欒媛媛，謝雨佳，李政，王娟，彭小杰，李明逸，肖珊珊，曾星星，張少輝,

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司，浙江 溫州 325800）

0 引言

人體的皮膚老化分為內(nèi)在老化和外在老化兩種形式。內(nèi)在老化即隨著時(shí)間流逝人體正常的老化現(xiàn)象；外在老化則是由于一些外部因素導(dǎo)致的老化，其中紫外線(UV,Ultraviolet)照射被認(rèn)為是誘發(fā)皮膚損傷和老化的主要外部環(huán)境因素，占外在老化的80%[1]。UV根據(jù)波長范圍的不同可以劃分為3種：長波紫外UVA（320～400 nm）、中波紫外UVB（290～320 nm）和短波UVC（100～290 nm）[2]。其中UVB造成的輻射最強(qiáng)，能夠穿透表皮到達(dá)真皮細(xì)胞，導(dǎo)致DNA的損傷[3]；誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和促炎因子的增加[4]。UVB照射的皮膚內(nèi)ROS的含量會(huì)出現(xiàn)顯著升高，從而導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶含量的升高，進(jìn)一步導(dǎo)致I型膠原蛋白的降解[5]。

近幾年有研究表明某些植物提取物具有抗光老化的效果，如當(dāng)歸根提取物可通過抑制MAPK/AP-1通路磷酸化和誘導(dǎo)TGF-β的激活，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，從而促進(jìn)膠原蛋白合成[6]；佛手柑多酚組分可通過促炎細(xì)胞因子IL-1β的調(diào)節(jié)恢復(fù)細(xì)胞活力，增強(qiáng)端粒酶活性[7]，以及茶葉提取物[8]、廢咖啡渣[9]、大豆肽[10]和海洋生物中提取的膠原蛋白肽[11]均具有抗光老化的效果。而對于乳源多肽的研究多集中于抗癌[12]、抗氧化[13]、降血壓[14-15]、降血糖[16]等。

本文旨在探討牛乳蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生的多肽，其在經(jīng)UVB照射后的人皮膚成纖維細(xì)胞中的抗光老化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人皮膚成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts-1,HFF-1)，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；乳源肽，浙江輝肽生命健康科技有限公司；96孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，血球計(jì)數(shù)板等。

DMEM高糖不完全培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰酶細(xì)胞消化液（含酚紅）和1×PBS緩沖液，Biosharp；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、活性氧ROS檢測試劑盒，南京凱基生物生物技術(shù)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (PrimeScriptTMRT reagent Kit)、SYBR green法實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(TB Green Premix Ex TaqTM)，日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置顯微鏡，日本尼康公司；離心機(jī)，中國醫(yī)療器械（上海）股份有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，廈門至微儀器公司；BJ-2CD超凈工作臺(tái)，上海屹明凈化設(shè)備有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，德國MEMMERT公司；NanoDrop超微量分光光度儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Thermal熱循環(huán)儀，美國Applied Biosystems公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HFF-1細(xì)胞用含1%100×雙抗、15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，二氧化碳5%，濕度95%。將凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)2～3 d后，置于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%聚合度時(shí)，用PBS清洗，胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞活力測定和UVB照射

本實(shí)驗(yàn)主要探討不同濃度的乳源肽對細(xì)胞的毒性作用。將傳代后的HFF-1細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經(jīng)24 h培養(yǎng)后，將不同濃度（0.05、0.08、0.10、0.12、0.50、1.00、2.50、5.00 mg/mL）的乳源肽添加到96孔板中，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，對照組添加15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑使用方法，將5×MTT溶液稀釋成1×MTT溶液，以50μL/孔的量添加到96孔板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震蕩使甲臜充分溶解后，迅速用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測OD值，以對照組為基礎(chǔ)計(jì)算細(xì)胞活力。

為探討UVB對HFF-1細(xì)胞造成的亞細(xì)胞毒性的輻照劑量，采用不同紫外輻照劑量（1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2）對HFF-1細(xì)胞進(jìn)行照射，輻照劑量用紫外輻照計(jì)進(jìn)行測定，將傳代后的HFF-1細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經(jīng)48 h培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液覆蓋薄薄的一層連續(xù)3次照射，每次間隔12 h，在最后一次照射后24 h測定細(xì)胞活力。

為探究預(yù)給予不同濃度的乳源多肽對UVB損傷的HFF-1細(xì)胞活力的修復(fù)作用，將傳代后的HFF-1細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經(jīng)24 h培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液為含有不同濃度（0.08、0.1 mg/mL）的乳源多肽，對照組為含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液覆蓋薄薄的一層，用3.6 J/cm2的紫外輻照劑量對細(xì)胞進(jìn)行紫外照射（對照組避光），照射結(jié)束后，棄掉PBS緩沖液，加入培養(yǎng)液，每次間隔12 h，共照射3次，在最后一次照射結(jié)束后24 h進(jìn)行細(xì)胞活力測定。每組設(shè)6個(gè)平行。

1.3.3 ROS測定

在UVB照射后12、24 h時(shí)后分別進(jìn)行ROS的測定。ROS用2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)熒光探針進(jìn)行測定，將用無血清培養(yǎng)液稀釋后的DCFH-DA加入到96孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。同時(shí)將96孔板中加入MTT，孵育4 h后用酶標(biāo)儀測定OD值，作為內(nèi)參。每組設(shè)6個(gè)平行。

1.3.4β-半乳糖苷酶測定

與衰老有關(guān)的胞內(nèi)β-半乳糖苷酶在細(xì)胞衰老時(shí)可表現(xiàn)出高酶活性，為測定乳源肽的抗衰老情況，在最后一次照射后48 h，吸棄培養(yǎng)液，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后，用PBS洗滌3次，加入染色工作液，于37℃孵育過夜，在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，每次計(jì)400個(gè)，計(jì)3次。

1.3.5 ELISA測定

用ELISA方法對I型膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）的活性進(jìn)行測定。將細(xì)胞接種于96孔板中，在最后一次照射24 h后使用ELISA試劑盒進(jìn)行活性測定。

1.3.6 RT-qPCR測定

在最后一次照射后12 h和24 h分別用RNA提取試劑盒提取RNA，提取的RNA用NanoDrop超微量分光光度儀進(jìn)行濃度及純度測定，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄（20μL），逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃、15 min；85℃、5 s；4℃。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA根據(jù)試劑盒使用說明用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)分兩步：95℃、30 s(Step 1);95℃、5 s，60℃、30 s，GOTO 39(Step 2)。溶解曲線條件為：95℃，65～95℃，增量0.5℃。每次實(shí)驗(yàn)取3個(gè)平行。1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以實(shí)驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的形式表示，用EXCEL，SPSS和GraphPad 9軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯著性以*：P＜0.05表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞活力測定和UVB照射

對細(xì)胞給予不同濃度的乳源肽，來測定乳源肽對細(xì)胞的毒性作用。如圖1所示，與多肽濃度為0 mg/mL的對照組相比，乳源肽在0.5～2.5 mg/mL的范圍內(nèi)，對于細(xì)胞增殖均無明顯的抑制作用，其中0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽對細(xì)胞增殖均有顯著性的促進(jìn)作用。這與本實(shí)驗(yàn)室之前乳源肽相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[17]，說明乳源肽在0.1 mg/mL的添加量以下對細(xì)胞增殖有較好的促進(jìn)作用，因此選用0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽進(jìn)行功效實(shí)驗(yàn)。

圖1 乳源肽濃度對細(xì)胞活力的影響

為確定合適的UVB輻照劑量，對HFF-1細(xì)胞分別進(jìn)行1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2劑量的照射。24 h后的細(xì)胞活力測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)紫外輻照計(jì)量達(dá)到3.6 J/cm2時(shí)，對細(xì)胞增殖有顯著性抑制作用，可顯著降低細(xì)胞活力，而當(dāng)輻照劑量為2.4 J/cm2時(shí)，對細(xì)胞活力無顯著性影響。因此，選用3.6 J/cm2的紫外輻照強(qiáng)度用于測定預(yù)給予乳源肽對UVB照射后的細(xì)胞活力的影響，選用2.4 J/cm2的紫外輻照強(qiáng)度用于預(yù)給予乳源肽對UVB損傷細(xì)胞的抗光老化影響研究。

圖2 紫外輻照劑量對細(xì)胞活力的影響

用3.6 J/cm2的紫外輻照強(qiáng)度測定預(yù)給予0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽對UVB照射后的細(xì)胞活力的影響，同時(shí)選用棕櫚酰五肽-4作為陽性對照。棕櫚酰五肽-4能很好地促進(jìn)膠原蛋白的合成，具有抗皺效果，其商品名為Matrixyl，目前已廣泛的用于抗皺化妝品中[18]。結(jié)果表明，如圖3所示，UVB（3.6 J/cm2）照射后的細(xì)胞較未被照射的細(xì)胞活力均有下降，而預(yù)給予乳源肽和棕櫚酰五肽-4的細(xì)胞相較于陰性對照組來說，其細(xì)胞活力均有增長，但都沒有顯著性差異，說明乳源肽對于UVB照射的細(xì)胞活力無顯著影響，且會(huì)一定程度的促進(jìn)細(xì)胞活力的增長。

圖3 預(yù)給予乳源肽對紫外損傷細(xì)胞的細(xì)胞活力影響

2.2 乳源肽可抑制ROS的生成

炎癥反應(yīng)和ROS的產(chǎn)生是導(dǎo)致光損傷主要原因[19]。ROS的產(chǎn)生會(huì)對下游多個(gè)信號通路產(chǎn)生影響，如MAPK信號通路，TGF-β/SMAD信號通路等，對信號通路中的多種衰老因子，如JNK,p38,NF-kB,TGF-β產(chǎn)生影響。最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的效率降低，抗氧化物質(zhì)的減少，導(dǎo)致DNA損傷的累積，并對胞外基質(zhì)產(chǎn)生影響[4,20-21]。研究表明，對于紫外誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞來說，在紫外照射后1 h內(nèi)會(huì)有明顯的變化，在輻照后25 min內(nèi)ROS含量會(huì)顯著性的增高，25 min后逐漸下降并恢復(fù)到正常水平[5]。

因此，ROS在紫外輻照導(dǎo)致的光老化中發(fā)揮巨大的作用，可用于探究乳源肽對于抗光老化的效果。如圖4所示，在2.4 J/cm2的亞細(xì)胞毒性劑量下分別測定了紫外照射后12 h和24 h的ROS產(chǎn)量，結(jié)果表明在紫外照射12 h后，經(jīng)紫外照射后的細(xì)胞內(nèi)ROS呈極顯著的升高(P<0.001)，而預(yù)給予乳源肽組及陽性對照組都呈現(xiàn)極顯著性的降低，其中預(yù)給予0.08 mg/mL的乳源肽相較于0.1 mg/mL的乳源肽添加量效果更為顯著；在紫外照射24 h后，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組細(xì)胞內(nèi)的ROS都逐漸趨于正常生長的細(xì)胞水平，說明對于紫外照射的細(xì)胞來說，ROS含量會(huì)顯著升高并在24 h后恢復(fù)正常，而預(yù)給予乳源肽的細(xì)胞會(huì)在細(xì)胞接受紫外照射時(shí)起到修復(fù)作用，防止ROS的升高。說明在紫外照射前預(yù)先添加乳源肽有助于紫外損傷的細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，并降低ROS的產(chǎn)量，有效防止紫外輻照所導(dǎo)致的氧化損傷。

圖4 乳源肽對紫外誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)量的影響

2.3 乳源肽可抑制紫外照射的細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性

正常體細(xì)胞在培養(yǎng)過程中在經(jīng)過有限數(shù)量的細(xì)胞分裂后，即進(jìn)入不可逆的衰老階段[22]。而β-半乳糖苷酶是測定衰老細(xì)胞的常見指標(biāo)，其主要以pH為6.0時(shí)細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶活性為衰老指標(biāo)，細(xì)胞老化越嚴(yán)重，β-半乳糖苷酶活性就越高[23]。β-半乳糖苷酶試劑盒可使衰老細(xì)胞呈深藍(lán)色，即陽性，在普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察。該指標(biāo)在多個(gè)研究中被用于判斷細(xì)胞衰老情況[24-25]。

如圖5所示，乳源肽組可明顯抑制紫外照射后的細(xì)胞衰老，對于紫外照射的細(xì)胞，其β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的比例是對照組的3.29倍，而乳源肽組和陽性組的陽性細(xì)胞都出現(xiàn)了顯著性的降低，說明預(yù)給予乳源肽可能會(huì)有效延緩紫外照射所導(dǎo)致的細(xì)胞衰老現(xiàn)象。

圖5 β-半乳糖苷酶活性及陽性細(xì)胞比例

2.4 預(yù)給予乳源肽可抑制MMP-1的分泌，促進(jìn)I型膠原蛋白的合成

細(xì)胞經(jīng)一定程度的紫外照射后，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞損傷，而損傷累積到一定程度時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，產(chǎn)生一系列衰老相關(guān)的分泌表型（SASP,senescenceassociated secretory phenotype），包括一些細(xì)胞因子，生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等[26]。同時(shí)，早有研究表明紫外輻照引起的光老化會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白、彈性蛋白等胞外基質(zhì)的減少，從而產(chǎn)生皺紋，阻礙傷口的愈合[27]。

為研究乳源肽的抗光老化效果，用ELISA方法測定了不同處理方式的細(xì)胞其MMP-1和I型膠原蛋白的分泌量。如圖6(a)，在紫外照射后24 h，經(jīng)紫外照射的細(xì)胞（NC）相較于未受紫外照射的對照組細(xì)胞（C），其MMP-1的分泌量有極顯著的升高，是對照組的1.76倍，而預(yù)給予不同濃度的乳源肽及陽性對照組相較于陰性對照組都有極顯著的下降，預(yù)給予0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽組分別下降了30.38%和27.42%。而圖6(b)的結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)紫外照射后，其I型膠原蛋白的分泌量會(huì)顯著下降，而實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組都很好地抑制了I型膠原蛋白的降解，相較于陰性對照組其分泌量有極顯著的升高。圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外照射會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MMP-1的分泌增多，從而導(dǎo)致I型膠原蛋白的降解，而乳源肽能夠很好地抑制MMP-1的分泌，從而防止I型膠原蛋白的降解。

圖6 乳源肽對紫外誘導(dǎo)的細(xì)胞中MMP-1及I型膠原蛋白分泌量的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)給予乳源肽抗光老化的效果及對MMP-1的調(diào)控，分別提取了最后一次UVB照射后12、24 h細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以測定細(xì)胞內(nèi)MMP-1及I型膠原蛋白的mRNA表達(dá)情況。如圖7(a)所示，紫外照射后的細(xì)胞在照射后24 h內(nèi)MMP-1的表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著的升高，其中在照射后12 h的表達(dá)量是照射后24 h的1.5倍，而經(jīng)乳源肽處理后的細(xì)胞與陰性對照組相比顯著的抑制了MMP-1的表達(dá)。相應(yīng)的，圖7(b)的結(jié)果顯示，經(jīng)紫外照射的細(xì)胞在照射后24 h I型膠原蛋白的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著性下降，而經(jīng)乳源肽處理后的細(xì)胞在24 h內(nèi)I型膠原蛋白的mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)顯著性的升高，且出現(xiàn)表達(dá)量隨時(shí)間的增長而降低的趨勢。說明乳源肽通過調(diào)控MMP-1和I型膠原蛋白mRNA的表達(dá)來控制其分泌，可抑制紫外照射細(xì)胞中MMP-1的表達(dá)，并且促進(jìn)I型膠原蛋白的表達(dá)。而乳源肽對MMP-1基因的下調(diào)可能與ROS含量的降低有關(guān)。

圖7 乳源肽對紫外誘導(dǎo)的細(xì)胞中MMP-1及I型膠原蛋白mRNA表達(dá)量的影響

之前研究表明，紫外引發(fā)的DNA氧化損傷會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活[28]。而很多細(xì)胞因子其基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子部位都存在可與NF-κB結(jié)合的位點(diǎn)，NFκB的激活會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)與光老化，其中涉及炎癥因子TNF-α,IL-6 and IL-10與光老化相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 and MMP-9的調(diào)控[29]。同時(shí)，研究表明在成纖維細(xì)胞與U937巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，成纖維細(xì)胞分泌的IL-6細(xì)胞因子會(huì)對U937巨噬細(xì)胞分泌MMP-1產(chǎn)生影響[30]。由于紫外照射會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子，如IL-6的表達(dá)，IL-6會(huì)繼而誘導(dǎo)MMP-1的表達(dá)[31]。同時(shí)，對于紫外損傷的修復(fù)也有可能通過對損傷細(xì)胞DNA的修復(fù)來調(diào)控MMP-1的表達(dá)以及防止MAPKs的磷酸化[32]。另外紫外誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，會(huì)促進(jìn)MAPK信號通路的磷酸化，繼而誘導(dǎo)下游激活蛋白（AP-1）的生成，AP-1能通過上調(diào)MMP-1的表達(dá)來降低I型膠原蛋白的含量，并且抑制轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1的表達(dá)[33]，而TGF-β1可促進(jìn)膠原蛋白的合成[34]。因此本實(shí)驗(yàn)中乳源肽對MMP-1調(diào)節(jié)可能是ROS及炎癥因子調(diào)控的結(jié)果，對I型膠原蛋白的調(diào)節(jié)可能與TGF-β1有關(guān)。

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)通過HFF-1細(xì)胞探究了預(yù)給予乳源肽對紫外損傷細(xì)胞的抗光老化效果。結(jié)果表明，在細(xì)胞經(jīng)多次紫外照射后，會(huì)產(chǎn)生衰老現(xiàn)象，添加一定濃度的乳源肽會(huì)有效防止細(xì)胞的老化，0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽均能有效抑制紫外照射細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，通過控制MMP-1的基因表達(dá)來抑制MMP-1的分泌，從而減少對膠原蛋白的降解，同時(shí)乳源肽可促進(jìn)I型膠原蛋白的表達(dá)和分泌，與未處理過的紫外損傷細(xì)胞相比，其含量顯著升高。本研究為乳源肽在化妝品行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，而其相關(guān)的具體機(jī)制通路還有待探究。