杜鑫澤，馬鑫浩，張殿琦，杜嘉偉，馬 婧，謝琨成，何 杰，昝林森，2

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；2.國家肉牛改良中心，楊凌 712100；3.西安市奶牛育種中心，西安 710000)

在雄性哺乳動物中，精子發(fā)生是一個復雜且受多種途徑精密調(diào)控的生理過程，主要經(jīng)歷4個階段：第一階段，A0型精原細胞有絲分裂經(jīng)歷A1-A4精原細胞、中間型精原細胞、B型精原細胞并最終形成初級精母細胞；第二階段，初級精母細胞開始第一次減數(shù)分裂形成次級精母細胞；第三階段，初級精母細胞進行第二次減數(shù)分裂形成圓形精子細胞；第四階段，圓形精子細胞經(jīng)過一系列變形分化為成熟精子[1]。在精子發(fā)生的整個過程中，雄性生殖細胞分化過程具有復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，除了編碼蛋白質(zhì)的mRNA外，許多非編碼RNA如微小RNA(microRNA,miRNA)、piwi相互作用RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)、環(huán)狀RNA(circularRNA,circRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)等都發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。

miRNA是一類進化上高度保守的長度在22 nt左右的小分子非編碼RNA，miRNA可以參與調(diào)控包括性成熟、睪丸發(fā)育、精子發(fā)生在內(nèi)的諸多生物學過程，其在精子發(fā)生過程中以細胞特異性或階段特異性方式表達[2]。靶向mRNA的3′-UTR以實現(xiàn)基因沉默是miRNA的經(jīng)典作用機制[3]，miRNA常通過與靶向mRNA的3′-UTR中的互補序列結合，并通過與多蛋白RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)相互作用來加速轉(zhuǎn)錄物衰減或翻譯抑制來抑制基因表達[4]。miRNA在眾多生物學途徑中的作用突出了轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的復雜性。研究表明，miRNA的表達具有較強的組織特異性，表明miRNA在不同組織、不同生物學過程中具有獨特的功能。miRNA因其在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中占據(jù)主導地位而被深入研究并廣泛應用于諸多領域[5]。就畜牧生產(chǎn)而言，種公畜的繁殖性能被育種學家高度關注，因此，探究miRNA對家畜精子發(fā)生的影響和作用機制成為了農(nóng)業(yè)科學研究的熱點之一[6]。

miR-34家族由3個成員組成，分別是miR-34a、miR-34b和miR-34c。miR-34b/c在精子發(fā)生過程中具有多種功能，既可以調(diào)節(jié)減數(shù)分裂過程，也可以調(diào)節(jié)精子發(fā)生后期的變形和獲能等生物學過程。研究證明，多種動物的精子中含有miR-34b/c，這些成員在精子發(fā)生[7]和早期胚胎發(fā)育[8]中發(fā)揮著重要作用。miR-449家族也由3個成員組成，分別是miR-449a、miR-449b和miR-449c，它們被定位到Cdc20b基因的第2個內(nèi)含子上，形成一個miRNA簇，在不同物種間高度保守。miR-449成員在控制細胞周期和表皮分化中起主要作用[9]。報道顯示，miR-34/449家族在纖毛發(fā)生[10]、細胞周期調(diào)節(jié)[11]、細胞分化[12]、癌癥[13]等多種生物學過程中發(fā)揮作用。雖然miR-34和miR-449最初被指定為單獨的miR家族，但miR-34與miR-449家族成員具有相同的種子序列，且miR-34和miR-449被證明可以調(diào)節(jié)一組相同的靶基因，因此可以被視為一個miRNA簇，命名為miR-34/449[14]。鑒于這2個家族成員在基因表達調(diào)控中可能一起發(fā)揮作用，且2個基因家族之間具有相互代償機制，本研究利用生物信息學方法探究miR-34b/c、miR-449a/b/c在牛精子發(fā)生中的作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡，通過預測共同調(diào)控miR-34b/c、miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)以及受miR-34b/c、miR-449a/b/c共同調(diào)控的靶基因以構建miR-34b/c、miR-449a/b/c的分子調(diào)控網(wǎng)絡，以期為后續(xù)miR-34b/c和miR-449a/b/c調(diào)控牛精子發(fā)生的相關研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

牛(Bostaurus,bta)、人(Homosapiens,hsa)、小鼠(Musmusculus,mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus,rno)、雞(Gallusgallus,gga)和豬(Susscrofa,ssc)等物種的miR-34b/c、miR-449a/b/c及其前體的序列信息來源于 miRBase(http:∥mirbase.org/index.shtml)在線數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 miR-34b/c和miR-449a/b/c的相似性分析 利用MegaX[15]軟件對miR-34b/c和miR-449a/b/c前體序列分別進行多序列比對，并計算各模型組合的BIC分數(shù)(Bayesian information criterion)，選取BIC分數(shù)最低的模型組合，即最大似然估計法(maximum likelihood)、Jukes-Cantor模型和Gamma分布分別構建miR-34b/c和miR-449a/b/c的系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 bta-miR34/449靶基因預測 通過在線軟件TargetScan 7.2(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)[16]、miRDB(http:∥www.mirdb.org/)[17]和miRWalk(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)[18]預測bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的靶基因，取三者預測結果的交集作為bta-miR34/449的靶基因。

1.2.3 靶基因功能預測 根據(jù)靶基因預測結果，選取bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c共同作用的靶基因。分別使用在線軟件DAVID 5.8(https:∥david.ncifcrf.gov/)[19]和KOBAS(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/)[20]對其進行GO功能和KEGG通路富集分析(物種為牛)，收集調(diào)整后P<0.05的條目并使用R語言程序包ggplot2繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子預測 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的前體序列，使用AnimalTFDB(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)[21]對其上游2 kb至上游0.1 kb的序列進行轉(zhuǎn)錄因子結合位點預測，獲取可能調(diào)控bta-miR-34/449的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.5 構建TF-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡 選取同時調(diào)控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子，結合靶基因預測和String在線數(shù)據(jù)庫(http:∥string-db.org/)[22]構建蛋白互作網(wǎng)絡，使用Cytoscape 3.8.0在線軟件(http:∥www.cytoscape.org/)[23]構建TF-miR-34/449-mRNA作用網(wǎng)絡圖。

2 結 果

2.1 miR-34/499的相似性分析

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫的查詢結果，牛miR-34/499分別位于第15和20號染色體上，對比牛、人、小鼠、大鼠、雞和豬等物種的miR-34/449序列并構建系統(tǒng)進化樹，結合序列比對發(fā)現(xiàn)，miR-34/449在進化中相對保守，成熟體序列基本一致(表1、2，圖1)。

表1 各物種miR-34b/c的成熟序列

表2 各物種miR-449a/b/c的成熟序列

圖1 ML法構建miR-34b/c(A)、miR-449a/b/c(B)系統(tǒng)進化樹

2.2 靶基因預測

通過在線軟件TargetScan、miRDB和miRWalk對bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的靶基因進行預測，取三者的交集分別得到了115、151、161、149和152個靶基因(圖2)。

A，bta-miR-34b；B，bta-miR-34c；C，bta-miR-449a；D，bta-miR-449b；E，bta-miR-449c

2.3 靶基因功能預測

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c共同作用的靶基因分別為73和80個，用于功能分析的靶基因為49個(圖3、表3)，如SYT1、SNX15、LGI1、ELMOD1、RCAN1等。對靶基因集進行GO功能和KEGG通路富集分析，結果顯示，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因主要富集在精子發(fā)生、鈣離子依賴性胞吐的調(diào)節(jié)、胰島素分泌的調(diào)節(jié)等GO條目，以及HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路、Wnt信號通路等KEGG通路(圖4)。

A，bta-miR-34b∩bta-miR-34c；B，bta-miR-449a∩bta-miR-449b∩bta-miR-449c；C，bta-miR-34b/c∩bta-miR-449a/b/c。圖5同

表3 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的共同靶基因

圖4 靶基因的GO功能(A)和KEGG通路(B)富集分析

2.4 轉(zhuǎn)錄因子預測

預測到bta-miR-34b和bta-miR-34c共同的轉(zhuǎn)錄因子有77個，bta-miR-449a、bta-miR-449b和bta-miR-449c共同的轉(zhuǎn)錄因子有17個，以上5個miRNAs共同的轉(zhuǎn)錄因子有2個(圖5、表4)，分別為核受體亞家族2C組成員2(nuclear receptor subfamily 2C group member 2,NR2C2)和HICZBTB轉(zhuǎn)錄抑制因子1(HIC ZBTB transcriptional repressor 1,HIC1)。

圖5 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子預測

表4 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子

2.5 TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡的構建

根據(jù)bta-miR-34/449預測的轉(zhuǎn)錄因子、靶基因以及蛋白間互作關系構建TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡，結果顯示，bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c對精子發(fā)生的調(diào)控作用通過其與上游轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因共同構成的TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡發(fā)揮作用，bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c受到上游轉(zhuǎn)錄因子NR2C2和HIC1的調(diào)控，同時會抑制AXL、E2F3、DAAM1等下游靶基因的表達，以實現(xiàn)對精子發(fā)生的生物學調(diào)控(圖6)。

圖6 TF-bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c-mRNA作用網(wǎng)絡

3 討 論

在基因表達過程中，miRNA能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因的表達，miRNA是基因表達的關鍵調(diào)節(jié)因子，有望成為生物標志物開發(fā)的候選分子。單個miRNA可以靶向數(shù)百個mRNA并影響許多基因的表達[24]。精子發(fā)生過程是雄性動物得以產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)精子的重要生物學過程，miRNA已被證明參與精子發(fā)生的各個時期[25]。miR-34家族可以靶向許多細胞周期調(diào)節(jié)因子，如Notch1、CDK4和MYC，且TGIF2和Notch2在精子發(fā)生過程中是miR-34c的2個重要靶基因，Notch信號能夠促進生殖細胞的分化[26]。有報道稱，miR-34c在精母細胞和圓形精子細胞中高表達，抑制原代精母細胞中的miR-34c可以防止生殖細胞免受睪酮剝奪誘導的細胞凋亡，在體外培養(yǎng)的生殖細胞中miR-34c的過度表達會觸發(fā)細胞凋亡[27-28]。miR-449家族成員也在精子發(fā)生中扮演著重要角色，miR-449a、miR-449b和miR-449c在減數(shù)分裂開始期間上調(diào)，并優(yōu)先在精母細胞和精子細胞中表達[29]。大量研究已經(jīng)揭示了miRNA-34和miR-449家族對精子發(fā)生各個時期的調(diào)控作用及機制，但其對精子發(fā)生過程中上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因構成的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡還有待進一步挖掘。

本研究通過查詢miRBase在線數(shù)據(jù)庫中牛、人、小鼠、大鼠等物種的miR-34b/c、miR-449a/b/c及其前體序列信息，運用相似性分析以及miRNA轉(zhuǎn)錄因子、靶基因預測、富集分析等技術手段對bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的序列保守性、上下游調(diào)控機制及功能進行分析，得到了49個共同靶基因和2個轉(zhuǎn)錄因子，其中，靶基因和轉(zhuǎn)錄因子的篩選通過在線數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDB、miRWalk及AnimalTFDB實現(xiàn)，以上數(shù)據(jù)庫均包含牛的相關信息或支持通過序列直接預測，盡管miRNA在物種間具有較強的序列保守性，但是使用其他物種miRNA的相關信息預測牛miRNA的靶基因或轉(zhuǎn)錄因子仍然不是最優(yōu)選擇，因此本試驗通過對預測工具的合理選擇在一定程度上提高了研究結果的準確性。

本研究預測到的2個轉(zhuǎn)錄因子(NR2C2和HIC1)在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。NR2C2也被稱為睪丸核受體4(testicular orphan receptor 4，TR4)，是核受體家族的成員[30]。在小鼠睪丸中，NR2C2主要表達于初級精母細胞和圓形精子細胞中，并在精子發(fā)生的減數(shù)分裂前期和連續(xù)減數(shù)分裂前期起重要作用。NR2C2基因敲除小鼠的生殖潛能顯著降低，各個階段的精子數(shù)量明顯降低，初級精母細胞降解，生精小管壞死扭曲，精子發(fā)生減數(shù)分裂前期和連續(xù)減數(shù)分裂期延長和中斷，導致細胞分裂中期延長和生精細胞異常[31]。HIC1是一種鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子，可通過與沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物1(sirtuin 1，SIRT1)啟動子結合，控制細胞生長和死亡，以響應p53依賴性凋亡DNA損傷[32]。Jenal等[33]研究發(fā)現(xiàn)，HIC1是細胞周期和凋亡調(diào)節(jié)因子E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)的新轉(zhuǎn)錄靶點，E2F1通過包含HIC1 P0啟動子上的TATA盒在內(nèi)的2個E2F DNA結合位點誘導HIC1的表達。HIC1與包含HIC1結合共有位點的E2F1啟動子基因結合，通過調(diào)控E2F1轉(zhuǎn)錄抑制細胞生長。Uchida等[34]研究證明，HIC1缺失促進青春期前睪丸平滑肌細胞的增殖，導致成年睪丸中生精小管周圍的PMC數(shù)量增加，并最終影響精子發(fā)生。

本研究篩選到的部分靶基因已有報道顯示參與調(diào)控了精子發(fā)生過程。受體酪氨酸激酶AXL是TAM家族的成員，在細胞增殖、分化、凋亡和新陳代謝等生物學過程中發(fā)揮著重要作用[35]。AXL是牛睪丸支持細胞中miR-34c的直接靶基因，miRNA-34c通過靶向AXL基因調(diào)節(jié)牛支持細胞增殖和凋亡[36]。E2F3是E2F家族中的一員，是唯一被發(fā)現(xiàn)在精原細胞、細線期精母細胞和支持細胞中表達的E2F成員。在支持細胞特異性視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(RB)敲除小鼠睪丸內(nèi)注射shRNA-E2F3，結果顯示，支持細胞中因RB缺失引起的生精功能障礙通過E2F3的體內(nèi)沉默得到部分恢復[37]，暗示RB/E2F3途徑在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。形態(tài)發(fā)生相關激活因子1(dishevelled associated activator of morphogenesis 1,DAAM1)是一種formin家族蛋白，通過Wnt信號通路參與非支鏈肌動蛋白絲的成核、形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)生等重要生物學過程[38]。Pariante等[39]評估了DAAM1與大鼠睪丸形態(tài)發(fā)生的可能關聯(lián)，結果顯示，在有絲分裂階段，DAAM1與支持細胞、生殖細胞和精原細胞中的肌動蛋白共享其定位，在減數(shù)分裂期間，2種蛋白都存在于精母細胞中，而在形成的血睪丸屏障中只能檢測到肌動蛋白，DAAM1在整個精子發(fā)生過程中跟隨頂體系統(tǒng)的發(fā)展，最終保留在成熟精子的細胞質(zhì)內(nèi)。乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)在精子能量代謝過程中起重要作用，熱應激能夠增加豬睪丸中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3(glucose transporter type 3,GLUT3)和LDHA的表達，繼而增加支持細胞中乳酸產(chǎn)生[40]。小鼠中乳酸脫氫酶C(lactate dehydrogenase C,LDHC)基因的缺失導致精子無法獲能并在精卵結合中不能穿過透明帶[41]，而LDHA作為轉(zhuǎn)基因引入LDHC缺失小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠獲得了正常的精子功能和生育能力[42]。Klinefelter綜合征(Klinefelter syndrome,KS)是男性性腺機能減退和性染色體異常的遺傳疾病，患有KS的男性睪丸中LDHA mRNA的表達量減少與睪丸內(nèi)乳酸含量的下降相關[40]。以上證據(jù)不同程度地印證了本研究預測的靶基因在精子發(fā)生中扮演著重要角色。此外，本研究預測得到的還沒有被廣泛報道的其他基因也具有進一步研究的價值。

靶基因GO功能富集分析表明，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因主要富集在精子發(fā)生、鈣離子依賴性胞吐的調(diào)節(jié)、胰島素分泌的調(diào)節(jié)等GO條目，推測bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因在精子發(fā)生和精子獲能中起作用。相關報道顯示，miR-34c參與小鼠睪丸精子發(fā)生和雄性生殖細胞(male germ-line stem cells,mGSCs)凋亡的調(diào)節(jié)[7]。miR-34b/c和miR-449a/b/c對于正常精子發(fā)生和男性生育不可或缺[43]。miR-34b和miR-34c存在于與透明帶結合的精子中，表明其可能與精子受精過程有關[8]。KEGG通路富集分析，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因顯著富集在HIF-1信號傳導途徑、甲狀腺激素信號通路和Wnt信號通路等。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是細胞對缺氧反應的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HIF由α亞單位(HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α)和β亞單位(HIF-β)組成，HIF-1α和HIF-2α密切相關，它們與HIF-β亞基的相互作用分別產(chǎn)生HIF-1和HIF-2，HIF-1和HIF-2 2種活性轉(zhuǎn)錄因子均與缺氧反應元件(hypoxia-response element,HRE)結合，刺激與血管生成、能量代謝、細胞生長和細胞周期進展等相關的靶基因調(diào)節(jié)生物學過程[44]。HIF-1α和HIF-2α在睪丸支持細胞中的表達已經(jīng)得到證實[45]，且HIF-2參與促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)對支持細胞增殖的調(diào)節(jié)[46]。Gruber等[47]對出生2 d的小鼠進行HIF-2α消融手術，導致小鼠支持細胞無法建立完整的血睪屏障，并伴有睪丸大小和重量減少，且經(jīng)消融手術處理的小鼠最終不育。本研究中靶基因富集到的另一個重要通路是Wnt信號通路，Wnt信號是一種高度保守的細胞間通信機制。典型的Wnt信號傳導也稱為Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，通常被認為是一種干細胞自我更新機制[48]。原始生殖細胞的特異性分化和雄性胎兒生殖道的正常發(fā)育依賴于Wnt/β-catenin信號傳導[49]。Takase等[50]研究報道，睪丸中Wnt信號通路特別有助于精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSC)的增殖，證實了本研究結果的可靠性。

4 結 論

bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通過上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因組成的分子調(diào)控網(wǎng)絡共同調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程。