張琪，徐軻，欒慶剛，彭躍，李建立，張莉，張明

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100191；2.山東得益乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，山東 淄博 265200；3.北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院，北京 102300；4.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

0 引言

益生菌是一類能夠經(jīng)過(guò)消化系統(tǒng)改善人體健康作用的微生物，可以通過(guò)定殖于人體的腸道、生殖系統(tǒng)改善人體內(nèi)的微生態(tài)平衡，對(duì)人體健康具有重要意義，直接或間接影響到人體免疫、癌癥、糖尿病、過(guò)敏、肥胖、情緒等[1-2]。雙歧桿菌是健康人腸道內(nèi)的一種重要的益生菌，具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、潤(rùn)腸通便、免疫調(diào)節(jié)等功能[3-5]。酸奶是益生菌的優(yōu)質(zhì)載體，也是益生菌產(chǎn)品應(yīng)用的主要形式[6]，益生菌酸奶市場(chǎng)的龐大與高增速反應(yīng)了消費(fèi)者的需求，也對(duì)益生菌的功能開發(fā)提出了更高的要求。

雙歧桿菌改善腸道健康功能研究已有較多研究。王曉成等人[7]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌對(duì)小鼠腸道形態(tài)的發(fā)育有重要作用。其對(duì)便秘的緩解作用也有較多發(fā)現(xiàn)，Ohkusa等[8]發(fā)現(xiàn)便秘人群的腸道菌群與健康人群不同。Halloran等[9]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充雙歧桿菌能夠改變腸道的微生態(tài)環(huán)境。Miller等[10]通過(guò)給便秘的成人補(bǔ)充雙歧桿菌，每周可增加排便0.83次，有效縮短了腸道運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在緩解便秘過(guò)程中改變了腸道短鏈脂肪酸的含量，推測(cè)乙酸和丁酸含量對(duì)緩解便秘有關(guān)鍵作用。然而，并非所有的雙歧桿菌都具有潤(rùn)腸通便的作用，通過(guò)菌種的篩選優(yōu)化和實(shí)際功能效果驗(yàn)證才能最終確定[12]。

本研究使用了一株篩選自廣西巴馬地區(qū)長(zhǎng)壽老人的乳雙歧桿菌IU-100（也稱動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種IU-100，IU-100），通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和人群試驗(yàn)，探究IU-100菌株對(duì)便秘小鼠和人群的通便作用，以期為其在乳制品中更好的應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）IU-100，分離自廣西巴馬地區(qū)長(zhǎng)壽老人腸道菌群，保藏編號(hào)CGMCC No.12693。

SPF級(jí)Balb/C雄性小鼠，6到8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

活性炭粉，天津市華東試劑廠；阿拉伯樹膠，上海生工生物工程公司；復(fù)方地芬諾酯，常州康普藥業(yè)有限公司；生牛乳，山東得益乳業(yè)股份有限公司；白砂糖（食品級(jí)）、濃縮乳清蛋白，上海泛亞乳品有限公司；瓊脂、果膠及淀粉河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

CP124S電子天平，賽多利斯儀器有限公司；APV2000均質(zhì)機(jī)，上海史恒儀器設(shè)備有限公司；EUROSTAR攪拌器，德國(guó)IKA公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCD-195QM電冰箱，青島海爾股份有限公司。

IU-100發(fā)酵乳：生牛乳升溫至60℃，加入混合均勻的白砂糖、瓊脂、濃縮乳清蛋白、淀粉化料，均質(zhì)殺菌完畢，降溫至43℃；接種發(fā)酵劑和IU-100乳雙歧桿菌，攪拌混合均勻，在溫度43℃下，靜置發(fā)酵至滴定酸度大于70°T，得發(fā)酵乳；將制得的發(fā)酵乳破乳后冷卻至4℃，灌裝后轉(zhuǎn)入溫度為4℃的環(huán)境中進(jìn)行冷藏后熟8 h，即得IU-100的發(fā)酵乳。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)

(1)分組及處理。SPF級(jí)Balb/C小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為IU-100菌株高、中、低劑量組、BB-12陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組和空白組。

空白組和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的脫脂乳0.1 mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計(jì))；IU-100低、中、高劑量組小鼠分別灌胃1×106、1×108、1×1010CFU/mL的菌懸液0.1 mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計(jì))；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃1×1010CFU/mL BB-12，每天一次，試驗(yàn)期間自由進(jìn)食。

(2)首粒排黑便時(shí)間、糞便粒數(shù)、糞便重量及糞便含水率測(cè)定。給受試樣品7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及3個(gè)劑量組小鼠灌胃復(fù)方地芬諾酯（10 mg/kg），空白對(duì)照組灌胃蒸餾水。灌胃復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠用墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠）灌胃，處理組給予含受試樣品的墨汁，動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食。從灌墨汁開始，記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間、5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)、重量，同時(shí)測(cè)定糞便含水率。

(3)小腸推進(jìn)試驗(yàn)。給受試樣品15 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對(duì)照組和處理組灌胃復(fù)方地芬諾酯（5 mg/kg），空白對(duì)照組灌胃蒸餾水。灌胃復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，處理組分別給予含受試樣品的墨汁，對(duì)照組給墨汁灌胃。25 min后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度”，按下式計(jì)算墨汁推進(jìn)率：

1.2.2 人群實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)便秘人群納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲，至少符合羅馬Ⅳ便秘的診斷標(biāo)準(zhǔn)中的兩項(xiàng)，如25%的排便為硬便、排便時(shí)有肛門直腸梗阻感、排便不完全感、需要輔助促進(jìn)排便以及每周排便少于3次，且持續(xù)3個(gè)月時(shí)，則診斷為便秘[13]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：器質(zhì)性疾病、藥物、精神心理因素引起的便秘,試驗(yàn)前兩周服用促胃腸動(dòng)力藥和微生態(tài)制劑。

(2)受試者干預(yù)和評(píng)價(jià)方法。招募50名便秘志愿者，經(jīng)過(guò)7 d排空期后，進(jìn)行28 d飲用期，分別在排空期結(jié)束和飲用期結(jié)束進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分，包括每周排便次數(shù)、糞便性狀布里斯托分?jǐn)?shù)[14]、及排便狀況積分[15]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，受試者不可飲用任何發(fā)酵食品（包括泡菜、酸菜、腐乳、豆豉、酸奶、奶酪、活性發(fā)酵乳飲料等）和其他益生菌產(chǎn)品。按下式計(jì)算癥狀評(píng)分改善率：

顯效：各項(xiàng)癥狀明顯減輕，癥狀評(píng)分改善率≥50%；有效：各項(xiàng)癥狀有所減輕，癥狀評(píng)分改善率25%～49%；無(wú)效：各項(xiàng)癥狀無(wú)明顯變化，癥狀評(píng)分改善率。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不同處理方法之間均值比較采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，受試者的社會(huì)人口學(xué)特征，使用描述性統(tǒng)計(jì)(百分比、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。干預(yù)前后分別采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較，所有的統(tǒng)計(jì)分析都采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0版，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 IU-100對(duì)小鼠糞便重量、首次排黑便時(shí)間及糞便顆粒影響

小鼠經(jīng)口灌胃IU-100菌株，7 d后測(cè)定便秘模型小鼠糞便重量、首次排黑便時(shí)間、糞便顆粒數(shù)目的影響，如圖1所示。與空白對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物糞便重量和糞便顆粒顯著降低（P＜0.01），首次排黑便時(shí)間顯著增加，說(shuō)明便秘小鼠模型成立。與模型組相比，不同劑量IU-100均增加小鼠排便顆粒和糞便重量，縮短便秘小鼠首次排便時(shí)間，尤其是中劑量組樣品，首次排黑便時(shí)間與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照菌株。

圖1 乳雙歧桿菌IU-100對(duì)小鼠糞便重量（a）、首次排黑便時(shí)間（b）及糞便顆粒（c）影響

2.2 IU-100對(duì)小鼠糞便含水量影響

實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)口灌胃IU-100菌株，連續(xù)7 d后測(cè)定所有分組小鼠糞便含水量，結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物糞便含水量降低，與模型組相比，中劑量IU-100顯著提高小鼠糞便含水量（P＜0.05）。

圖2 乳雙歧桿菌IU-100對(duì)小鼠糞便含水量影響

2.3 IU-100對(duì)小鼠腸道墨汁推進(jìn)率影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃IU-100活菌15 d后，做小腸推進(jìn)試驗(yàn)，各組小鼠腸道墨汁推進(jìn)率如圖3所示。結(jié)果表明，模型組墨汁推進(jìn)率顯著低于空白組（P＜0.01），小鼠便秘模型成立。IU-100菌株干預(yù)15 d，各劑量組小鼠墨汁推進(jìn)率均顯著高于模型組，其中低、高劑量組達(dá)到極顯著水平，與空白對(duì)照接近。IU-100各組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。研究結(jié)果表明，IU-100菌株能顯著增進(jìn)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)，促進(jìn)腸內(nèi)容物的推進(jìn)，對(duì)便秘小鼠具有潤(rùn)腸通便功能。

圖3 乳雙歧桿菌IU-100對(duì)小鼠腸道墨汁推進(jìn)率影響

2.4 便秘受試者基本情況統(tǒng)計(jì)

招募50名志愿者，期間由于流感、服藥等因素退出5人，完成試驗(yàn)45人，受試者年齡、體重、性別等信息如表1所示。

表1 受試者飲用前基本情況

2.5 IU-100對(duì)便秘受試者的影響

IU-100發(fā)酵酸奶對(duì)便秘受試者癥狀的影響如表2所示，飲用IU-100發(fā)酵酸奶28 d后，受試者排便次數(shù)、糞便性狀和排便狀況積分得到顯著改善，有效率分別達(dá)到91.1%，88.9%和97.8%，表明IU-100發(fā)酵酸奶具有潤(rùn)腸通便的作用。

表2 便秘受試者癥狀積分比較

便秘是一種常見的胃腸道疾病，不僅影響人們身心健康，而且給工作和生活帶來(lái)困擾[16]。滲透性瀉劑是目前治療便秘的主要方法，這一方式有藥物依賴性，長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)導(dǎo)致胃腸道功能受損，給患者帶來(lái)不利影響[17]。與相關(guān)藥物相比，研究發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)改善便秘相關(guān)癥狀有有益影響，如乳雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等益生菌可通過(guò)其對(duì)腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物、中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)的影響，幫助促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)和改善便秘癥狀[18-19]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌IU-100發(fā)酵乳可顯著增加便秘小鼠糞便含水量，縮短首次排黑便時(shí)間，促進(jìn)小腸墨汁推進(jìn)率。人群實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)IU-100可顯著改善便秘人群的排便次數(shù)、糞便性狀及排便狀況積分。以上結(jié)果表明IU-100具有潤(rùn)腸通便的功效，為進(jìn)一步研發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用IU-100產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究分別利用便秘動(dòng)物和人群評(píng)價(jià)了IU-100緩解便秘的作用，結(jié)果表明，IU-100能顯著改善便秘小鼠首次排黑便時(shí)間、增加排黑便粒數(shù)和重量，顯著提高便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率，同時(shí)，IU-100發(fā)酵酸奶可顯著改善便秘人群的排便次數(shù)、糞便性狀和排便狀況積分，具有潤(rùn)腸通便作用。