陳嘉彤 金鼎 杜旸 王雪松

吸煙的人群常常面臨許多困擾,人們生活中常見的例如：口腔異味、牙面煙斑煙漬等。然而現(xiàn)代研究明確證實,吸煙后口腔清潔不凈產(chǎn)生的煙斑可加重牙周疾病。吸煙也會促進口腔中白色念珠菌從芽孢到菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)變,從而加重口腔念珠菌病的程度［1］。吸煙量與口腔白斑的關系緊密,是口腔癌發(fā)病的高危因素。中國疾控中心也發(fā)布過,嬰幼兒4個月暴露于二手煙環(huán)境中,會增加齲齒患病的風險。另外,吸煙對嬰幼兒唇腭裂的發(fā)生、吸煙者齲病的發(fā)病、種植牙能否長期成功等問題都有緊密的聯(lián)系［2-4］。有一些研究也證實,有長期吸煙史的患者比無吸煙史者更易有口腔科的相關疾?。?,6］。每支香煙經(jīng)過燃燒可產(chǎn)生上千余種化合物,而口腔是人體眾多器官中最早接觸到煙草煙霧的,從前大多數(shù)研究報告中報道過尼古丁對HGF有不利影響,而在此次實驗研究中作者保全完整的煙草煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE),充分檢測其中的完整成分進行實驗。此次通過體外傳代培育人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblast,HGF),并用CSE作用于細胞上,從而觀察煙草煙霧對HGF增殖的影響。通過觀察CSE影響HGF傳代增殖討論CSE對于牙周病愈合過程中產(chǎn)生的不利影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 煙草(盒式香煙)；DMSO(二甲基亞砜,Sigma公司)；四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,Sigma 公司)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；胰蛋白酶(Gibco)；抗波形絲蛋白和抗角蛋白抗體(邁新公司,河南),CO2細胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司,德國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Spectra Ⅲ,奧地利)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；人骨保護蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海瑞齊生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織塊法原代培養(yǎng)HGF［7］收集健康成人因種植修復牙齦成形術棄除的健康無炎癥牙齦組織,分成大小約1 mm的組織塊,并用含胎牛血清(FBS)的DMEM確保組織塊不干燥,取得的牙齦組織塊單層鋪于25 ml大小的細胞培養(yǎng)瓶中,隨后將其翻轉(zhuǎn)加入含15%FBS的培養(yǎng)基10 ml,置5%濃度CO2細胞培養(yǎng)箱中保持37℃約2 h,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶接著培養(yǎng)［8］。每間隔5 d察看牙齦成纖維細胞繁育狀況。若細胞生長后次日更換培養(yǎng)基,細胞繁育達瓶底一半后可加入0.25%的胰酶進行消散,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)若HGF由長梭形轉(zhuǎn)變成圓球狀時,馬上棄除胰蛋白酶,重新加含15%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培育,當細胞覆蓋瓶底3/5后再進行第1次傳代,當細胞形成單層后再次傳代(為1∶2)。

1.2.2 HGF形態(tài)觀察 HGF培養(yǎng)到第5天,顯微鏡下可見：有少許長梭形細胞由組織塊周圍放射狀離散出來,漸漸成暈狀。牙齦成纖維細胞呈現(xiàn)長梭形或者放射星形,細胞胞漿豐滿,有2～4個不等的胞漿突,細胞核大多為一個且為橢圓形,細胞緊貼培養(yǎng)瓶壁爬行生長。細胞較少密度低時細胞間呈網(wǎng)狀,細胞密度高時則排成旋渦狀或者呈束(見圖1)。

圖1 HGF細胞形態(tài)(×100)

1.2.3 傳代細胞來源鑒定 選取第4代培養(yǎng)細胞至于載玻片上作為細胞的來源鑒定,采用丙酮溶液固定,吹干,用進行抗波形絲蛋白(1∶100)及細胞抗角蛋白(1∶100)免疫組化染色。顯示抗波形絲蛋白染色陽性,抗細胞角蛋白染色陰性,從而判定傳代的細胞來自中胚層(圖2,圖3)。

圖2 抗角蛋白陰性表達(×400)

圖3 抗波形蛋白陽性表達(×400)

1.2.4 CSE 依據(jù)Oltmanm方法,燃燒一根香煙,過濾嘴的一側(cè)運用纖維過濾器連接到橡膠導管上,導管的另一側(cè)接含10 ml培養(yǎng)基的有塞試管,同時在試管塞接50 ml注射器抽吸CSE,8次,50 ml/次,用時30 s,隨后去除過濾端。將總400 ml煙霧試管放置2 h,用濃度1 mol/L的氫氧化鈉將其酸堿值調(diào)至中性,用纖維濾膜過濾從而得到純的煙霧提取物原液,將原液按照2.5%、5.0%、10.0%、20.0%的濃度比例稀釋成實驗用液,并在0.5 h內(nèi)應用于本實驗。

1.2.5 CSE對HGF增殖的影響 用第5代的健康細胞,含3×104/ml的細胞培養(yǎng)基接種于各96孔板內(nèi),各組8孔共計5組,100 μl/孔。細胞培養(yǎng)箱中用含15%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,再更換為10%FBS的培養(yǎng)液,加入稀釋成不同濃度梯度的CSE,使其最終濃度依次為2.5%、5.0%、10.0%、20.0%,空白對照。培養(yǎng)5 d后,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl,4 h后終止培養(yǎng),移棄孔內(nèi)液體,加入150 μl二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶物15 min,酶聯(lián)免疫儀檢測490 nm的OD值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

作用24、48、72 h時,空白對照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐漸降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白對照,差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。見表1。

表1 CSE對HGF增殖的影響()

表1 CSE對HGF增殖的影響()

注：與空白對照比較,aP＜0.05

3 討論

本實驗結(jié)果顯示：HGF被不同濃度(2.5%、5.0%、10.0%、20.0%)CSE的培養(yǎng)液作用,其細胞增殖受到明顯抑制,空白對照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐漸降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白對照,差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),且細胞增殖的抑制作用隨CSE濃度的升高明顯增強。當CSE濃度達到20.0%以上時,實驗受到CSE中色素成分的干擾無法準確進行。但實驗中證實,CSE能夠抑制HGF的增殖,抑制了骨保護蛋白的表達,從而影響HGF的數(shù)目甚至功能。

Tipton等［9］曾經(jīng)提出過,煙草中的尼古丁可以明顯的使HGF增殖受到抑制,當尼古丁的濃度達到0.05%的時候,會抑制細胞產(chǎn)生纖維連接蛋白以及Ⅰ型膠原；煙冷凝物能夠通過影響金屬基質(zhì)蛋白酶從而增加HGF中Ⅰ型膠原的降解［10］；Eduardo等［11］提出煙草中的有害成分可阻止HGF對無病變牙根以及玻璃的粘附；煙草燃燒產(chǎn)物里面的有害物通過對細胞的附著、增殖、分泌等過程產(chǎn)生干預［12］；Cattaneo等［13］研究認為,燃燒的煙草會散發(fā)出丙稀等物質(zhì),通過影響細胞的附著和增殖抑制其在體外培養(yǎng)的過程。β1-integrin是HGF粘附因子之一,暴露于香煙煙霧中會抑制β1整合素的產(chǎn)生從而影響牙齦成纖維細胞的粘附［14］。高濃度的煙草冷凝物還會通過抑制細胞白介素6和8的分泌從而改變牙齦成纖維細胞生長周期,抑制其生長［15］。本實驗與上述研究結(jié)果一致,可能是由于CSE會通過影響HFG生長使其失去粘附力；HGF的細胞蛋白質(zhì)合成能力減弱；進而影響牙齦細胞的附著；并且HGF對膠原纖維束的調(diào)節(jié)能力遭到破壞,給外界有害侵犯物質(zhì)以可乘之機；通過使底物表面產(chǎn)生電荷變化,從而使HGF的粘附得到干擾；細胞自身吞噬功能減弱,使得不良的膠原纖維不能有效的被排出,牙周支持織不能及時有效恢復,說明了吸煙不但使牙周病繼續(xù)進展［16］,更不利于牙周治療,不利于治療創(chuàng)傷的恢復［17］,提示其在牙周病病理中的作用。

研究表明,吸煙可能通過對牙齦膠原纖維及牙齦成纖維細胞產(chǎn)生的損傷,使牙齒周圍支持組織的自我修復能力減弱。吸煙也可以通過促進牙周袋內(nèi)壁上皮細胞產(chǎn)生過角化,從而阻止結(jié)合上皮的重新附著,使牙周袋更深;牙周支持組織部分血供減少,進而使得自身修復力及防御力均降低［18］?？偨Y(jié)過去他人和本次的研究發(fā)現(xiàn),煙草煙霧提取液對牙周病病情的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生了十分重要的影響,本實驗中高濃度CSE對HGF增殖起到顯著的抑制作用。因此,煙草與牙周病的相關作用的具體機制仍需進一步研究。