梁紫涵， 劉詩文， 申镕賓， 劉冰南

(大連工業(yè)大學 生物學院，遼寧 大連 116034)

蝦青素是天然的抗氧化劑和著色劑，主要存在于微生物、藻類和部分水生動物體內(nèi)，具有提高機體免疫力，防治多種疾病的作用，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域有廣泛的應用[1-2]。法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)是天然蝦青素產(chǎn)生菌，其發(fā)酵過程不需要光照，培養(yǎng)基條件簡單，培養(yǎng)周期短，能夠在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)，因此具有工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的潛力[3-4]。Miao等[5]通過菌株誘變和基因工程改造，獲得的法夫酵母工程菌株蝦青素產(chǎn)量達到248.6 mg/g。最新研究表明，在10 m3的發(fā)酵罐中，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化，蝦青素產(chǎn)量達到360.3 μg/mL[6]。目前，蝦青素產(chǎn)量已基本能夠達到工業(yè)化需求，但發(fā)酵溫度低仍是制約法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的關(guān)鍵因素。通常野生型法夫酵母最適細胞生長和色素合成的溫度為17～21 ℃，因此在大部分地區(qū)夏季生產(chǎn)成本增加[7]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)中產(chǎn)生大量的發(fā)酵熱，生長溫度低意味著需要消耗更多的冷卻水和能源來維持發(fā)酵溫度，大規(guī)模生產(chǎn)中甚至需要投入制冷設(shè)備，大大增加了成本。因此，篩選出法夫酵母耐熱菌株對降低蝦青素生產(chǎn)成本至關(guān)重要。龔玉姣等[8]通過抗霉素A篩選，得到了能在28 ℃生長的法夫酵母突變株。黃曉燕[9]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了能在30 ℃下生長的融合菌株，但蝦青素產(chǎn)量降低。目前雖然獲得了一些法夫酵母耐熱菌株，但對法夫酵母的耐熱機制還不清楚。本研究通過誘變獲得法夫酵母耐熱突變株，并對該突變株進行基因組重測序，分析其突變位點，為后續(xù)的法夫酵母耐熱機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)CBS6038，購自韋斯特迪克真菌生物多樣性研究所。法夫酵母YB25是法夫酵母CBS6938經(jīng)亞硝基胍(NTG)誘變后，篩選得到的突變株。

1.1.2 培養(yǎng)基 土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)時不添加瓊脂(PD)。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 酵母核酸純化試劑盒(Takara),NTG，氯化鈉，葡萄糖，檸檬酸。三元疊加振蕩器(ZWYR-D2403，上海智城分析儀器制造有限公司)；高效液相色譜儀(E2695，Waters Corporation)；超微量紫外分光光度計(K5800，北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 挑取法夫酵母平板中的單菌落，接種于5 mL PD培養(yǎng)基中，20 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。取500 μL菌液接種于50 mL PD培養(yǎng)基中，20 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h，菌液經(jīng)5 000 r/min離心10 min后得到法夫酵母菌體,無菌生理鹽水洗滌兩次，10 mL檸檬酸緩沖溶液重懸，調(diào)整菌液菌數(shù)為107個/mL。

1.2.2 NTG誘變 選擇不同終濃度的NTG處理法夫酵母細胞，終濃度分別為20、40、60 μg/mL。經(jīng)生理鹽水清洗后重懸，稀釋菌液濃度至103個/mL，分別取100 μL菌液涂布于PDA平板，以未經(jīng)NTG處理的法夫酵母細胞作為對照組，20 ℃培養(yǎng)5 d，計算致死率。取一定量的上述菌液于50 mL離心管中，加入NTG溶液，使菌液NTG終濃度為20 μg/mL，不斷振蕩10 min后，10 000 r/min離心4 min，棄上清。加入1 mL生理鹽水重懸上述實驗所得菌體，取100 μL涂布于PDA平板，倒置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選出紅色菌落。將已篩選出的紅色菌落，接種于新鮮PD培養(yǎng)基中，25 ℃，180 r/min培養(yǎng)96 h，測定該誘變菌株蝦青素含量。經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，測定該誘變菌株每一代菌體的蝦青素合成量，以此鑒定該誘變菌株能否在25 ℃條件下穩(wěn)定生長并生產(chǎn)蝦青素。蝦青素含量測定方法參考文獻[10]。

1.2.3 誘變菌株法夫酵母YB25全基因組重測序 首先提取法夫酵母YB25基因組DNA(酵母核酸純化試劑盒，Takara)，并用超微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度，然后將樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司建庫測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 參考基因組選擇法夫酵母基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/43947?genome_assembly_id=995437)，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控去除有接頭、無法確定堿基含量超過10%以及低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，使用BWA軟件與參考基因組進行比對，獲得單核苷酸多態(tài)性(SNP)、長度小于50 bp的小片段插入與缺失(InDel)、結(jié)構(gòu)變異(SV)和拷貝數(shù)變異(CNV)等信息，具體分析軟件和方法參考周夢琳等[11]的方法，簡述如下。應用SAMTOOLS軟件檢測SNP和InDel；利用BreakDancer軟件進行SV檢測；通過CNVnator軟件進行CNV檢測。所有變異檢測后，使用ANNOVAR進行變異注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變篩選耐熱突變株

2.1.1 最適NTG誘變濃度 誘變過程中，需保持一定NTG濃度以達到需要的致死率和突變率。本研究發(fā)現(xiàn)，NTG終濃度在40 μg/mL和60 μg/mL時處理法夫酵母，致死率高達99.24%和99.87%，而NTG終濃度在20 μg/mL時，處理法夫酵母的致死率為80.7%。因此，選擇20 μg/mL NTG作為誘變條件。

2.1.2 誘變菌株的篩選及遺傳穩(wěn)定性驗證 經(jīng)過大量誘變和篩選，獲得一株能夠在25 ℃條件下生長并合成蝦青素的菌株(圖1)。結(jié)果表明，經(jīng)過五代培養(yǎng)，每一代誘變菌株合成蝦青素的能力未發(fā)生變化。表明該誘變菌株在25 ℃培養(yǎng)條件下，能夠穩(wěn)定生長并合成蝦青素，將該菌株命名為法夫酵母YB25。

圖1 誘變菌株各代菌體蝦青素含量Fig.1 Astaxanthin content in different generations of mutagenized strain

2.2 法夫酵母YB25發(fā)酵特性

如圖2所示，菌株YB25在25 ℃條件下培養(yǎng)54 h時，OD600值達到41.76，然后菌體生長進入穩(wěn)定期，直至培養(yǎng)到96 h，OD600值無顯著性變化。

培養(yǎng)72 h時，菌株YB25蝦青素產(chǎn)量達到182 μg/g細胞干重(DCW)，與野生型法夫酵母發(fā)酵84 h的蝦青素產(chǎn)量相當(184 μg/g DCW)。培養(yǎng)120 h時，蝦青素產(chǎn)量達到237.19 μg/g DCW，考慮到時間的延長將提高培養(yǎng)成本，所以培養(yǎng)截止至120 h。

與法夫酵母CBS6938 20 ℃培養(yǎng)相比，菌株YB25在發(fā)酵初期(0～24 h)生長較為緩慢，這是因為培養(yǎng)溫度提高，菌體的生長需要一定的適應過程。菌株YB25在24～54 h發(fā)酵時間段，菌體生長進入對數(shù)期，生長速度快。生成相同含量的蝦青素(184 μg/g DCW)，菌株YB25比野生型法夫酵母發(fā)酵所用時間縮短了12 h，表明菌株YB25與野生型法夫酵母相比減少了培養(yǎng)時間，從而降低了生產(chǎn)成本。培養(yǎng)到120 h，蝦青素最大合成量提高了29%。

圖2 菌株YB25發(fā)酵動力學曲線Fig.2 YB25 fermentation curve

2.3 法夫酵母YB25基因組重測序

2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 提取后的菌株YB25基因組DNA，經(jīng)過濃度純度檢測，文庫構(gòu)建，上機進行Illumina HiSeq測序，在數(shù)據(jù)比對之前過濾篩選了原始數(shù)據(jù)，控制數(shù)據(jù)的質(zhì)量(表1)。如表1所示，經(jīng)過去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)等，最終得到的clean reads占總數(shù)據(jù)的99.31%。進行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制之后，可以保證后續(xù)與法夫酵母基因組進行比對的數(shù)據(jù)質(zhì)量更高，從而保證后續(xù)比對分析結(jié)果的準確性。

表1 原始數(shù)據(jù)過濾結(jié)果

2.3.2 SNP檢測 通過與法夫酵母野生菌株基因組的比對發(fā)現(xiàn)，菌株YB25發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換435個，堿基顛換191個，雜合率為0.030‰，SNP位點總數(shù)為626個，49個變異位于外顯子區(qū)域，85個非同義突變。通過分析法夫酵母合成蝦青素代謝通路上關(guān)鍵基因的堿基突變情況，發(fā)現(xiàn)在蝦青素合成酶基因crtS上一個G轉(zhuǎn)換為A，該堿基突變導致菌株YB25蝦青素合成酶上第401位氨基酸由天冬氨酸變成天冬酰胺，推測這一變化可能是誘變菌株能夠高產(chǎn)蝦青素的原因。另外，乙酰輔酶A羧化酶基因1 393位的A突變?yōu)镃，使得乙酰輔酶A羧化酶第465位蛋氨酸突變?yōu)榱涟彼?。?脂肪酸去飽和酶基因中第38位的T突變?yōu)镃，使Δ9脂肪酸去飽和酶第13位異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸；第199位A突變?yōu)镚，使第67位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?；?95位T突變?yōu)镃，使第99位絲氨酸突變脯氨酸。

2.3.3 InDel檢測 通過與法夫酵母野生菌株基因組的比對，利用軟件對所得結(jié)果進行分析，菌株YB25中發(fā)生小片段的插入和缺失序列共184個，InDel雜合率為0.009‰。有7個變異位于外顯子，其中有2個片段的缺失導致該基因閱讀框改變，有4個片段缺失和1個片段插入導致所編碼氨基酸的缺失或插入，但是并未改變基因閱讀框。這些變異中，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的1 127～1 135發(fā)生非移碼缺失，使二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶第376～379位氨基酸缺失。

2.3.4 SV檢測 通過與法夫酵母野生型菌株基因組的比對，利用軟件對所得結(jié)果進行分析。菌株YB25中發(fā)生大片段的插入、缺失、倒置、易位等現(xiàn)象共703個，其中60個變異位于外顯子區(qū)域，36個變異位于內(nèi)含子區(qū)域，8個變異位于基因間區(qū)。結(jié)構(gòu)變異對法夫酵母基因組產(chǎn)生較大影響，特別是變異位于編碼區(qū)時，會導致蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的改變，從而影響該蛋白質(zhì)的功能。但SV也可能是基因多樣性的來源，從而賦予生物新的功能。

2.3.5 CNV檢測 通過與法夫酵母野生型菌株基因組的比對，利用軟件對所得結(jié)果進行分析。菌株YB25中發(fā)生基因組片段拷貝數(shù)增加或減少的現(xiàn)象共293個，其中78個變異位于外顯子區(qū)域，28個變異位于內(nèi)含子區(qū)域，58個變異位于基因間區(qū)?？截悢?shù)增加40個，減少253個。

2.3.6 基因組結(jié)構(gòu)變異可視化 為了形象化展示法夫酵母YB25基因組中的結(jié)構(gòu)變異，繪制了Circos 分布圖(圖3)。由于基因組數(shù)據(jù)龐大且復雜，通過可視化，可以直觀地展示法夫酵母YB25基因組上的SNP、InDel、SV和CNV等結(jié)構(gòu)變異，更好地進行差異比較。

圖3 法夫酵母YB25基因組結(jié)構(gòu)變異分布Fig.3 Distribution of genome structure variation由外到內(nèi)依次為染色體、SNP、InDel、CNV 增加、CNV 減少、SV插入、SV缺失、SV 倒位、SV染色體內(nèi)部重排、SV 染色體間重排From the outside to the inside in order: chromosome, SNP, InDel, the increase of CNV, the decrease of CNV, SV insertion, SV deletion, SV inversion, chromosome internal rearrangement, chromosome rearrangement

3 討 論

NTG是重要的化學誘變劑，具有誘變效率高等特點，其誘變機理清楚，已經(jīng)廣泛應用于微生物遺傳育種等技術(shù)中[12]。NTG劑量會導致致死率和突變效率的差異，有研究表明致死率達到80%左右時，菌株誘變效果較好[13]。本研究通過NTG誘變篩選，獲得了能在25 ℃發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的法夫酵母突變株YB25，其蝦青素產(chǎn)量比野生型菌株提高29%。其他一些研究也獲得了耐熱菌株，一般能在25 ℃下生長并合成蝦青素，例如，通過細胞融合，獲得最適生長溫度為25 ℃并合成蝦青素的融合菌，但其蝦青素產(chǎn)量與法夫酵母親株NT221比較下降了64.4%[14]。Miao等[15]使用60Co與NTG配合誘變，獲得25 ℃生長并高產(chǎn)蝦青素的法夫酵母菌株。本研究獲得的法夫酵母YB25可以作為后續(xù)代謝工程改造的底盤細胞，為實現(xiàn)蝦青素的高產(chǎn)提供參考。

為了解法夫酵母YB25在基因組水平上產(chǎn)生了哪些變異，本研究通過基因組重測序，獲得了突變菌株法夫酵母YB25的遺傳圖譜和基因組結(jié)構(gòu)變異結(jié)果?；蚪M重測序技術(shù)能夠為遺傳性狀的進化機制提供重要的數(shù)據(jù)支持[16]。SNP、InDel、SV和CNV等變異使菌株YB25的基因組與野生型菌株相比發(fā)生了顯著變化。在眾多的結(jié)構(gòu)變異中發(fā)現(xiàn)，多個與脂代謝相關(guān)基因發(fā)生突變，包括乙酰輔酶A羧化酶基因、Δ9脂肪酸去飽和酶基因和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。有研究表明，脂肪酸的飽和程度會影響菌株的熱穩(wěn)定性，不飽和/飽和脂肪酸比率對菌株長期的熱耐受性是至關(guān)重要的[17]。通過對釀酒酵母中4 792個基因進行耐熱基因高通量篩選發(fā)現(xiàn)，只有乙酰輔酶A羧化酶基因缺失對酵母的耐熱性有中度影響[18]。由此推測法夫酵母的耐熱性可能與脂代謝相關(guān)。另外，蝦青素合成酶基因的突變可能與法夫酵母YB25的蝦青素產(chǎn)量提高有關(guān)，該酶催化β胡蘿卜素合成蝦青素，其過表達有利于蝦青素的生產(chǎn)。