訂的LN診斷標(biāo)準(zhǔn),同時排除合并嚴(yán)重感染和患有腫瘤的患者,其中男5例,女45例；年齡22～46歲,平均年齡(34.2±12.3)歲。根據(jù)患者的SLE疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)評估結(jié)果分為活動期組(SLE疾病活動指數(shù)積分≥10分,30例)和靜止期組(SLE疾病活動指數(shù)積分＜9分,20例)。經(jīng)治療目前無臨床癥狀或有微量蛋白尿,但無進(jìn)展,實(shí)驗(yàn)室檢查無顯著異常,抗ds-DNA抗體轉(zhuǎn)陰或抗核抗體滴度很低。另選擇同期在本院健康體檢者45例作為健康對照組,其中男5例,女40例；年齡24～46歲,平均年齡(34.5±10.5)歲。實(shí)驗(yàn)組和健康對照組的性別和年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：既往無系統(tǒng)性紅斑狼瘡及嚴(yán)重慢性疾病病史,近期無使用糖皮質(zhì)激素,血常規(guī)、肝腎功能、免疫相關(guān)指標(biāo)正常。本研究經(jīng)東莞市厚街醫(yī)院的批準(zhǔn),并征得研究對象的知情同意,實(shí)驗(yàn)在廣東醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 FITC標(biāo)記CD4、PE標(biāo)記CD25、Alexa Fluor標(biāo)記CD127。上述試劑盒及CBA試劑盒、淋巴分離液、Buffer液等均購自美國BD公司；FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀型號為BD公司產(chǎn)品。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 檢測B7-H4+DC細(xì)胞及Treg,采集患者和健康對照組外周血,采用密度梯度離心獲外周血單個核細(xì)胞(PBMC),然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC中B7-H4表達(dá)情況及Tregs的數(shù)量。CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞的檢測具體操作詳見參考文獻(xiàn)［10,11］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析；定性計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血DC中B7-H4表達(dá)情況比較 活動期組外周血DC中B7-H4表達(dá)水平低于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；靜止期組外周血DC中B7-H4表達(dá)水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組外周血DC中B7-H4表達(dá)情況比較(n)

2.2 活動期組B7-H4表達(dá)與CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,狼瘡活動期組B7-H4表達(dá)水平與CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.611,P＜0.05)。見表2。

表2 狼瘡活動期組B7-H4、CD4+CD25+CD127lo T細(xì)胞的相關(guān)性(n)

3 討論

B7-H4又名B7S1,B7x,是新近發(fā)現(xiàn)的B7新家族成員,屬共抑制分子。其mRNA在外周組織中分布廣泛,但其蛋白質(zhì)僅在造血細(xì)胞表面呈誘導(dǎo)性表達(dá),主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞和活化的T細(xì)胞表面。B7-H4在外周組織細(xì)胞中介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起負(fù)調(diào)節(jié)作用,其所介導(dǎo)的信號途徑可抑制T細(xì)胞的增殖和白細(xì)胞介素(IL)-2的分泌,阻滯T細(xì)胞的細(xì)胞周期,還可抑制中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞的功能［12］。有研究［13］發(fā)現(xiàn),B7-H4抗原表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中,LN患者B7-H4 陽性腎小管數(shù)明顯低于對照人群,并且和腎臟組織中的腎小管間質(zhì)損害積分明顯負(fù)相關(guān)。LN患者sB7-H4含量與正常對照和無腎炎的 SLE 患者無明顯差異,但其和SLE-DAI明顯正相關(guān),LN高度活動組明顯高于中度活動組。同時有實(shí)驗(yàn)表明,B7-H4缺乏癥也加劇了LN小鼠模型淋巴組織腫脹和腎臟病變［14］。用B7-H4拮抗劑抗體治療也加重了狼瘡模型,相反,B7-H4 Ig減輕了狼瘡的表現(xiàn)［15］。這些證據(jù)均表明B7-H4在LN的發(fā)病過程中起著重要的作用。

DC主要參與機(jī)體的免疫功能,在LN中起著關(guān)鍵作用。B7-H4介導(dǎo)的過程對T、B細(xì)胞主要是起負(fù)性調(diào)節(jié),可在DC細(xì)胞上誘導(dǎo)性表達(dá)。DC在LN發(fā)展和進(jìn)步中的作用：目前尚不確定LN中免疫應(yīng)答和免疫耐受平衡是如何被打破的,但DCs被認(rèn)為在LN中起著關(guān)鍵作用［16］。①LN患者血清、淋巴結(jié)和炎癥組織(如皮膚和腎臟)中發(fā)現(xiàn)高水平的凋亡細(xì)胞,這些調(diào)亡細(xì)胞的自身RNA和DNA與pDCs的Toll樣受體第9型(TLR9)或Toll樣受體第7型(TLR7)［17,18］的結(jié)合,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN)的持續(xù)輸出。DCs產(chǎn)生的IFN以自分泌的方式促進(jìn)自身的活化和成熟,包括IFN的輸出增加,CD80、CD86和MHCⅡ類的表面表達(dá)增加,使其更善于激活T細(xì)胞。DC細(xì)胞功能異常：HN患者中 pDC刺激T細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng)。②同時發(fā)現(xiàn)LN患者 pDCs在加入凋亡的PMNs后沒能誘導(dǎo)出調(diào)節(jié)性T調(diào)節(jié)的細(xì)胞特征(Foxp3表達(dá)),而健康者能誘導(dǎo)表達(dá)FoxP3。③SLE供體的未成熟DC和成熟DC均表達(dá)較高水平的CCR7、CD40和CD86,并誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞增殖；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者DCs的異常行為是由內(nèi)在缺陷引起的,是由其在炎癥環(huán)境中的發(fā)展引起的,還是兩者的結(jié)合引起的目前尚不清楚?；赟LE中觀察到的DCs功能的失調(diào)以及DCs在SLE發(fā)病機(jī)制的啟動和持續(xù)中的作用的新證據(jù),深入探討DC在LN發(fā)病中作用及其機(jī)制,對探尋LN治療的靶點(diǎn)具有重要意義。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞又名抑制性T細(xì)胞,是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群,可通過負(fù)向調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行維持自身免疫穩(wěn)態(tài)。其不但維持自身和外來抗原的免疫耐受,在自身免疫學(xué)疾病、腫瘤、感染性疾?。?9］等也發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可分泌多種抑制性細(xì)胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-35等,還下調(diào)APC細(xì)胞的功能或競爭APC細(xì)胞上的共刺激分子進(jìn)行抑制效應(yīng)性T細(xì)胞［20］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個亞群,通過抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞維持自我耐受；具有免疫抑制功能,其數(shù)量的減少和功能的減弱可能參與了LN的發(fā)生,因此,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺陷或缺乏調(diào)節(jié)性T細(xì)胞被認(rèn)為是SLE發(fā)病機(jī)制的一部分［14］。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)。

B7-H4在自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用,最新研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠敲除B7-H4基因或使用抗B7-H4抗體封閉內(nèi)源性B7-H4表達(dá)后出現(xiàn)大量抗dsDNA 抗體產(chǎn)生、腎臟病變進(jìn)展,然而使用B7-H4Ig可以減輕狼瘡樣癥狀。據(jù)此作者推測,在抗原及炎癥因子長期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC細(xì)胞下調(diào),B7-H4+DC細(xì)胞促進(jìn)Naive T細(xì)胞向Tregs的分化減少,Tregs減少導(dǎo)致LN持續(xù)炎癥反應(yīng)過強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn),活動期組外周血DC中B7-H4表達(dá)水平低于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；靜止期組外周血DC中B7-H4表達(dá)水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,狼瘡活動期組B7-H4表達(dá)水平與CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.611,P＜0.05)。這一結(jié)果與鄭京等［21］的研究是一致的。B細(xì)胞的激活有兩條主要途徑：①經(jīng)典激活途徑：T細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體；②在無T細(xì)胞的輔助下,DC通過和B細(xì)胞的受體相結(jié)合,使得B細(xì)胞活化。B細(xì)胞的異常活化,自身免疫耐受性降低,直接針對自體抗原產(chǎn)生大量的自身抗體,造成器官和組織的損傷,構(gòu)成了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病基礎(chǔ)。作者推測,狼瘡活動期組患者B細(xì)胞活化,在此發(fā)病基礎(chǔ)上,CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞凋亡增多,因此循環(huán)的CD4+CD25+CD127loT細(xì)胞絕對數(shù)量也減少。因此,臨床工作中,可通過干預(yù)DCs或提高Tregs的水平治療和改善LN患者的病程。

綜上所述,B7-H4在活動期LN患者外周血中低表達(dá),而且與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),可作為狼瘡活動性的指標(biāo),可能成為LN了解其免疫狀態(tài)、生物靶點(diǎn)治療的重要依據(jù)。