楊彥超，黎承楊

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧530021）

0 引言

腎結(jié)石是一種泌尿系統(tǒng)常見的疾病，發(fā)病率約為 10%～15%[1]。腎結(jié)石由與有機物質(zhì)混合的礦物質(zhì)晶體聚集組成，并根據(jù)其主要晶體成分來命名,總體可分為三大類，分別是代謝性結(jié)石、感染性結(jié)石和藥物性結(jié)石。腎結(jié)石的發(fā)病機制復(fù)雜，可受到代謝、遺傳、環(huán)境等多因素的相互影響，而臨發(fā)揮重要的作用床上以草酸鈣構(gòu)成的腎結(jié)石最為常見[2]。其中大約有80%的腎結(jié)石主要由草酸鈣(CaOx)晶體和不同量的磷酸鈣(CaP)混合而成。在多項體外細胞實驗[3-4]證實，草酸鈣可誘導(dǎo)HK-2細胞大量表達炎性細胞蛋白，并引起腎小管出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，故草酸鈣晶體刺激腎小管細胞產(chǎn)生炎性損傷被認為是在結(jié)石形成及發(fā)展的過程中發(fā)揮不可忽視的作用，是腎結(jié)石防治的重點關(guān)注領(lǐng)域之一。作為近些年被大量關(guān)注的炎性蛋白，炎性高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和核因子κB（NF-κB）一直是多種器官出現(xiàn)炎癥過程中大量分泌的炎性細胞蛋白，并在多種炎癥反應(yīng)當(dāng)中起到關(guān)鍵作用。HMGB系列包含HMGB1、HMGB2、HMGB3。HMGB1是第一個被確定的HMGB家族蛋白，其表達幾乎在所有種類的細胞中普遍存在, HMGB2主要在成年動物睪丸及淋巴組織中出現(xiàn)，HMGB3基本只在胚胎及造血干細胞中進行表達。真核細胞中HMGB1作為一種核蛋白，在腦、腎、淋巴組織等組織結(jié)構(gòu)中分布非常廣泛且含量豐富。HMGB1在細胞核內(nèi)與DNA不緊密結(jié)合，可以發(fā)揮維持核小體穩(wěn)定，在有序調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)中起關(guān)鍵性作用[5]。由于HMGB1與細胞核染色質(zhì)結(jié)合的不夠牢固，當(dāng)受到炎性刺激導(dǎo)致細胞核膜的通透性增加時，HMGB1可分泌至細胞質(zhì)及細胞外環(huán)境中，通過與其他細胞表面的受體結(jié)合，發(fā)揮其促炎性作用。被分泌到細胞外的HMGB1可以成為一種炎癥介質(zhì)[6]，與內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞表面的TLR4和RAGE受體高親和度結(jié)合，使細胞MAPKs 途經(jīng)進行激活，對核因子κB（NF-κB）進行活化，最終啟動TLR4/NF-κB炎癥信號通路。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素(LPS)及炎癥因子刺激下，巨噬細胞、上皮細胞等均能分泌HMGBl產(chǎn)生炎癥反應(yīng) 。在對膿毒血癥進行分析[7]時發(fā)現(xiàn)，在腎組織當(dāng)中，HMGB1發(fā)生聚集，并分泌至尿液當(dāng)中并高親和力結(jié)合腎小管上皮細胞細胞膜表面的Toll樣受體4 (TLR4)，致使腎小管上皮細胞變成促炎性分泌細胞。這一現(xiàn)象表明在腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時，HMGB1及其下游介導(dǎo)的炎性細胞因子對腎小管上皮細胞發(fā)生炎性反應(yīng)有重要影響作用。通過我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，在成功建立細胞-結(jié)石體外模型后，處于草酸鈣晶體環(huán)境當(dāng)中的腎小管上皮細胞也能大量分泌HMGB1和其他炎性因子。所以，HMGB1是否在草酸鈣結(jié)石形成過程中發(fā)揮中心地位是值得我們進行深入研究的。

根據(jù)最新的研究結(jié)果可以證實，在腎結(jié)石的產(chǎn)生和發(fā)展過程中有多種炎性細胞因子產(chǎn)生并發(fā)揮重要作用，其中一些炎性細胞蛋白的表達增多，其中包括NF-κB與HMGB1。而這些炎性細胞因子所形成的炎性信號通路聯(lián)絡(luò)當(dāng)中，各個炎性蛋白之間是否存在相互聯(lián)系非常值得深入研究，在炎性信號通路中HMGB1是否位于中心調(diào)控地位是我們所關(guān)注的問題。

甘草酸 (Glycyrrhizic Acid)是一種直接高效的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)抑制劑，通過調(diào)節(jié)p38和p-JNK信號通路，而不影響p-ERK信號通路，從而抑制依賴于HMGB1的炎癥分子表達和氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。

但至今為止，國內(nèi)外對于通過調(diào)控HMGB1來影響草酸鈣晶體誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞后分泌NF-κB的研究甚少。因此，我們通過體外細胞實驗，構(gòu)建了細胞-草酸鈣晶體模型，并通過甘草酸特異性抑制HMGB1，以及利用HMGB1 RNA干擾慢病毒感染正常HK-2細胞來敲低細胞中HMGB1的表達量的方式，以觀察HMGB1對于NF-κB的影響作用。

1 對象與方法

1.1 藥物與試劑

甘草酸(上海藍木化工有限公司)；草酸鈣晶體(美國Sigma Aldrich公司)；HMGB1 RNA干擾慢病毒（吉凱基因有限公司）；HK-2專用培養(yǎng)基（武漢普諾塞生命科技有限公司）；兔抗β-actin多克隆抗體(生工生物工程(上海)股份有限公司)；兔抗HMGB1、NF-κB多克隆抗體(美國cell signaling technology公司)；HK-2細胞(中華細胞庫)。

1.2 細胞培養(yǎng)及模型的建立

HK-2細胞使用HK-2專用培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞融合度大約80%左右時進行傳代，根據(jù)實驗設(shè)計隨機進行細胞分組。將HK-2細胞隨機分成4組：對照組(HK-2細胞傳代后使用HK-2培養(yǎng)基培養(yǎng))；草酸鈣晶體干預(yù)組(使用HK-2專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞融合度達80%后使用含8mmoL/L草酸鈣晶體的HK-2專用培養(yǎng)基，干預(yù)24h)；甘草酸干預(yù)+草酸鈣晶體干預(yù)組(使用HK-2專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞融合度達80%后使用5moL/L甘草酸預(yù)處理2 h，再在培養(yǎng)基中加入草酸鈣晶體使HK-2專用培養(yǎng)基中含5mmol/L甘草酸和8 mmol/L草酸鈣晶體，干預(yù)24h)；HMGB1敲低+草酸鈣晶體干預(yù)組（利用HMGB1 RNA干擾慢病毒與HK-2細胞共培養(yǎng)，感染效率80%以上后更換含8mmoL/L草酸鈣晶體的HK-2專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h），24h后對細胞進行蛋白提取。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測NHMGB1和NF-KB的表達情況

根據(jù)實驗設(shè)計建立對應(yīng)細胞干預(yù)模型后，分別對4組HK-2細胞的蛋白進行提取，分裝后放置-80℃冰箱進行冷凍保存。隨后通過電泳在SDS-PAGE 10%分離膠上分離樣品中所包含的蛋白質(zhì)樣品，再通過電轉(zhuǎn)印技術(shù)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上并根據(jù)分子量進行剪裁。電轉(zhuǎn)印結(jié)束后使用脫脂奶粉對含有目標(biāo)蛋白的PVDF膜進行封閉1h，然后使用目標(biāo)蛋白對應(yīng)一抗在4℃環(huán)境中孵育12h，再在24℃且避光條件下與對應(yīng)蛋白兔抗二抗放置于勻速搖床上恒溫孵育1h后，在無菌PBS溶液中清洗三次（10min/次）后，利用LI-COR公司的Odyssey Fc成像系統(tǒng)對條帶進行顯像，利用ImageJ軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，經(jīng)分析計量資料均符合正態(tài)分布，并顯示為Mean±SD。采用方差分析對多組樣本間均數(shù)進行比較。以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 草酸鈣晶體干預(yù)對HK-2細胞HMGB1和NF-κB表達的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法得出結(jié)果并進行統(tǒng)計分析可得，草酸鈣晶體干預(yù)組和對照組相比，HMGB1（1.660±0.056與1.126±0.095，P＜0.05）和NF-κB（1.001±0.019與0.651±0.177，P＜0.05）的相對表達量明顯增加（圖1）。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測對照組和草酸鈣晶體刺激組HK-2細胞中HMGB1和NF-κB的表達

2.2 甘草酸預(yù)干預(yù)對草酸鈣晶體誘導(dǎo)HK-2細胞HMGB1和NF-κB表達的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法得出結(jié)果并進行統(tǒng)計分析可得，甘草酸干預(yù)組與草酸鈣晶體干預(yù)組對比之 下HMGB1（1.040±0.051與1.685±0.101，P＜0.05）和NF-κB（0.287±0.023與4.658±0.108，P＜0.05）的相對表達量有顯著降低（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測草酸鈣晶體刺激組和甘草酸干預(yù)組HK-2細胞中HMGB1和NF-κB的表達

2.3 用HMGB1 RNA干擾慢病毒技術(shù)敲低細胞HMGB1的轉(zhuǎn)錄對草酸鈣晶體誘導(dǎo)HK-2細胞HMGB1和NF-κB表達的影響

使用HMGB1 RNA干擾慢病毒感染HK-2細胞24h后更換正常HK-2專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并每天更換培養(yǎng)基至培養(yǎng)7天后，使用倒置相差熒光顯微鏡觀察慢病毒感染HK-2細胞后表達的綠色熒光蛋白（GFP）,病毒感染效率已達到80%（圖3）。

圖3 免疫熒光檢測HMGB1 RNA干擾慢病毒的感染效率

采用蛋白質(zhì)印跡法得出結(jié)果并進行統(tǒng)計分析可得，HMGB1敲低組和草酸鈣晶體干預(yù)組對比，HMGB1（0.709-0.012與0.988-0.011，P＜0.05）和NF-κB（0.603-0.011與0.872-0.073，P＜0.05）的相對表達量有顯著降低（圖4）。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測HMGB1敲低組和草酸鈣晶體干預(yù)組HK-2細胞中HMGB1和NF-κB的表達

3 討論

草酸鈣為主要構(gòu)成成分的腎結(jié)石，一直以來都是研究的重點。草酸鈣結(jié)石的發(fā)病機制與炎癥、鐵死亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬等均有復(fù)雜的關(guān)系。實驗和臨床研究結(jié)果表明，在草酸鈣結(jié)石環(huán)境中，腎小管上皮細胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧ROS，引起炎癥并誘發(fā)損傷[9-10]。HMGB1介導(dǎo)的腎內(nèi)炎癥會導(dǎo)致小鼠急性和慢性草酸中毒，并導(dǎo)致促炎因子TLR4和NF-κB誘導(dǎo)腎小管上皮壞死并促進草酸鈣沉積[11]。

炎性因子高遷移率族蛋白(HMGB1)是一類在真核細胞中的核蛋白，分布廣泛且含量豐富，在凝膠電泳當(dāng)中遷移較快而被命名[12]。由于HMGB1與細胞核染色質(zhì)結(jié)合的不夠牢固，當(dāng)受到炎性刺激導(dǎo)致細胞核膜的通透性增加時，HMGB1可分泌至細胞質(zhì)及細胞外環(huán)境中，通過與其他細胞表面的受體結(jié)合，發(fā)揮其促炎性作用。HMGB1從核內(nèi)分泌至細胞外環(huán)境可以通過主動和被動兩種途徑，既可以主動通過有免疫活性的炎癥細胞和單核/巨噬細胞排出胞外，除此以外可以通過壞死組織和細胞進行被動釋放[13]。排出到細胞外的HMGB1作為一種介導(dǎo)細胞炎癥的細胞因子，通過與細胞膜表面的TLR4和RAGE受體結(jié)合來介導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而激活TLR4/NF-κB信號通路，并釋放下游炎癥因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α等。在細胞內(nèi)分泌的TNF-α、IL-6和HMGB1等又可以增加細胞釋放過量的HMGB1，從而通過正反饋循環(huán)放大炎癥反應(yīng)[14]。多項研究表明，HMGB1可能在許多炎癥性疾病（如敗血癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）中作為初始損傷和隨后的炎癥反應(yīng)之間的連接分子發(fā)揮放大作用，最終導(dǎo)致器官或組織損傷[15 ,16]。在大鼠模型和血管內(nèi)皮細胞炎性損傷的體外模型中，HMGB1抑制可以有效地發(fā)揮對致死性膿毒癥的保護作用[17]。

綜上所述，HMGB1可以通過影響NF-κB等細胞因子的分泌，調(diào)控草酸鈣晶體造成的人腎小管上皮細胞的炎性因子分泌，從而減輕細胞的炎性損傷。目前可用于治療泌尿系結(jié)石造成的腎小管上皮細胞的炎性損傷的研究較少，通過干預(yù)HMGB1使其下游關(guān)聯(lián)炎性因子分泌減少，對尿石癥腎小管上皮細胞的保護和治療提供了新的策略。