史 寧，彭文婷，盧浩成，何 非，王 軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

葡萄是世界上種植規(guī)模最大、產(chǎn)量最多的水果之一[1]，其中75%的葡萄被用來釀造葡萄酒[2]。2018年我國葡萄酒產(chǎn)量已經(jīng)躋身世界前十，是最具葡萄酒生產(chǎn)潛力的國家之一[3]。葡萄酒在釀造過程中會產(chǎn)生大量皮渣，皮渣中含有豐富的酚類物質(zhì)，占果實總酚含量的90%以上[4]。白葡萄在釀酒時，皮渣不經(jīng)過浸漬和發(fā)酵過程，皮渣中的酚類物質(zhì)幾乎沒有損失。

白葡萄皮渣中的酚類物質(zhì)主要為類黃酮類物質(zhì)，包括黃酮醇和黃烷醇兩大類，與葡萄酒中的輔色效應(yīng)密切相關(guān)。GORDILLO B等[5]的研究結(jié)果顯示，發(fā)酵時添加一定比例的白葡萄皮渣能夠增強(qiáng)紅葡萄酒的顏色表現(xiàn)，證明了白葡萄酒副產(chǎn)物作為外源添加劑提高紅葡萄酒酚類潛力的可行性。類黃酮類物質(zhì)不僅能夠賦予葡萄酒艷麗的顏色，其具有的獨特生物活性也能夠?qū)θ说纳眢w起到有效的保健作用。黃烷醇是比較復(fù)雜的一類類黃酮化合物，包括黃烷醇單體和原花青素，主要存在于果皮和種子中，多項研究證明，攝入黃烷醇有利于人體健康[6-7]。黃酮醇主要存在于果皮中，其生物活性通常比其相應(yīng)的黃酮物質(zhì)更強(qiáng)[8]，具有抗過敏[9]、抗炎癥[10]、預(yù)防前列腺癌[11]、預(yù)防心血管疾病[12]和提高運(yùn)動能力[13]等多種藥理功能，還有研究報道攝入黃酮醇能夠降低阿爾茲海默癥患病風(fēng)險[14]。

葡萄酒產(chǎn)業(yè)要達(dá)到可持續(xù)發(fā)展，就需要進(jìn)行減廢，將葡萄皮渣變廢為寶，為葡萄酒產(chǎn)業(yè)帶來更高效益。以往的研究多集中在分析紅葡萄果皮和種子中的酚類物質(zhì)組成和含量上，而對白葡萄果皮和種子中的類黃酮物質(zhì)關(guān)注較少。該研究對6個常見的白葡萄品種果皮和種子中的類黃酮物質(zhì)進(jìn)行檢測，以期為白葡萄皮渣的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

本實驗所用‘霞多麗’（Chardonnay）、‘長相思’（Sauvignon Blanc）、‘小芒森’（Petit Manseng）、‘貴人香’（Italian Riesling）、‘雷司令’（Riesling）和‘維歐尼’（Viognier）白葡萄果實：采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站（40°08′12″N，116°10′45″E）的玻璃溫室。除‘霞多麗’為2015年定植、‘小芒森’2012年定植外，其余品種均定植于2014年。栽植密度為4.0 m×1.0 m，南北行向，水平葉幕，主干高度為2.2 m，每個種植穴定植2株，兩個龍干垂直于行向且反向延伸。葡萄園的管理采用常規(guī)管理，灌溉方式為滴灌。

1.1.2 試劑

類黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（槲皮素、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、甲酸、甲醇、乙腈）（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；乙酸鈉、甲醇（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200系列高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Poroshell120 EC-C18色譜柱（150mm×3.0 mm，2.7 μm）、Agilent 1200系列高效液相色譜儀串聯(lián)離子阱、有可變波長檢測器（variable wavelength detector，VWD）、ZorbaxEclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent科技有限公司；BSA223S天平：賽多利斯有限公司；S63300HBT超聲波儀：上海冠特超聲儀器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Micro 17R離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 果實樣品采集

‘長相思’、‘貴人香’和‘雷司令’于2018年8月21日采集，其余葡萄品種果實于2018年9月7日采集。每個品種共3次重復(fù)，每次重復(fù)選取10穗葡萄，隨機(jī)采集100粒發(fā)育正常且無缺陷的果實為樣品。樣品在液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2 類黃酮類物質(zhì)的提取

（1）凍干粉的制備

對葡萄果實進(jìn)行剝皮/取籽，迅速將果皮/種子置于液氮中冷凍，用粉碎機(jī)打碎后，置于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，得到果皮/種子凍干粉。

（2）果皮黃酮醇的提取

提取果皮黃酮醇的具體操作如下[15]：準(zhǔn)確稱取0.100 g果皮凍干粉于2 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液，低溫避光超聲萃取20 min后，置于離心機(jī)中在4 ℃，8000r/min條件下離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中；將殘渣按上述操作再提取一次，最后將兩次提取的上清液合并搖勻，存于-80 ℃冰箱中待測。

（3）黃烷醇的提取

提取黃烷醇的方法參考LIANG N N等[16]的方法。提取游離黃烷醇的具體操作如下：準(zhǔn)確稱取0.050 g果皮/種子凍干粉于2 mL離心管中，加入500 μL 70%丙酮水溶液（含0.5%抗壞血酸），充分振蕩后離心10 min（4 ℃，8 000 r/min），轉(zhuǎn)移上清液至5 mL離心管中。將殘渣按上述操作再提取兩次，上清液合并搖勻。加入400 μL上清液于2 mL離心管中，避光條件下氮吹至完全吹干。加入200 μL甲醇（含1%鹽酸）溶解，再加入200 μL乙酸鈉水溶液（0.2 mol/L）中和，搖勻后于-80 ℃冰箱中保存待用。提取裂解黃烷醇的具體操作如下：準(zhǔn)確稱取0.100 g果皮/種子凍干粉于2.5 mL離心管中，加入1 mL間苯三酚緩沖液（50 g/L間苯三酚甲醇溶液，0.3 mol/L鹽酸，0.5%抗壞血酸），于50 ℃水浴中避光加熱20 min后，添加1 mL乙酸鈉（0.2 mol/L），反應(yīng)終止。在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。將殘渣按上述操作再提取兩次，上清液合并搖勻，置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 類黃酮類物質(zhì)的檢測

（1）黃酮醇的檢測

采用高效液相色譜儀串聯(lián)離子阱，樣品測定前經(jīng)0.22μm水系濾膜過濾，進(jìn)樣量50 μL。流動相A為水∶甲酸∶乙腈=865∶85∶50（V∶V），流動相B為水∶甲酸∶甲醇∶乙腈=215∶85∶450∶250（V∶V），流動相的流速為0.63 mL/min。洗脫程序根據(jù)文獻(xiàn)[17]進(jìn)行設(shè)定。

（2）黃烷醇的檢測

黃烷醇的檢測采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。樣品測定前經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，進(jìn)樣量1 μL。洗脫采用的流動相A相為0.1%的甲酸水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈-甲醇溶液50∶50（V/V）。檢測器為多反應(yīng)監(jiān)測模式。黃烷醇的洗脫程序根據(jù)文獻(xiàn)[17]分別設(shè)定。

1.3.4 類黃酮類物質(zhì)的定性和定量

黃酮醇的定性依據(jù)為本實驗室所建立的葡萄與葡萄酒酚類物質(zhì)指紋譜庫[18]。定量采用外標(biāo)法，利用Qualitative Analysis of Masshunter軟件進(jìn)行峰面積積分作為定量依據(jù)，通過不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和濃度的線性擬合曲線進(jìn)行定量，其中黃酮醇定量以槲皮素為外標(biāo)物，黃烷醇定量以兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表棓兒茶素為外標(biāo)物。類黃酮類物質(zhì)含量（mg/kg）以果實鮮質(zhì)量表示。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Excel制表，采用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄果實理化指標(biāo)的測定結(jié)果

檢測各品種葡萄果實的基本理化指標(biāo)，結(jié)果見表1。由表1可知，本實驗所用葡萄果實均有較好的成熟度，供試品種果實的pH在3.29～3.87之間，可滴定酸含量在5.19～9.66 g/L之間，可溶性固形物含量在17.2～22.5°Bx之間，其中‘貴人香’（17.18°Bx）和‘雷司令’（18.7°Bx）的可溶性固形物含量顯著低于其他品種（P＜0.05），‘小芒森’可滴定酸（9.66 g/L）含量顯著高于其他品種（P＜0.05），此外‘小芒森’果實的漿果質(zhì)量顯著小于其他品種（P＜0.05）。

表1 葡萄果實的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physiochemical indexes of grapes

2.2 黃酮醇含量的測定結(jié)果

黃酮醇類化合物具有優(yōu)秀的生物活性和輔色能力，主要以糖苷化的形式存在于葡萄果皮中，且它的含量和種類與葡萄品種相關(guān)[19]。葡萄果皮黃酮醇含量檢測結(jié)果見表2。由表2可知，‘小芒森’、‘長相思’和‘雷司令’的黃酮醇含量均在9.50 mg/kg以上，顯著高于其余品種（P＜0.05）。在6個白葡萄品種果皮中共檢測到5種黃酮醇類物質(zhì)，槲皮素含量最高，約占總黃酮醇總量的80%以上，與MATTIVI F等[20]的研究結(jié)果相符，其中‘貴人香’果皮中的槲皮素-3-O-葡萄醛酸苷含量（4.86 mg/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），而槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量（1.60 mg/kg）顯著低于其他品種（P＜0.05）。此外，NOELIA C M等[21]研究調(diào)查了白色品種果皮黃酮醇的特征，在所有白色葡萄品種中均檢測到了山奈酚、異鼠李素和槲皮素，而本實驗僅在‘小芒森’和‘長相思’中檢測到異鼠李素，僅在‘貴人香’和‘雷司令’中檢測到蘆丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，可能是由于樣品種植于玻璃溫室，因紫外光濾減而抑制了葡萄果實黃酮醇的合成，這與LENK S等[22]的研究相符。與紅葡萄品種不同，白色葡萄品種的果皮中沒有檢測到西伯利亞落葉松類黃酮醇、丁香亭和楊梅酮，有研究表明[23-24]，合成這些黃酮醇的基因在白葡萄品種中未表達(dá)。

表2 葡萄果皮黃酮醇含量的測定結(jié)果Table 2 Determination results of content of flavonols in grape peel mg/kg

2.3 黃烷醇含量的測定結(jié)果

黃烷醇類化合物主要以原花青素的形式存在于葡萄果皮和種子中。原花青素具有很強(qiáng)的生物活性，具有抗氧化[25]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[26]、抗腫瘤[27]等作用，且安全無毒[28]，具有很高的利用價值。葡萄果皮中黃烷醇含量見表3，葡萄籽中的黃烷醇含量見表4。

表3 葡萄果皮黃烷醇含量的測定結(jié)果Table 3 Determination results of contents of flavanols in grape peel mg/kg

由表3可知，‘維歐尼’葡萄果皮具有較高含量的原花青素（2.76 g/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），‘小芒森’次之，‘貴人香’果皮中的黃烷醇含量最少。除原花青素外，供試葡萄果皮中的黃烷醇還包括含量較低的兒茶素、表兒茶素和表棓兒茶素，其中‘霞多麗’果皮中的兒茶素含量（6.93 mg/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），‘貴人香’葡萄果皮中的表棓兒茶素含量（1.32 mg/kg FW）顯著低于其他品種（P＜0.05）。此外，表兒茶素僅在‘霞多麗’和‘雷司令’種子中檢測到。由表4可知，與果皮相比，葡萄籽中的各類黃烷醇化合物含量較高，與VIOLETA I等[29]的研究結(jié)果一致。此外，葡萄籽中含有表兒茶素沒食子酸酯，沒食子?；梢蕴岣咂浠钚訹30]?！∶⑸咸炎阎械脑ㄇ嗨睾枯^高，且四種單體黃烷醇的含量也處在較高的水平，而‘長相思’葡萄籽中的原花青素和單體黃烷醇含量較少。與果皮相比，葡萄籽中黃烷醇的含量較高，僅‘維歐尼’葡萄種子中的黃烷醇含量低于果皮。

表4 葡萄籽中黃烷醇含量的測定結(jié)果Table 4 Determination results of contents of flavanols in grape seed mg/kg

平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）能夠說明原花青素在葡萄果皮和種子種的聚合程度。平均聚合度越高，代表分子質(zhì)量大、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無法透過生物膜被生物利用[3]?！F人香’果皮中原花青素平均聚合度最高（49.66），而‘霞多麗’果皮中原花青素的平均聚合度僅為26.11，平均聚合度最低。在葡萄籽中，‘貴人香’的平均聚合度（44.98）顯著高于其余品種（P＜0.05），最低的是‘雷司令’（10.88）。此外，6個供試品種果皮中的原花青素平均聚合度均高于葡萄籽。

2.4 基于白葡萄果實類黃酮含量的主成分分析

為進(jìn)一步探究白葡萄品種果實中類黃酮類物質(zhì)的差異，本研究對類黃酮物質(zhì)含量進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見圖1。由圖1a可知，兩個主成分共解釋了61.0%的總方差（主成分1為35.4%，主成分2為25.6%）。從x軸方向看，主成分1能將六個白葡萄品種分成四組，‘貴人香’和‘霞多麗’、‘雷司令’位于正半軸，其中‘霞多麗’和‘雷司令’位于原點附近，‘小芒森’和‘長相思’、‘維歐尼’位于負(fù)半軸，其中‘長相思’和‘維歐尼’位于原點附近。結(jié)合圖1b可知，‘貴人香’、‘霞多麗’和‘雷司令’均含有較多的表兒茶素，且‘貴人香’含有較多的蘆??；而異鼠李素、槲皮素-3-葡萄糖苷和果皮表棓兒茶素在‘小芒森’、‘長相思’和‘維歐尼’中含量較高，且‘小芒森’的葡萄籽中黃烷醇含量豐富。主成分2能夠?qū)灼咸哑贩N分為兩組，其中‘霞多麗’、‘長相思’和‘維歐尼’位于y軸正半軸，‘貴人香’、‘雷司令’和‘小芒森’位于y軸的負(fù)半軸。結(jié)合載荷圖，位于y軸正半軸的三個品種，其果皮中含有較多的黃烷醇；位于y軸負(fù)半軸的三個品種中，‘貴人香’和‘雷司令’果皮中蘆丁和山奈酚含量較高，‘小芒森’種子中的原花青素含量較高。

圖1 基于白葡萄果實類黃酮的主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.1 Principal component analysis score plot (a) and loading plot(b) based on flavonoids in white grape

3 結(jié)論

白葡萄的皮渣在釀酒時不經(jīng)過浸漬和發(fā)酵過程，可以較完整地保留皮渣中的酚類物質(zhì)?？茖W(xué)利用白色釀酒葡萄皮渣不僅能提高原料利用率，還能減輕環(huán)境壓力。本研究以玻璃溫室種植的白色釀酒葡萄品種‘霞多麗’、‘長相思’、‘貴人香’、‘小芒森’、‘雷司令’、‘維歐尼’為材料，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測其果皮、種子中的類黃酮類物質(zhì)組成和含量，結(jié)果表明，‘長相思’、‘雷司令’和‘小芒森’果皮含有較多的黃酮醇，‘維歐尼’果皮黃烷醇含量較高，‘小芒森’葡萄籽中的黃烷醇含量最高。從黃酮醇種類上看，白色葡萄品種的果皮中沒有檢測到西伯利亞落葉松類黃酮醇、丁香亭和楊梅酮，僅‘小芒森’和‘長相思’含有異鼠李素，‘貴人香’和‘雷司令’含有蘆丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷。此外，僅在‘霞多麗’和‘雷司令’的果皮中檢測到表兒茶素?；陬慄S酮物質(zhì)含量的主成分分析可以將供試的白葡萄品種區(qū)分開，說明類黃酮物質(zhì)的組成和含量與葡萄基因型有關(guān)。本研究結(jié)果為規(guī)模化提取白葡萄皮渣中類黃酮類物質(zhì)提供了依據(jù)。