李 雙 陳紹文 韓林濤 田代志 莫國艷 李杜軍

湖北中醫(yī)藥大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心，4眼科教研室 湖北 武漢 430065

魚腥草（Houttuynia cordata，HC），為三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThunb.）的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫(yī)別錄》，被《本草綱目》列為上品，具有明目利尿、清熱解毒、消腫排膿的功效，被國家衛(wèi)生部正式確定為“既是藥品，又是食品”［1，2］。其化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、黃酮和生物堿，具有提高免疫力、抗感染［3-5］、抗菌、抗病毒［6-8］等多種藥理活性［9］，被譽(yù)為中藥廣譜抗生素，于2003年入選為我國治療SARS 的8 種藥物之一［10］。魚腥草制劑作為一種新型的抗病毒中藥制劑，已被廣泛應(yīng)用于臨床眼疾治療［11-16］。對于角膜潰爛、干眼癥及病毒性角膜炎、結(jié)膜炎，魚腥草均有確切療效，不僅安全、有效，且使用方便、藥源廣泛、不影響繼續(xù)用藥等，是極具開發(fā)前景與應(yīng)用潛力的資源之一。

近年來，魚腥草研究多聚焦于化學(xué)成分分離鑒定、藥理活性、適應(yīng)證方面，幾乎為有效成分鑒定及其一般藥效學(xué)探討，缺乏更系統(tǒng)和深入的多成分、多靶點(diǎn)、多功效分子作用機(jī)制研究。尤其是魚腥草抗角膜炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制領(lǐng)域，當(dāng)前只有相關(guān)的臨床療效觀察報(bào)道［10-16］，尚無藥效學(xué)研究報(bào)道，實(shí)驗(yàn)研究更是空白。

中醫(yī)藥既強(qiáng)調(diào)整體性，又具多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特色。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為當(dāng)前的一種新研究理念，即能兼顧中醫(yī)藥整體性又具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑特色，是一種可系統(tǒng)性研究中醫(yī)藥的方法［17］。基于此，本研究以魚腥草治療角膜炎為研究對象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行探討分析，應(yīng)用各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和在線分析軟件，獲得魚腥草成分、靶點(diǎn)、角膜炎等信息，經(jīng)過分析，預(yù)測活性成分與潛在作用靶點(diǎn)，從整體水平觀察“魚腥草-作用靶點(diǎn)-角膜炎”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析活性成分、作用靶點(diǎn)和疾病間的潛在關(guān)系，探究魚腥草治療角膜炎的作用機(jī)制，奠定深入開展魚腥草治療角膜炎實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，為魚腥草治療角膜炎提供科學(xué)依據(jù)與臨床應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 收集角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)以“keratitis”為關(guān) 鍵 詞 在 數(shù) 據(jù) 庫DisGeNET［18］（http：//www. disgenet.org）收集與角膜炎相關(guān)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)利用數(shù)據(jù)庫STRING 11.0（https：//string-db. org/），結(jié)合角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)，以得分高于0.7 為標(biāo)準(zhǔn)，選取高置信度蛋白質(zhì)互作信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2（http：//www. cytoscape. org）構(gòu)建角膜炎相關(guān)的蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 收集魚腥草的化學(xué)成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析（TCMSP）平臺［19］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中國科學(xué)院化學(xué)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem. csdb. cn）及中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http：//www. tcmip. cn/ETCM/index.php/Home/），查找魚腥草的化學(xué)成分，通過Pub-Chem、ChemSpider 等數(shù)據(jù)庫，收集各化學(xué)成分的CAS 號、SMILES 結(jié) 構(gòu) 式、InChIKey 名、IUPAC 名等信息。將各化學(xué)成分的SMILES 結(jié)構(gòu)式信息導(dǎo)入 在 線 平 臺SwissADME［20］（http：//www. swissadme.ch/）中，預(yù)測它們的吸收、分布、代謝和排泄（absorption distribution metabolism and excretion，ADME）參數(shù)、藥動學(xué)特性、類藥性、藥物化學(xué)友好性，以便篩選魚腥草的活性化學(xué)成分。

1.4 預(yù)測魚腥草活性化學(xué)成分的潛在靶蛋白將上步所篩得的活性成分SMILES 結(jié)構(gòu)式在SwissTargetPrediction 平 臺［21，22］（http：//www. swisstargetprediction.ch）上，應(yīng)用“反向藥效團(tuán)匹配法”得到各活性化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)和生物活性結(jié)果。

1.5 構(gòu)建魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape 3.7.2 的Merge 功能，將角膜炎相關(guān)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)、魚腥草活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，構(gòu)建魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析將魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白信息，導(dǎo)入WebGestalt（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http：//www. webgestalt.org）［23］中，進(jìn)行GO 分析（生物過程、細(xì)胞組分和分子功能）與KEGG 分析。

1.7 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)將上述所得的KEGG 信號通路、魚腥草活性成分、潛在作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1角膜炎相關(guān)的PPI 網(wǎng)絡(luò)在數(shù)據(jù)庫DisGeNET 中，檢索到146 個(gè)與角膜炎相關(guān)的一級蛋白，見表S1（可掃描本文OSID 二維碼查看）。經(jīng)STRING 10.0 數(shù)據(jù)庫檢索，篩選出48 個(gè)與一級蛋白互作的角膜炎相關(guān)二級蛋白。經(jīng)軟件Cytoscape 3.7.2 整合分析，構(gòu)建角膜炎相關(guān)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖1），包含65 個(gè)角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)和382 條角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系。

圖1 角膜炎相關(guān)蛋白質(zhì)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.2 魚腥草活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)經(jīng)TCMSP平臺、中國科學(xué)院化學(xué)數(shù)據(jù)庫及ETCM 數(shù)據(jù)庫共檢索魚腥草化學(xué)成分72 個(gè)，見表S2（可掃描本文OSID二維碼查看，化學(xué)成分以阿拉伯?dāng)?shù)字編號表示），導(dǎo)入SwissADME 進(jìn)行預(yù)測，以Lipinski 違規(guī)參數(shù)≤1進(jìn)行篩選，得到54 個(gè)活性成分。將活性成分相關(guān)信息導(dǎo)入SwissTargetPrediction 平臺，經(jīng)“反向藥效團(tuán)匹配法”預(yù)測，得到各活性成分的靶點(diǎn)蛋白，整合可能性非零的預(yù)測靶點(diǎn)信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行擬構(gòu)，得到魚腥草活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2），包括含1 877 條活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)聯(lián)系、48 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和619 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。

圖2 魚腥草活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 與角膜炎相關(guān)的魚腥草活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 合并功能，將角膜炎相關(guān)的PPI 網(wǎng)絡(luò)、魚腥草活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，刪除無交集靶點(diǎn)，構(gòu)建角膜炎相關(guān)的魚腥草活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖3。節(jié)點(diǎn)之間主要連接原則為：當(dāng)魚腥草活性成分作用靶點(diǎn)與角膜炎靶點(diǎn)相同時(shí)，則活性成分節(jié)點(diǎn)與靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)聯(lián)系起來，此相同靶點(diǎn)即為魚腥草活性成分治療角膜炎的潛在靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)由14 個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、50 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)與160 條活性成分-潛在靶點(diǎn)聯(lián)系所構(gòu)成。其中，50 個(gè)靶點(diǎn)中含9 個(gè)直接作用靶點(diǎn)（即圖3 中間小圓），包括白細(xì)胞介素（IL）-6、Toll 樣受體（TLR）9、腫瘤壞死因子（TNF）等，以及41 個(gè)間接靶點(diǎn)（即圖3 右側(cè)大圓），主要包括IL-10、TLR2、血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）等。

圖3 與角膜炎相關(guān)的魚腥草活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2之Network Analysis-Analyze Network 功能，分析此網(wǎng)絡(luò)中各靶點(diǎn)的度值（Degree），可了解與該靶點(diǎn)相互作用的蛋白與魚腥草活性成分?jǐn)?shù)量（見表S3，可掃描本文OSID 二維碼查看）。通常，度值大小代表著對應(yīng)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的聯(lián)系程度，暗示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵性大小，Degree越大，表明作用于此靶點(diǎn)的魚腥草活性成分?jǐn)?shù)量或互作蛋白數(shù)量越多，暗示活性成分通過該靶點(diǎn)發(fā)揮作用的可能性就越大。分析結(jié)果表明9個(gè)直接靶點(diǎn)平均受2.22 個(gè)魚腥草成分作用，其中靶點(diǎn)CD38、MAPK8、TNF、CASP1 受2 個(gè)以上魚腥草成分作用，提示它們很可能是魚腥草活性成分發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)。

2.4 GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析應(yīng)用WebGestalt，對50 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析及KEGG 信號通路富集分析（P＜0.05）。經(jīng)GO分析，潛在靶點(diǎn)被注釋入303 項(xiàng)GO 術(shù)語中，包括263 項(xiàng)生物過程、18 項(xiàng)細(xì)胞組分、22 項(xiàng)分子功能，并以這三項(xiàng)下前3 個(gè)GO 術(shù)語與作用于潛在靶點(diǎn)的活性成分?jǐn)?shù)量進(jìn)行綜合分析（圖4），潛在靶點(diǎn)明顯富集于炎癥反應(yīng)、脂多糖細(xì)胞反應(yīng)、NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控等生物過程，多為細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)之類的細(xì)胞組分，主要具有細(xì)胞因子活性、生長因子活性、趨化因子活性等細(xì)胞功能。

圖4 魚腥草活性成分治療角膜炎潛在靶點(diǎn)的GO 功能富集分析

KEGG分析表明，50個(gè)潛在靶點(diǎn)被富集入10條信號通路（P＜0.001），所富集入的靶點(diǎn)數(shù)量不小于10個(gè)，靶點(diǎn)富集率介于13%～29%之間，顯著富集的信號通路具體為：IL-17信號通路（hsa04657）、Toll樣受體信號通路（hsa04620）、百 日 咳（hsa05133）、美 國 錐 蟲 病（hsa05142）、炎癥性腸病（hsa05321）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（hsa05323）、肺結(jié)核（hsa05152）、瘧疾（hsa05144）、NOD樣受體信號通路（hsa04621）、沙門氏菌感染（hsa05132），結(jié)果見圖5及表S4（可掃描本文OSID二維碼查看）。

圖5 魚腥草活性成分治療角膜炎潛在靶點(diǎn)的KEGG 信號通路富集分析

2.5 魚腥草治療角膜炎“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 將魚腥草治療角膜炎的15 個(gè)活性成分、50 個(gè)潛在靶點(diǎn)及其所富集的10條KEGG 信號通路進(jìn)行整合，構(gòu)建魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖6。從圖6可知，不同化學(xué)成分可作用于不同靶點(diǎn)，也可作用于同一靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可參與多條信號通路，如魚腥草中（R）-芳樟醇（9）、綠蓮皂苷元（19）、樟葉木防己堿（27）等5 種成分都可作用于角膜炎靶點(diǎn)MAPK8，此靶 點(diǎn) 可 注 釋 入hsa04657、hsa04620、hsa05133、hsa05142 共4 條信號通路中，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多作用途徑的特點(diǎn)；另一方面，同一成分可作用多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)又可受多個(gè)成分作用，如山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷（36）、山柰酚-3-O-A-L-吡喃鼠李糖苷（42）共3 種成分既可作用于靶點(diǎn)CD38，也可作用于TNF 靶點(diǎn)；再者，綠蓮皂苷元（19）既作用于MAPK8，也作用于NTRK1；靶點(diǎn)MAPK8、TNF 不僅參與多條信號通路，還有多個(gè)互作蛋白，盡管NTRK1、CD38 在本研究中沒有富集入任何信號通路，但CD38 受多個(gè)魚腥草成分作用，還與TNF、IL-6相互作用，NTRK1 雖只被綠蓮皂苷元（19）作用，但與NGF、VEGF-A、IKBKG 相互作用，這種交叉互作的關(guān)系不但體現(xiàn)了中醫(yī)藥“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特色，也契合了中醫(yī)藥的整體性網(wǎng)絡(luò)調(diào)控理念。

圖6 魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對魚腥草治療角膜炎的活性成分、潛在靶點(diǎn)及分子機(jī)制進(jìn)行分析探討與預(yù)測。在魚腥草已分離鑒定的72 個(gè)化學(xué)成分中有14 個(gè)成分可能是其治療角膜炎的活性成分，包括（R）-芳樟醇（9）、新綠原酸（17）、綠蓮皂苷元（19）、山柰酚（24）等；在146 個(gè)角膜炎相關(guān)靶點(diǎn)有50 個(gè)為魚腥草治療角膜炎的潛在靶點(diǎn)，其中有9 個(gè)直接作用靶點(diǎn)，包括MAPK8、CD38、TNF 等。魚腥草化學(xué)成分中黃酮類和揮發(fā)油為主要活性成分，魚腥草素（39）、甲基正壬酮（49）、月桂醛（5）、山柰酚（24）、槲皮素（50）是魚腥草發(fā)揮抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用的有效成分；其中魚腥草素（39）、甲基正壬酮（49）是魚腥草注射液、魚腥草滴眼液等中成藥的主要藥效物質(zhì)，可通過作用TNF-α、IL-1β、TLR4、IL-10、COX2、IL-6、TGF-β1 等靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、抑菌、抗氧化活性［2］；山柰酚（24）能作用于靶點(diǎn)TNF-α、IL-1β、IL-6 等而發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡與 神 經(jīng) 保 護(hù) 作 用［24，25］；槲 皮 素（50）亦 可 作 用 于TNF-α、IL-1β、IL-6 等靶點(diǎn)發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性［26］。現(xiàn)有研究報(bào)道提示，TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-8、IL-6 等與單純皰疹性角膜炎、真菌性角膜炎直接相關(guān)［27，28］，其中，TNF、TLR9、IL-6、CXCL8（又名IL-8）也是本研究所預(yù)測的直接靶點(diǎn)。可見，本研究中魚腥草治療角膜炎之活性成分與潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果在一定程度上已被既往相關(guān)研究所佐證。

GO 分析結(jié)果顯示，潛在靶點(diǎn)主要參與炎癥反應(yīng)、脂多糖細(xì)胞反應(yīng)、NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)控之類的生物過程，具有細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子的活性，是細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)的細(xì)胞組分（圖4），涉及了炎癥反應(yīng)、炎癥調(diào)控、凋亡、免疫等多種作用，主要體現(xiàn)在按功能分類時(shí)，可被分為炎癥反應(yīng)與信號的CXCL8、cAMP、IL-6 等，先天免疫 的 CLEC7A、S100A8、IRAK1 等，凋 亡 的CASP1、S100A8、CHI3L1 等，調(diào)控炎癥反應(yīng)的IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8 等。而且，潛在靶點(diǎn)顯著富集于與炎癥、感染（細(xì)菌、寄生蟲）、免疫相關(guān)的通路上，包括IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、百日咳等10 條KEGG 信號通路（圖5）。據(jù)報(bào)道，魚腥草具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用［2］，包括魚腥草揮發(fā)油降低COX2 表達(dá)并抑制PGE2 釋放；黃酮類抑制IL-6、NO 產(chǎn)生；萜類化合物結(jié)合一些參與感染與炎癥的蛋白質(zhì)或酶而抗炎；生物堿類抑制NO 產(chǎn)生而抗炎；魚腥草素對大腸桿菌、金葡球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、假絲酵母等具有一定的抑菌效果；成分甲基正壬酮、月桂醛、辛醛等具有直接抗Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）、流感病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的活性；成分槲皮素、槲皮苷和異槲皮苷可通過抑制NF-κB 激活而抑制HSV-2 感染；總黃酮和多酚具顯著清除羥基、超氧陰離子自由基的能力。此外，還有研究表明，魚腥草可抑制或阻止高滲透壓、VEGF 高表達(dá)所致的角膜上皮損傷［29］。這些研究結(jié)果不但證實(shí)本研究的分析結(jié)果：魚腥草的潛在靶點(diǎn)顯著富集于與炎癥、感染（細(xì)菌、寄生蟲）、免疫相關(guān)通路，還暗示魚腥草對細(xì)菌、病毒、寄生蟲病因性角膜炎存在潛在治療作用。

綜上所述，魚腥草中（R）-芳樟醇（9）、新綠原酸（17）、綠蓮皂苷元（19）等活性成分可能作用于MAPK8、CD38、TNF 等靶點(diǎn)，通過IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、百日咳等信號通路而發(fā)揮抗炎、抑菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫等活性作用。因此，“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”是魚腥草達(dá)成治療細(xì)菌、病毒、真菌、外傷、免疫力低下等各種病因性角膜炎的根本途徑，也是角膜炎的治則、治法所在，既為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也奠定了后續(xù)進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。