徐 千 陳媛媛 王林偉 熊 斌

1腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心 湖北 武漢 430071；武漢大學(xué)中南醫(yī)院 2胃腸外科，3腫瘤放化療科 湖北 武漢 430071

多標(biāo)記熒光染色技術(shù)是利用不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)或生物親和反應(yīng)等方法，同時(shí)標(biāo)記多個(gè)靶標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)的實(shí)時(shí)成像和分析的染色技術(shù)，是基礎(chǔ)研究和臨床診斷中實(shí)現(xiàn)多分子成像和分析的重要工具［1，2］。目前，熒光染色中廣泛使用的熒光染料包括熒光蛋白和小分子有機(jī)熒光染料，上述傳統(tǒng)的熒光染料存在光化學(xué)穩(wěn)定性差、激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬等缺點(diǎn)，且需要不同波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，存在發(fā)射光譜交疊和紅色拖尾等現(xiàn)象，難以進(jìn)行實(shí)時(shí)的多分子成像［3，4］。與之相比，量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）作為一種具有優(yōu)良光學(xué)性能的半導(dǎo)體納米晶體，具有一元激發(fā)多元發(fā)射、抗光漂白和化學(xué)降解強(qiáng)、熒光強(qiáng)度高、發(fā)射光譜窄且對(duì)稱、不易出現(xiàn)光譜重疊等優(yōu)勢(shì)，常用于多靶標(biāo)分子的研究［5-7］。然而，當(dāng)靶標(biāo)一抗種屬來(lái)源相同時(shí)，多標(biāo)記熒光染色會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，限制了其在多分子成像中的應(yīng)用。

本研究擬使用多色QDs 對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌組織中細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）、人類表皮生長(zhǎng)因子受 體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，探討QDs 多標(biāo)記染色的優(yōu)勢(shì)，并對(duì)如何避免同種屬來(lái)源一抗的交叉反應(yīng)等問(wèn)題進(jìn)行分析討論，從而建立同種屬來(lái)源一抗間接法三標(biāo)記QDs 熒光染色方案。

1 材料與方法

1.1 主要試劑一抗：小鼠抗人CK 單克隆抗體、兔抗人ER 單克隆抗體購(gòu)自Dako 公司，兔抗人HER-2 單克隆抗體購(gòu)自Cell Marque 公司。QDs 試劑：QDs-565 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、QDs-605 標(biāo)記的山羊抗兔二抗、QDs-655 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Thermo Fisher 公司?？乖迯?fù)緩沖液（EDTA法）、EliVisionTMplus Polyer HRP 二抗試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。QDs 和常用熒光染料的激發(fā)與發(fā)射光譜見圖1。

圖1 QDs 和常用熒光染料的激發(fā)與發(fā)射光譜

1.2 組織切片28 例浸潤(rùn)性乳腺癌（非特殊類型）患者的乳腺癌組織標(biāo)本收集于武漢大學(xué)人民醫(yī)院，組織標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片。28 例乳腺癌組織標(biāo)本主要包括：CK（+），HER-2（陽(yáng)性），ER（+）10 例；CK（+），HER-2（陽(yáng)性），ER（-）7 例；CK（+），HER-2（-）8 例，ER（+）；CK（+），HER-2（陰性），ER（-）3 例。

1.3 免疫組織化學(xué)EliVision 二步法免疫組織化學(xué)染色采用EliVision 二步法進(jìn)行。其中CK 的工作濃度為1∶200，HER-2 的工作濃度為1∶100，ER 的工作濃度為1∶100。CK（+）定義為低倍鏡下可見的胞質(zhì)著色、ER（+）定義為＞1%的腫瘤細(xì)胞核染色、HER-2 陽(yáng)性定義為＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜染色。

1.4 間接法單標(biāo)記熒光染色間接法單標(biāo)記熒光染色主要流程為：石蠟切片60 ℃烤片2 h，置入二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min，梯度乙醇入水后，PBS 洗3 次，每次3 min。在高壓鍋內(nèi)加入稀釋好的EDTA修復(fù)液（pH 8.0）進(jìn)行加熱，煮沸后放入切片，繼續(xù)加熱至壓力閥開始噴氣，關(guān)閉壓力閥，4 min 后打開壓力閥停止加熱，切片冷卻至室溫。5%BSA 37 ℃封閉半小時(shí)，甩去BSA 后，每張切片上滴加50 μL一抗稀釋液，4 ℃過(guò)夜；PBS 洗3 次，每張切片上滴加50 μL QDs 標(biāo)記二抗稀釋液，37 ℃下孵育1 h；PBS洗3 次，50%甘油封片后于CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)下觀察拍照。其中一抗CK、HER-2、ER 工作濃度同1.3，二抗QDs-565、QDs-605、QDs-655 工作濃度1∶200。

1.5 間接法三標(biāo)記熒光染色間接法三標(biāo)記熒光染色過(guò)程如圖2A 所示。主要流程為：石蠟切片60 ℃烤片2 h，置入二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min，梯度乙醇入水后，PBS 洗3 次，每次3 min，對(duì)抗原進(jìn)行高壓熱修復(fù)（見1.4），5%BSA 37 ℃封閉半小時(shí)，甩去BSA 后，每張切片上滴加50 μL 小鼠抗人CK單克隆抗體和兔抗人HER-2 單克隆抗體的一抗混合液，CK 工作濃度1∶200，HER-2 工作濃度1∶100，4 ℃過(guò) 夜；PBS 洗3 次，每 張 切 片 上 滴 加50 μL QDs-565 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗和QDs-655 標(biāo)記的山羊抗兔二抗的二抗混合液，QDs-565 工作濃度1∶200、QDs-655 工作濃度1∶100，37 ℃下孵育1 h；PBS 洗3 次，每張切片上滴加50 μL 兔抗人ER 單克隆抗體的一抗稀釋液，ER 工作濃度1∶100，常溫下孵 育2 h；PBS 洗3 次，每 張 切 片 上 再 滴 加50 μL QDs-605 標(biāo)記的山羊抗兔二抗的稀釋液，QDs-605工作濃度1∶200，常溫下孵育2 h，PBS 洗3 次；50%甘油封片后于CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)下觀察拍照。

圖2 QDs 熒光染色和圖像采集分析

1.6 圖像采集和分析圖像采集和分析過(guò)程如圖2B→2D，在200 倍鏡下，使用裝備有CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)（劍橋研究和儀器股份有限公司，美國(guó)）的Olympus BX51 熒光顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)有限公司，日本），同時(shí)采集CK、HER-2、ER 的熒光光譜信息，采集參數(shù)為：采集光譜區(qū)間420 至720 nm，采集光譜間隔10 nm，曝光時(shí)間800 ms，采集的圖像保存為cube 格式。圖像采集完成后，使用CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)內(nèi)的軟件包進(jìn)行CK、HER-2、ER 光譜信息的分離和分析。該過(guò)程包括以下3 個(gè)關(guān)鍵步驟。

（1）不同光譜值靶標(biāo)的選擇：在CRi Nuance 多光譜軟件操作面板上，準(zhǔn)確選擇CK（565 nm）、HER-2（655 nm）、ER（605 nm）三個(gè)靶標(biāo)的區(qū)域和組織自發(fā)熒光（由軟件自動(dòng)化設(shè)置）區(qū)域，分別將其定義為綠色、紅色、品紅色和藍(lán)色。

（2）靶標(biāo)圖像的分離和組織自發(fā)熒光的消除：基于上述選擇的三個(gè)靶標(biāo)的特定光譜，應(yīng)用CRi Nuance 多光譜軟件將含有光譜信息的cube 圖像分離為4 個(gè)圖像，即綠色熒光信號(hào)的CK 圖、紅色熒光信號(hào)的HER-2 圖、品紅色熒光信號(hào)的ER 圖和藍(lán)色熒光信號(hào)的背景圖，通過(guò)該步驟，從靶標(biāo)信號(hào)中消除組織自發(fā)熒光。

（3）靶標(biāo)光譜信號(hào)的分析：應(yīng)用CRi Nuance 多光譜系統(tǒng)自動(dòng)化分析CK、HER-2、ER 光譜信號(hào)。

1.7 不同靶標(biāo)分子的亞細(xì)胞定位分析從采集的熒光圖像中選取了具有代表性的單個(gè)乳腺癌細(xì)胞，對(duì)其軸徑進(jìn)行劃線（黃色虛線），使用CRi Nuance 多光譜軟件的共定位分析（Co-localization）功能對(duì)軸徑上3 種靶標(biāo)的熒光灰度值分布進(jìn)行分析。以CK、HER-2、ER 3 種靶標(biāo)的熒光信號(hào)的灰度值作為縱坐標(biāo)，距黃色虛線起點(diǎn)距離作為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，分析3 種靶標(biāo)的亞細(xì)胞定位和在熒光圖像上的重疊情況。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色和QDs 熒光染色免疫組化染色和QDs 熒光染色的結(jié)果如圖3 所示。免疫組化染色顯示CK、HER-2 和ER 分別表達(dá)于胞質(zhì)、胞膜和胞核中，QDs 熒光染色經(jīng)過(guò)Nuance 多光譜軟件分離后，其中的CK、HER-2、ER 三種靶標(biāo)分別呈現(xiàn)綠色、紅色和品紅色熒光，而組織自發(fā)熒光呈現(xiàn)藍(lán)色，與靶標(biāo)熒光分離清楚。免疫組化染色和QDs 熒光染色都能較清楚地顯示靶標(biāo)的亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況，QDs 熒光染色可以對(duì)背景熒光進(jìn)行去除，顯示出靶標(biāo)單獨(dú)的熒光信號(hào)。

圖3 免疫組化染色和QDs 熒光染色

2.2 不同CK、HER-2、ER 表達(dá)水平乳腺癌組織的熒光染色不同CK、HER-2、ER 表達(dá)水平乳腺癌組織的熒光染色如圖4 所示，“Multi”為CRi Nuance多光譜軟件采集的三靶標(biāo)熒光圖像，“CK”、“HER-2”、“ER”分別為分離后的CK、HER-2、ER 熒光 圖 像。 圖4A1、4A2、4A3 和4A4 分 別 對(duì) 應(yīng)CK（+）、HER-2（陽(yáng)性）、ER（+），CK（+）、HER-2（陰性）、ER（+），CK（+）、HER-2（陽(yáng)性）、ER（-）和CK（+）、HER-2（陰性）、ER（-）等4 種不同CK、HER-2、ER 表達(dá)水平的多標(biāo)熒光圖像。經(jīng)過(guò)Nuance 多光譜軟件分離后的圖像，可以清楚顯示CK、HER-2 和ER 的表達(dá)。CK 主要表達(dá)于胞質(zhì)中，呈QDs-565 標(biāo)記的綠色。HER-2 主要表達(dá)于胞膜上，呈QDs-655 標(biāo)記的紅色。ER 主要表達(dá)于胞核中，呈QDs-605 標(biāo)記的品紅色。藍(lán)色熒光圖像呈現(xiàn)組織的輪廓，代表組織自發(fā)成像。不同CK、HER-2 和ER 表達(dá)水平乳腺癌組織的熒光染色與患者原始的免疫組化結(jié)果一致。

圖4 不同CK、HER-2 和ER 表達(dá)水平的熒光染色

2.3 乳腺癌細(xì)胞中HER-2、ER、CK 的亞細(xì)胞定位為了研究三種靶標(biāo)的亞細(xì)胞定位和在熒光圖像上的重疊情況，本研究從采集的熒光圖像中選取了單個(gè)乳腺癌細(xì)胞，對(duì)其軸徑進(jìn)行劃線并使用CRi Nuance 多光譜軟件進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析（圖5）。結(jié)果顯示，胞核中ER 的品紅色信號(hào)與胞膜上HER-2 的紅色信號(hào)、胞質(zhì)中CK 的綠色信號(hào)在空間上分離清楚，相互交疊的部分較少。而胞膜上HER-2 的紅色信號(hào)與胞質(zhì)中CK 的綠色信號(hào)在空間上存在小部分交疊，但可經(jīng)CRi Nuance 多光譜軟件進(jìn)行完全分離，顯示各自的亞細(xì)胞定位。

圖5 單個(gè)乳腺癌細(xì)胞中CK、ER 和HER-2 的亞細(xì)胞定位

3 討論

多標(biāo)記熒光染色方法主要分為直接法和間接法兩種方法，直接法利用熒光染料直接標(biāo)記多種抗體，對(duì)目標(biāo)組織中的靶標(biāo)分子進(jìn)行顯色［8］。間接法則先通過(guò)不同一抗孵育靶標(biāo)分子，再使用多種熒光染料標(biāo)記的二抗與對(duì)應(yīng)的一抗結(jié)合，對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行顯色。與直接法多標(biāo)染色相比，間接法多標(biāo)染色具有特異性佳、敏感性好、操作簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等優(yōu)勢(shì)，是目前多標(biāo)記熒光染色的最常使用方法［9］。間接法多標(biāo)染色中二抗與一抗Fc 段的結(jié)合是非特異性的，要求標(biāo)記目標(biāo)分子的一抗種屬來(lái)源不同，以避免二抗非特異性連接多個(gè)靶標(biāo)一抗，造成交叉染色［10］。但在實(shí)際研究過(guò)程中，經(jīng)常遇到一抗種屬來(lái)源相同的情況，限制了間接法多標(biāo)記熒光染色的應(yīng)用［11］。開發(fā)新型多標(biāo)記染色技術(shù)，降低同種屬來(lái)源一抗交叉染色的影響，對(duì)基礎(chǔ)研究和臨床診斷具有重要意義。如圖1 所示，傳統(tǒng)熒光染料存在光化學(xué)穩(wěn)定性差、激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜寬等缺點(diǎn)，需要不同波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，發(fā)射光存在光譜重疊和紅色拖尾等現(xiàn)象。因此，使用傳統(tǒng)熒光染料克服一抗種屬來(lái)源限制，進(jìn)行間接法多標(biāo)記熒光染色較為困難。而QDs 作為新型熒光材料，具有抗光漂白和化學(xué)降解強(qiáng)、熒光強(qiáng)度高等優(yōu)勢(shì)，且QDs 的激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄，發(fā)射光譜不易重疊，可在一元激發(fā)下進(jìn)行多色成像。同時(shí)使用多種QDs 標(biāo)記靶標(biāo)分子，發(fā)出的熒光信號(hào)較易進(jìn)行分離［12，13］。因此，本研究利用多色QDs 對(duì)乳腺癌中CK、ER、HER-2 多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行了間接法熒光染色，證實(shí)了同種屬來(lái)源一抗多標(biāo)記染色的可能性和應(yīng)用效果。

本課題組之前的研究表明，對(duì)于單個(gè)靶標(biāo)，QDs熒光染色和免疫組化染色均能顯示靶標(biāo)的亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況，染色結(jié)果有較好的相關(guān)性和一致性，這與本次研究的結(jié)果一致（圖3）［14，15］。隨后本研 究 利 用QDs-565、QDs-655 和QDs-605 三 種 顏 色的量子點(diǎn)對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌組織中CK、HER-2 和ER三個(gè)靶標(biāo)分子進(jìn)行熒光染色，其中CK 一抗種屬為小鼠抗人，而HER-2 和ER 一抗種屬均為兔抗人，通過(guò)順序法先利用QDs-565、QDs-655 對(duì)CK、HER-2進(jìn)行雙標(biāo)記染色，再利用QDs-605 對(duì)同種屬的ER進(jìn)行染色，并使用CRi Nuance 多光譜軟件采集熒光圖像。Nuance 多光譜軟件光譜分離后三靶標(biāo)熒光染色結(jié)果顯示，綠色QDs-565 標(biāo)記了主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)的CK，呈現(xiàn)出癌巢的輪廓。而紅色QDs-655 和品紅色QDs-605 分別標(biāo)記了表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜的HER-2 和細(xì)胞核的ER。兩種同種屬來(lái)源的一抗HER-2 和ER 未發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)，針對(duì)不同CK、HER-2 和ER 表達(dá)水平乳腺癌組織的熒光染色效果滿意（圖4）。對(duì)三種靶標(biāo)的亞細(xì)胞定位分析顯示，胞核中ER 的品紅色信號(hào)與胞膜上HER-2的紅色信號(hào)和胞質(zhì)中CK 的綠色信號(hào)在空間上分離清楚，未發(fā)生明顯光譜重疊現(xiàn)象。而胞膜上HER-2的紅色信號(hào)與胞質(zhì)中CK 的綠色信號(hào)在空間上存在小部分交疊，但可經(jīng)CRi Nuance 多光譜軟件進(jìn)行完全分離，顯示各自的亞細(xì)胞定位（圖5）。

同種屬來(lái)源一抗發(fā)生交叉反應(yīng)可由多種原因?qū)е?。第一，若第一輪二抗（二抗A）不足以封閉一抗（一抗A）所有的結(jié)合位點(diǎn)，第二輪二抗（二抗B）將與一抗A 余留的位點(diǎn)結(jié)合。針對(duì)這種情況，在第一輪染色過(guò)程中我們使用了濃度1∶100 的QDs-655，高于推薦濃度，同時(shí)在37 ℃下進(jìn)行孵育，使一抗A 與二抗A 充分結(jié)合。第二，若第一輪染色結(jié)束后漂洗不充分，殘余的二抗A 將與第二輪一抗（一抗B）結(jié)合。針對(duì)這種情況，使用PBS 徹底漂洗可避免。第三，在第二輪染色過(guò)程中，已結(jié)合的一抗A 和二抗A 由于溫度、漂洗等因素再次分離，引起二抗A 和二抗B 的交叉染色。針對(duì)這種情況，在第二輪染色過(guò)程中，我們?cè)诔叵逻M(jìn)行孵育，同時(shí)降低了漂洗的力度，防止二抗A 從一抗A 上脫離。除了對(duì)抗體濃度、孵育時(shí)間、封閉條件、清洗程度進(jìn)行優(yōu)化外，也有研究報(bào)道了其他預(yù)防同源一抗交叉染色的方法。Xing 等［16］認(rèn)為在順序法熒光染色中，在孵育第二輪一抗前，用無(wú)標(biāo)記的二抗孵育組織，使第一輪一抗的結(jié)合位點(diǎn)飽和，能降低QDs 二抗的交叉染色。Liu 等［17］報(bào)道通過(guò)甲醛、戊二醛或碳二亞胺交聯(lián)QDs-抗體-抗原復(fù)合物，可避免QDs-二抗從一抗結(jié)合位點(diǎn)分離，結(jié)合到其他同源一抗上引起交叉染色。此外，多項(xiàng)研究［18-20］應(yīng)用了一種酪酰胺信號(hào)放大技術(shù)，利用酪酰胺的過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，與周圍的蛋白殘基結(jié)合，在抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的生物素沉積，生物素與隨后加入的鏈霉素-熒光基團(tuán)結(jié)合，每一輪染色后非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗脫，而共價(jià)結(jié)合的熒光基團(tuán)留存在組織上，進(jìn)而克服抗體交叉反應(yīng)和一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，基于此的Opal/TSA 多標(biāo)記病理切片染色方案，可用于多達(dá)7～10 種標(biāo)記的同步染色和共定位及定量分析［21，22］。

除了克服了一抗種屬來(lái)源限制外，QDs 的優(yōu)良光學(xué)特性還保證了多重染色的成像效果。QDs 的發(fā)射光譜呈現(xiàn)窄且對(duì)稱的特點(diǎn)，結(jié)合CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)，無(wú)論是三種以上色調(diào)的多重染色，還是位于同一區(qū)域多種抗原的染色，都可以對(duì)相應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行單獨(dú)分離和分析，而不會(huì)發(fā)生光譜交疊，造成目標(biāo)信號(hào)間的干擾。

綜上，本研究中建立的基于多色QDs 的間接法多標(biāo)記熒光染色方案，通過(guò)調(diào)整抗體濃度、優(yōu)化孵育時(shí)間、徹底清洗等手段，可較好地避免一抗種屬來(lái)源相同時(shí)的交叉染色，達(dá)到了同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物靶標(biāo)的目的。利用CRi Nuance 多光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)熒光圖像采集，有利于對(duì)單個(gè)靶標(biāo)分子進(jìn)行分離和亞細(xì)胞定位，實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的光譜定量分析。兩者結(jié)合建立的新型多分子成像技術(shù)，有助于將來(lái)進(jìn)行深度的多分子成像和研究。