許曉晴，陳燁，甄毓，米鐵柱，李晶，劉昌嶺

1.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，青島 266100

2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，青島 266237

3.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100

4.中國地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所，青島 266237

甲烷是大氣中含量最豐富的碳?xì)浠衔?，可通過一系列復(fù)雜的氧化反應(yīng)影響大氣化學(xué)；同時，它也是重要的溫室氣體，100年內(nèi)溫室效應(yīng)是二氧化碳的28倍，對全球變暖起著重要作用[1-2]。地球上大部分甲烷來源于微生物產(chǎn)甲烷作用，即通過環(huán)境中有機質(zhì)厭氧發(fā)酵的最終途徑產(chǎn)生。微生物介導(dǎo)的甲烷生成是地球上最大的甲烷來源，長期以來一直被認(rèn)為是碳匯和生態(tài)碳流動的第一步。產(chǎn)甲烷菌廣泛分布于海洋沉積物、淡水沉積物、水稻田土壤、動物胃腸道、地礦及地?zé)岘h(huán)境中[3-4]。目前已知的產(chǎn)甲烷菌屬于甲烷火球菌目（Methanopyrales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微球目（Methanomicrobiales）、甲烷胞菌目（Methanocellales）和馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）[5]。最新研究還發(fā)現(xiàn)韋斯特古菌門、深古菌門等部分成員中也具有產(chǎn)甲烷菌代謝途徑相關(guān)基因，推測也具有產(chǎn)甲烷能力[6-7]。自然界中能被產(chǎn)甲烷菌利用并產(chǎn)生甲烷的底物非常有限，僅包括甲酸鹽、乙酸鹽、甲基化合物（如甲胺、三甲胺、甲醇等）、CO2等幾種結(jié)構(gòu)十分簡單的小分子物質(zhì)[8-9]。產(chǎn)甲烷途徑包括甲基營養(yǎng)型、乙酸代謝型和H2/CO2還原型3種類型，而自然界中的甲烷主要來自于乙酸發(fā)酵途徑和H2/CO2還原途徑[10]。產(chǎn)甲烷菌種類不同，不同區(qū)域?qū)Φ孜锢玫念愋筒煌?，?dǎo)致產(chǎn)甲烷途徑有很大差別。

中國一些海域的產(chǎn)甲烷菌及產(chǎn)甲烷活性得到了充分研究并取得了相應(yīng)成果。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)南海北部產(chǎn)甲烷菌的主要類群為Methanomicrobiales、Methanosarcinales和Methanomassiliicoccus。陳金泉和王風(fēng)平[12]對珠江口沉積物的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌群落組成隨深度增加而變化，在甲烷-硫酸鹽過渡帶上方及下方區(qū)域產(chǎn)甲烷優(yōu)勢菌群不同，產(chǎn)甲烷途徑也不同，說明受陸源影響的河口地區(qū)甲烷代謝途徑多樣，不同沉積物深度產(chǎn)甲烷代謝類型可能不同。李小飛等[13]采用室內(nèi)培養(yǎng)結(jié)合高通量測序技術(shù)，研究了長江口沉積物中厭氧區(qū)和富氧區(qū)產(chǎn)甲烷潛力及產(chǎn)甲烷菌群落組成特征，發(fā)現(xiàn)甲烷排放速率、甲烷產(chǎn)生潛力、產(chǎn)甲烷群落結(jié)構(gòu)在厭氧區(qū)和富氧區(qū)沉積物中有明顯差異，其中，厭氧區(qū)沉積物中產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢群落為Methanococcoides、Methanosarcina和Methanosaeta，富氧區(qū)沉積物中則以Methanosarcina、Methanosaeta和Methanocella為主。

渤海屬中國內(nèi)海，與其他海域相比具有半封閉性、海床淺等特征，受各種人為活動影響較大，是國內(nèi)眾多海域中污染狀況相對較重的海域[14-15]。同時，多條內(nèi)陸河流匯集于此，相對于其他海域河流陸源性輸入更為突出，河口地區(qū)缺氧或富營養(yǎng)化等造成生化因子發(fā)生明顯改變，影響甲烷代謝循環(huán)過程[16]。在該海域所有入海河流中，黃河徑流量最大，泥沙最豐富，向渤海輸入了大量泥沙和有機質(zhì)。但黃河輸入物質(zhì)中大部分在河口區(qū)沉積，僅小部分進(jìn)行離岸輸運，進(jìn)入黃海[17]。研究表明，不同海域沉積物中產(chǎn)甲烷菌群落特征存在差異，而有機質(zhì)、硫酸鹽含量、甲烷濃度等環(huán)境因素對產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)及產(chǎn)甲烷活性影響較大[13,18]。此外，以往對渤海研究多集中于沉積物微生物多樣性和溢油的微生物降解等方面，對渤海尤其是沉積物中產(chǎn)甲烷微生物研究較少。因此，分析比較渤海黃河近岸區(qū)域與離岸區(qū)域沉積物的產(chǎn)甲烷潛力與產(chǎn)甲烷菌群落特征具有重要意義[19-20]。

本文采集渤海典型站位沉積物樣品，通過提供不同類型產(chǎn)甲烷底物進(jìn)行培養(yǎng)，分析各樣品中甲烷產(chǎn)量及產(chǎn)甲烷菌群落特征，綜合評價沉積物中甲烷產(chǎn)生途徑及產(chǎn)甲烷菌的群落多樣性。研究結(jié)果將為深入了解渤海沉積物中微生物產(chǎn)甲烷途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年6月搭乘“中漁科102”號調(diào)查船對渤海海域進(jìn)行調(diào)查，使用箱式采泥器采集M1站位和M7站位沉積物，再使用PVC管進(jìn)行柱狀樣采集，每個站位各取4個平行樣。M1站位（38°13'95''N,119°2'55''E）位于黃河入海口附近，水動力作用豐富，受陸源輸入影響較大，M7站位（39°32'12''N,120°28'07''E）位于渤海中部泥質(zhì)沉積區(qū)（圖1），水動力相對較弱，受陸源影響較小，是渤海的低速沉積區(qū)域，2個站位地理位置在渤海中具有代表性[21]。M1站位柱狀沉積物長約30 cm，M7站位柱狀沉積物長約40 cm。本實驗選取M1站位2～6 cm、20～24 cm和M7站位2～6 cm、20～24 cm、32～36 cm，即淺層、中層、深層沉積物作為目標(biāo)層次進(jìn)行后續(xù)分析培養(yǎng)工作，以便獲得不同層次沉積物中較完整的產(chǎn)甲烷菌群落特征與產(chǎn)甲烷規(guī)律。所取4個平行樣中，一個采用無菌注射器分別取目標(biāo)層次沉積物3 mL，并注入裝有6% NaOH溶液的頂空瓶中用于甲烷測定；一個采用Rhizon采樣器取目標(biāo)層次間隙水，于-20℃冰箱凍存，用于測定硫酸根離子含量；一個在4℃環(huán)境下保存用于產(chǎn)甲烷活性培養(yǎng)；另一個置于-20℃冰箱凍存，用于微生物總DNA提取和高通量測序。

圖1 渤海沉積物樣品采集位點Fig.1 Sampling location in the Bohai Sea

1.2 沉積物中甲烷、硫酸鹽以及總有機碳分析

甲烷作為微生物產(chǎn)甲烷作用的產(chǎn)物，對評價原位產(chǎn)甲烷作用有重要意義，而硫酸鹽、總有機碳（total organic carbon, TOC）對產(chǎn)甲烷菌群落組成與原位產(chǎn)甲烷活性有重要影響，為分析其相互關(guān)系，對這些指標(biāo)進(jìn)行測定。沉積物中的甲烷含量采用靜態(tài)頂空法[22]進(jìn)行測定：首先，將裝有沉積物的樣品瓶劇烈震蕩，再充分靜置，使液相與氣相之間的甲烷達(dá)到平衡后，取5 mL頂空氣體注入氣相色譜儀（7890B，安捷倫）進(jìn)行甲烷測定。使用FID氫火焰離子化檢測器進(jìn)行檢測，進(jìn)樣口設(shè)定溫度為100 ℃，檢測器溫度為175 ℃，分離柱溫度為50 ℃，載氣為高純氮氣。間隙水中SO42-含量利用離子色譜（ICS-3000, Diones）進(jìn)行測定。檢測方式為電導(dǎo)檢測，進(jìn)樣量為1 mL，柱溫為30 ℃，檢測池溫度為35 ℃，淋洗液流速為 1.2 mL/min（陰離子）、1.0 mL/min（陽離子），抑制電流為 90 mA（陰離子）、69 mA（陽離子）。將沉積物樣品凍干后研磨，稱取30 mg置于銀舟中用Milli-Q水濕潤，采用鹽酸熏蒸法去除碳酸鹽，然后將樣品放入烘箱加熱烘干，接著使用元素分析儀（FLASH 2000, Thermo Fish Scientific Inc.）對沉積物中TOC進(jìn)行測定[23]。

1.3 產(chǎn)甲烷培養(yǎng)實驗

由于硫酸鹽促進(jìn)硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria, SRB）生長，對產(chǎn)甲烷菌生長產(chǎn)生競爭作用，同時也有可能發(fā)生甲烷厭氧氧化消耗甲烷，所以在產(chǎn)甲烷活性培養(yǎng)實驗中，用去離子水配置不含硫酸鹽的人工培養(yǎng)基（表1）[24]。配置培養(yǎng)基并滅菌后加入微量元素溶液[25]（1 mL L-1）及維生素液[26]（1 mL L-1）。再以高純氮氣（99.999%）進(jìn)行通氣置換氧氣等氣體后，置于厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ，上海星巴儀器設(shè)備有限公司）中。培養(yǎng)液內(nèi)同時加入還原劑L-半胱氨酸鹽（20 mg L-1）和刃天青顯色劑（1 mL L-1）還原并指示環(huán)境的厭氧狀態(tài)。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Composition of the medium

之后，將4℃環(huán)境下保存的沉積物樣品按1∶1比例與培養(yǎng)液混合，轉(zhuǎn)移至120 mL培養(yǎng)瓶中，加入不同底物后，用丁基膠塞和鋁蓋密封。然后將培養(yǎng)瓶移出厭氧培養(yǎng)箱，在原位溫度下（10 ℃）避光靜置培養(yǎng)。設(shè)置6個實驗組，每組分別添加H2/CO2（H2∶CO2為8∶2）、20 mmol甲醇、20 mmol一甲胺、20 mmol三甲胺、20 mmol乙酸鈉、10 mmol 2-溴乙烷磺酸鹽（2-bromoethane sulphonate, BES）以測定不同底物對厭氧產(chǎn)甲烷的影響，每組實驗設(shè)置2個平行樣。BES是一種甲烷生成的末端抑制劑，以將微生物甲烷生成與物理解吸區(qū)分開來[27]。

采用氣相色譜儀（SP-3420A，北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）測定甲烷產(chǎn)量。使用FID氫火焰離子化檢測器進(jìn)行檢測，進(jìn)樣口設(shè)定溫度100℃，單次進(jìn)樣 50 μL，檢測器溫度 150℃，分離柱為50℃，載氣為氦氣（UHP, 99.999%）。檢測結(jié)果單位為%（v/v），通過理想氣體狀態(tài)方程得到某一時刻每克沉積物（干重）所產(chǎn)生的甲烷量（μmol）。培養(yǎng)瓶內(nèi)某時刻甲烷產(chǎn)生量計算公式為：

式中，CH為培養(yǎng)瓶上層氣體中甲烷測定濃度，μL L-1；VH為上層氣體體積，L。

1.4 DNA提取和高通量測序

取0.25～0.5 g沉積物，使用PowerSoil DNA Isolation Kit（Mo Bio, 美國）試劑盒按照手冊提供的操作步驟提取樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量。使用添加Barcode序列的引物A519F（5'-CAGCCGCCGCGGTAA）和A915R（5'-GTGCTCC CCCGCCAATTCCT）對古菌 16S rRNA基因V4-V5區(qū)進(jìn)行擴增和Illumina高通量測序。測序于Illumina Miseq PE300平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）完成。

在攝影領(lǐng)域，我為越南多樣的文化和多彩的風(fēng)光感到驚訝。整個國家仿佛是露天攝影棚，人們喜歡攝影。無論你是風(fēng)光攝影師、街頭攝影師，還是肖像和人文攝影師，這里都是一個絕佳的拍攝地。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Fastp和FLASH軟件對Miseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置50 bp的窗口，將尾部質(zhì)量值20以下的堿基序列過濾。經(jīng)過質(zhì)量控制后的序列進(jìn)行雙端序列拼接（最小重疊堿基長度為10 bp，且最大錯配比例為0.2），并篩除不符合序列。根據(jù)序列首尾Barcode和引物區(qū)分樣品，同時調(diào)整序列方向。通過Uparse軟件平臺按照97%相似性對所得非重復(fù)序列（不包括單序列）進(jìn)行OTU聚類分析。通過與Silva數(shù)據(jù)庫（Release132,http://www.arb-silva.de）進(jìn)行比對，得到樣本群落物種組成信息。采用Origin 2018軟件繪制甲烷產(chǎn)量圖、產(chǎn)甲烷速率圖及古菌、產(chǎn)甲烷菌豐度圖。本研究基因序列上傳至NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫（登錄號：PRJNA715082）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物中甲烷、硫酸鹽及總有機碳含量

沉積物中甲烷、硫酸鹽濃度以及TOC含量如圖2所示。M1站位中，20～24 cm甲烷濃度略低于2～6 cm；在M7站位中，隨著深度的增加，甲烷濃度呈明顯的升高趨勢。兩站位沉積物硫酸鹽濃度較穩(wěn)定，均略高于海水平均值（28 mmol L-1[28]），隨深度無明顯變化趨勢。M7站位TOC含量明顯高于M1站位。

圖2 甲烷、硫酸鹽濃度和TOC含量Fig.2 Methane and sulfate and TOC contents

2.2 古菌群落特征

2.2.1 古菌群落多樣性分析

利用高通量測序共得到114 755條古菌16S rRNA基因有效序列，每個樣本序列條數(shù)為13 657～31 748。按97%序列相似性界定OTU，共獲得1 105個OTU，每個樣品的OTU為428～741（表2）。群落覆蓋度為＞99%，說明測序深度足以覆蓋樣品中絕大多數(shù)物種信息。M7站位古菌豐富度指數(shù)（Chao1）高于M1站位，說明M7站位較M1站位有更多的古菌種類。在5個沉積物樣品中，M7 2～6 cm沉積物Shannon指數(shù)最低且Simpson指數(shù)最高，說明M7 2～6 cm群落多樣性最低。除M7 2～6 cm外，M7站位其他樣品的Shannon指數(shù)均高于M1，且Simpson指數(shù)均低于M1，證明M7站位其他層的群落多樣性高于M1站位。同時，在M1和M7中，Shannon指數(shù)隨深度逐漸增加，即古菌群落多樣性隨沉積物深度增加而增高。

表2 古菌群落多樣性特征Table 2 Diversity characteristics of archaea community

測定到的古菌屬于11個門，其中泉古菌門（Crenarchaeota）、阿斯加德古菌（Asgardaeota）和納古菌門（Nanoarchaeota）為優(yōu)勢古菌。古菌在綱分類水平上的群落組成見圖3。M1站2～6 cm和20～24 cm優(yōu)勢古菌均為深古菌綱（Bathyarchaeia）（相對豐度分別為42.7%和53.4%），M7站2～6 cm優(yōu)勢古菌為 Nitrososphaeria綱（相對豐度 57.1%），而20～24 cm和32～36 cm優(yōu)勢古菌均為深古菌綱（Bathyarchaeia）（相對豐度分別為53.2%和58.9%）。在兩個站位中，隨著沉積物深度增加，Bathyarchaeia和 Lokiarchaeia豐度增加，而 Nitrososphaeria和Nanoarchaeia豐度逐漸減小。

圖3 沉積物中綱分類水平上古菌的相對豐度（相對豐度＞1%）Fig.3 Relative abundance of the archaea at class level in the sediments of Bohai Sea (relative abundance ＞1%)

2.2.2 產(chǎn)甲烷菌群落特征

沉積物中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)組成在屬和目的分類水平上的相對豐度見圖4。所獲得產(chǎn)甲烷菌屬于Ca.Methanofastidiosales、甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷微球目（Methanomicrobiales）和馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）。包括以下屬：甲烷擬球菌屬-（Methanococcoides）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium）、馬賽甲烷球菌屬（Methanomassiliicoccus）及Candiadatus Syntrophoarchaeum。其中，Methanococcoides以甲基物質(zhì)為底物，Methanosarcina以乙酸、甲基物質(zhì)和H2/CO2為底物，Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanogenium以H2/CO2為底物產(chǎn)甲烷，而Methanomassiliicoccus則利用H2還原甲基類化合物產(chǎn)甲烷[13,29-30]。

圖4 沉積物中目、屬分類水平上產(chǎn)甲烷菌的序列條數(shù)加粗字體為目名，其余為屬名，相同底紋表示同一目分類。Fig.4 The number of sequences of methanogens at levels of order and genus in sediments of Bohai SeaBold font is the order name, and the rest is the genus name.Every shading indicates the same order classification.

在所有樣品中Ca.Methanofastidiosales產(chǎn)甲烷菌均為主要優(yōu)勢群落，尤其是在M7 2～6 cm樣品中。同時，甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）為M7 2～6 cm外其他樣品的優(yōu)勢菌。樣品M1 20～24 cm中，甲烷桿菌目（Methanobacteriales）是重要的產(chǎn)甲烷菌目。而甲烷微球目（Methanomicrobiales）只在M7 20～24 cm樣品中獲得，馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）只在M1的2～6 cm和20～24 cm層樣品中獲得。

此外，在M1 2～6 cm沉積物中，還存在以乙酸、甲基物質(zhì)和H2/CO2為底物的Methanosarcina，以H2/CO2為底物的Methanobrevibacter；在M1 20～24 cm沉積物中，也存在Methanosarcina和以H2/CO2為底物的Methanobacterium、Methanobrevibacter，同時還存在Methanomassiliicoccus及利用甲基物產(chǎn)甲烷的Methanococcoides[9,31-32]。M7 2～6 cm沉積物僅含Ca.Methanofastidiosales；在M7 20～24 cm樣品中包括：Methanococcoides、Methanosarcina、Methanobacterium、Methanogenium和Candidatus Syntrophoarchaeum；M7 32～36 cm包括Methanococcoides、Methanobacterium。

2.3 沉積物產(chǎn)甲烷活性

沉積物樣品在不同底物下甲烷產(chǎn)量如圖5所示。在添加BES和乙酸鈉后，所有樣品均不產(chǎn)生甲烷，而在其他底物下有明顯產(chǎn)甲烷現(xiàn)象。其中，沉積物樣品均在以非競爭性底物（三甲胺、一甲胺、甲醇）下優(yōu)先產(chǎn)生甲烷，并很快達(dá)到最大產(chǎn)量，H2/CO2底物組則在培養(yǎng)后期開始有少量甲烷產(chǎn)生。此外，樣品中同一站位不同深度沉積物最大產(chǎn)甲烷量隨深度遞減，而同一深度中M7站最大甲烷產(chǎn)量高于M1站。

圖5 渤海沉積物樣品在不同底物厭氧培養(yǎng)過程中甲烷產(chǎn)量Fig.5 Methane production in the sediments from the Bohai Sea during the anaerobic incubation with different substrates

樣品在不同底物下的平均產(chǎn)甲烷速率采用最大甲烷產(chǎn)量除以其達(dá)到最大產(chǎn)量所消耗時間來計算（圖6）。在M1和M7站中，以三甲胺為底物時產(chǎn)甲烷速率最高，接著是一甲胺和甲醇，H2/CO2底物組則最低，而乙酸鈉底物組不產(chǎn)甲烷。同等深度同一底物供給下，M7站沉積物產(chǎn)甲烷速率高于M1站；添加相同底物時，兩站位產(chǎn)甲烷速率隨沉積物深度增加而降低，以三甲胺為底物時最明顯，其中M1站降低了33.23%，M7站則依次降低了27.01%和29.48%。

圖6 渤海沉積物中添加不同底物的厭氧產(chǎn)甲烷速率Fig.6 Methane production rate in the sediments from the Bohai Sea during the anaerobic incubation with different substrates

2.4 產(chǎn)甲烷活性與產(chǎn)甲烷菌的相互關(guān)系

將環(huán)境樣本所測得的不同產(chǎn)甲烷菌相對豐度與產(chǎn)甲烷速率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，原位沉積物中未檢測到乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，這一結(jié)果與產(chǎn)甲烷培養(yǎng)實驗中乙酸鈉底物組無甲烷產(chǎn)生相一致；其他不同途徑產(chǎn)甲烷菌豐度與產(chǎn)甲烷速率一致性不顯著（圖7）。在M1站位中，20～24 cm樣品所檢測到的甲基營養(yǎng)型及H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌相對豐度均高于2～6 cm樣品，但是該層沉積物以三甲胺、一甲胺、甲醇及H2/CO2為底物時，產(chǎn)甲烷速率均低于2～6 cm沉積物。在M7站位中，2～6 cm沉積物中未檢測到氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，但是該層沉積物在添加H2/CO2時產(chǎn)甲烷速率明顯高于20～24 cm及32～36 cm沉積物。

圖7 產(chǎn)甲烷菌相對豐度及產(chǎn)甲烷速率Fig.7 Relative abundance of methanogens and methane production rates

3 討論

3.1 甲烷產(chǎn)生底物

底物影響產(chǎn)甲烷途徑和產(chǎn)甲烷潛力，不同底物可以導(dǎo)致不同的產(chǎn)甲烷菌活性和甲烷產(chǎn)生途徑[5,33]。在產(chǎn)甲烷厭氧培養(yǎng)過程中以H2/CO2、甲醇、一甲胺、三甲胺、乙酸鈉和BES為底物的不同實驗組中，產(chǎn)甲烷規(guī)律表現(xiàn)出一定的差異：①同一站位同一底物下甲烷產(chǎn)生量隨深度增加而降低。Zeleke等[34]對長江口泥灘沉積物中產(chǎn)甲烷菌分布特征進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)表層沉積物中產(chǎn)甲烷菌具有更高的豐富度。因此猜測原位環(huán)境中表層沉積物富含大量有機質(zhì)，為產(chǎn)甲烷微生物提供了充足的底物，致使上層沉積物具有更大的產(chǎn)甲烷活性。②添加產(chǎn)甲烷菌能夠利用的小分子物質(zhì)，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后可產(chǎn)生甲烷，同一樣品，添加不同底物后甲烷產(chǎn)生量不同，以甲基類化合物為底物時甲烷生成量較高，而以H2/CO2為底物時生成量較低，添加乙酸鈉底物的樣品和添加BES的樣品經(jīng)過培養(yǎng)后均沒有甲烷的生成。表明甲烷的產(chǎn)生是微生物發(fā)揮作用的結(jié)果，而充足的底物是甲烷產(chǎn)生的重要條件，乙酸鈉底物組自身形成空白對照，證明原位沉積物中有機質(zhì)未對實驗結(jié)果有任何影響。由于三甲胺分子所含甲基數(shù)量為一甲胺與甲醇的3倍，因此，其產(chǎn)甲烷速率同樣約為二者的3倍，而一甲胺與甲醇在產(chǎn)甲烷速率上沒有較大差異?？傮w而言，甲基類物質(zhì)為底物時產(chǎn)甲烷活性明顯大于以H2/CO2為底物，這一點在其他學(xué)者的研究中也有所體現(xiàn)。Zhuang等[35-36]研究發(fā)現(xiàn)，在甲基類物質(zhì)（一甲胺、三甲胺、甲醇等）濃度很低的原位環(huán)境中，產(chǎn)甲烷菌依舊可以利用其產(chǎn)生甲烷。Summons[37]也發(fā)現(xiàn)，在自然界高鹽環(huán)境中，主要以代謝甲基類化合物（一甲胺、三甲胺、甲醇等）產(chǎn)甲烷。

底物通過改變產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)影響產(chǎn)甲烷活性的發(fā)揮，而不改變沉積物的原有產(chǎn)甲烷途徑。同時，高通量測序結(jié)果證明，兩站位沉積物樣品中只存在甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌。因此，根據(jù)以上培養(yǎng)實驗與微生物測序結(jié)果得出結(jié)論，兩站位沉積物中產(chǎn)甲烷途徑以甲基營養(yǎng)型為主，同時含有H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷。

3.2 硫酸鹽濃度

在硫酸鹽含量較高（＞1 mmol L-1）的海洋沉積物環(huán)境中，硫酸鹽還原菌在與產(chǎn)甲烷菌競爭共同底物（乙酸鹽和H2）過程中占據(jù)優(yōu)勢地位，因此產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)甲烷過程受到一定限制，而甲胺、甲醇為非競爭性底物，可以被產(chǎn)甲烷菌迅速利用并產(chǎn)生甲烷[38-39]。本研究所測得間隙水硫酸鹽含量均高于海水平均濃度（28 mmol L-1），因此在原位環(huán)境中，甲基型產(chǎn)甲烷菌占優(yōu)勢地位，但因為SRB很難完全限制產(chǎn)甲烷菌對H2的利用，因此，沉積物中仍含有較少量的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。在培養(yǎng)實驗?zāi)┢?，環(huán)境中硫酸鹽被大量消耗，H2/CO2型產(chǎn)甲烷菌豐度隨間隙水中硫酸鹽濃度減小而增加，從而產(chǎn)生甲烷[40-42]。

這一結(jié)論在其他學(xué)者的研究中也有發(fā)現(xiàn)。在對地中海西部三角洲表層和次表層沉積物中不同基質(zhì)和產(chǎn)甲烷途徑下產(chǎn)甲烷作用的分析中，研究者發(fā)現(xiàn)在最頂部的表層沉積物中，還原甲醇產(chǎn)甲烷作用占甲烷總產(chǎn)量的98%，而在貧硫酸鹽區(qū)，H2/CO2還原產(chǎn)甲烷則是主要途徑，且對mcrA功能基因測序分析表明，產(chǎn)甲烷菌群落組成與不同底物下產(chǎn)甲烷活性分布基本一致[43]。而對墨西哥灣北部Orca盆地高鹽沉積物的研究表明，非競爭性甲基化合物（甲醇、三甲胺、二甲基硫醚、二甲基磺酸鹽）底物是生成甲烷的主要途徑，氫營養(yǎng)型和乙酸還原型產(chǎn)甲烷途徑則受到了硫酸鹽的限制[35]。

3.3 原位TOC含量與甲烷含量

海洋生態(tài)環(huán)境中，絕大部分甲烷來源于產(chǎn)甲烷菌對有機質(zhì)的厭氧降解，因此，原位沉積物中有機質(zhì)含量對產(chǎn)甲烷活性具有重要作用。與多數(shù)研究相反，離岸海域M7站位整體TOC含量大于近岸海域M1站位，這與高立蒙[44]得出的結(jié)論相同。根據(jù)沉積物粒徑和密度分級，在陸源有機碳散布與沉積過程中，水動力分選作用發(fā)揮了重要作用[45-46]。在M7站位所處的渤海中部地區(qū)，水動力較弱且為旋轉(zhuǎn)流，細(xì)顆粒不斷進(jìn)行沉積，形成渤海中部泥質(zhì)沉積區(qū)。在水動力分選作用下，有機碳賦存于細(xì)顆粒物并沉積，因此有機質(zhì)含量較高。相反，在M1站位，雖鄰近黃河口，但TOC含量低于M7站，原因可能為黃河懸浮顆粒物中約90%以上來源于黃土高原，有機碳本身含量較低（0.2%～0.8%）[47-48]。M7站有機質(zhì)含量豐富，大分子有機物不斷分解，為產(chǎn)甲烷菌提供充足的底物。因此，M7站產(chǎn)甲烷菌適應(yīng)性與活性相比于M1站更強，代謝速率更快，具有更大的產(chǎn)甲烷速率與甲烷產(chǎn)量。這也為之后的研究提供思考，即不能簡單地憑借是否近岸，是否有類似黃河徑流等大量陸源物質(zhì)輸入而判斷站位的有機質(zhì)含量與相關(guān)微生物的代謝速率。

M7站位較M1站位TOC含量更高，產(chǎn)甲烷菌可利用更多底物進(jìn)行產(chǎn)甲烷活動，因此，間隙水甲烷含量更高。由于采集樣品時間臨近夏季，黃河徑流量較大，近黃河口地區(qū)水動力作用活躍，沉積環(huán)境不穩(wěn)定，因此，M1站位甲烷含量沒有體現(xiàn)較大差別。M7站沉積物間隙水甲烷含量隨深度增加有升高趨勢，這在其他較多研究中都有體現(xiàn)。吳自軍[49]對珠江口及其臨近海域沉積物間隙水甲烷進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)甲烷濃度在沉積物上部較低且變化幅度小，且隨深度遞增而增加，接近硫酸鹽還原帶底部時，甲烷含量急劇增大。臧昆鵬[50]對渤海耗氧海域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)表層沉積物中甲烷含量較低，向深層波動上升。分析其原因，環(huán)境中甲烷含量是產(chǎn)甲烷與甲烷氧化共同作用的結(jié)果，除沉積物層外，底層海水是溶解甲烷的匯之一，表層沉積物中的甲烷部分?jǐn)U散至底層海水并被微生物氧化消耗?？赡芤驗镸7站較高的有機質(zhì)輸入量和較大的沉積速率，限制了微生物對表層沉積物中有機質(zhì)的降解，因此部分表層有機質(zhì)未被分解而被直接埋藏，為深層沉積物環(huán)境產(chǎn)甲烷提供豐富碳源[49]。

3.4 古菌與產(chǎn)甲烷菌

古菌在深層沉積物的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用，在兩站位沉積物中具有明顯的垂向分布特征。在本研究中，深古菌綱（Bathyarchaeia）為主要優(yōu)勢古菌。Bathyarchaeia為沉積物中最主要的古菌類群，廣泛分布于深海沉積物、近海沉積物、濱海濕地等各種環(huán)境中[51-53]。在沉積物有機碳再礦化過程中，易降解的有機碳被微生物優(yōu)先利用，難降解的有機碳不斷被埋藏，而Bathyarchaeia和Lokiarchaeia在埋藏有機碳的降解過程中發(fā)揮著重要作用[54-55]，因此，隨著沉積物深度增加，相對豐度增加，不斷進(jìn)行代謝，為深層沉積物中產(chǎn)甲烷作用提供底物，在產(chǎn)甲烷環(huán)境中扮演著重要角色。

甲烷的產(chǎn)生與產(chǎn)甲烷菌群落組成密切相關(guān)[5]。產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格厭氧的古菌，只能利用簡單化合物生成甲烷，部分產(chǎn)甲烷菌可以同時利用多種底物產(chǎn)甲烷[56-57]。本研究測序結(jié)果顯示，Ca.Methanofastidiosales是沉積樣品中占絕對優(yōu)勢地位的產(chǎn)甲烷菌，該類群能夠以甲基類化合物為底物產(chǎn)生甲烷，屬于甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[58-59]。這類產(chǎn)甲烷菌很少以優(yōu)勢菌出現(xiàn)在以往的研究中，是同其他區(qū)域研究結(jié)果明顯不同之處[60-61]。對原位沉積物的高通量測序結(jié)果顯示，不同樣品中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)不同，優(yōu)勢群落利用底物存在差別，因此具有不同的產(chǎn)甲烷活性。

根據(jù)高通量測序結(jié)果，M1站位中存在Methanomassiliicoccales，而M7站位不存在。Methanomassiliicoccales是2012年在人類糞便中新分離出來的產(chǎn)甲烷菌，被列為產(chǎn)甲烷菌的第七個目[62]。目前，全球?qū)ethanomassiliicoccales的發(fā)現(xiàn)相對較少，且多集中在陸地濕地、人和動物的胃腸道中，部分海洋沉積物中也有發(fā)現(xiàn)[63-64]。Cozannet[65]對全球86個樣品（包括海洋沉積物、深海熱液噴口、海底泥火山、泥炭土壤、湖泊、溫泉、河流沉積物等）進(jìn)行高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，只有22個樣品中檢測出了Methanomassiliicoccales。M1站位于黃河入海口附近，且采樣時間為夏季，黃河徑流量較大，因此考慮為黃河徑流將其帶入。Methanogenium為海洋油氣田沉積物的主要優(yōu)勢菌屬，且推測與油氣田形成有關(guān)[18]，在甲烷含量較低的M1站中未檢出。除共同優(yōu)勢菌屬Ca.Methanofastidiosales外，M1站位和M7站位的第2大主要優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌屬分別為Methanosarcina和Methanococcoides。其中，Methanosarcina是黃河中主要優(yōu)勢菌屬，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，是濱海地區(qū)重要的產(chǎn)甲烷菌并廣泛參與碳循環(huán)，因此推測其由黃河徑流輸入M1站；而Methanococcoides是渤海原有的產(chǎn)甲烷菌，受黃河入海影響較小，在M7站位保持其優(yōu)勢菌屬地位[4]。

3.5 產(chǎn)甲烷菌與產(chǎn)甲烷活性的相關(guān)性

產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷速率與高通量測序結(jié)果不具有明顯的相關(guān)性。尤其在M7站2～6 cm沉積物中沒有檢測到H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌，但是在以H2/CO2為底物時，該層沉積物相對于同站位其他層次沉積物卻具有更大的甲烷生成量。推測產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因為：本研究針對古菌的16S rRNA基因進(jìn)行高通量測序，而原始樣品中產(chǎn)甲烷功能菌群落豐度本身較小，且因為較高的硫酸鹽含量，原位環(huán)境中H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌較少，從而沒有被檢測出來。但是H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌在培養(yǎng)過程中豐度逐漸增大，產(chǎn)甲烷作用不斷增強，在培養(yǎng)后期獲得較大的產(chǎn)量。所以，如果在培養(yǎng)結(jié)束時，分析產(chǎn)甲烷菌相對豐度與產(chǎn)甲烷速率的相關(guān)性，可能更能準(zhǔn)確反映二者之間的相互關(guān)系，這為后續(xù)進(jìn)一步研究提供了思路。

4 結(jié)論

（1）渤海M1、M7站位以甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷為主，同時具有H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷途徑，不存在乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷途徑。

（2）同一站點隨著深度的增加，甲烷產(chǎn)生量逐漸減少，產(chǎn)甲烷速率相應(yīng)降低。

（3）通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)古菌群落以Crenarchaeota、Asgardaeota和Nanoarchaeota為主。其中，M1 2～6 cm、M1 20～24 cm、M7 20～24 cm、M7 32～36 cm優(yōu)勢古菌均為Bathyarchaeia綱，M7 2～6 cm優(yōu)勢古菌為Nitrososphaeria綱。Ca.Methanofastidiosales在各樣品產(chǎn)甲烷菌中占據(jù)優(yōu)勢地位。

致謝：感謝中國地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所的賀行良老師在甲烷含量測定等方面提供的支持與幫助。