劉慧，王小娟，王弛，謝勇，趙峰*

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2. 閩江師范高等?？茖W(xué)校，福建 福州 350109；3. 福建省中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

茶葉歷史悠久，可追溯至三千年以前，我國(guó)諸多本草典籍［1，2］中均可見(jiàn)關(guān)于“茶可治病”的記載。目前，眾多學(xué)者對(duì)于茶葉的研究多聚焦于茶葉的功效成分及其作用機(jī)理，尤其是茶多酚、氨基酸、茶多糖等功效成分［3，4］，諸如茶葉寡肽活性研究報(bào)道尚處于起步階段。寡肽，是一種由2～10個(gè)氨基酸分子通過(guò)酰胺鍵連接而成的小分子量蛋白質(zhì)［5］，近年來(lái)相關(guān)報(bào)道顯示其具有獨(dú)特的呈味作用和生物活性，茶葉中寡肽的活性表達(dá)值得進(jìn)一步探究。烏龍茶是中國(guó)六大茶類之一，茶性適中，傳統(tǒng)上認(rèn)為其可“潤(rùn)膚益肺、生津潤(rùn)喉、清除余熱”［6］。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，烏龍茶富含茶多酚、茶氨基酸等多種生物學(xué)活性成分，具有降血脂、抗突變、抑制肥胖、抗癌等［7－12］作用。相較于茶氨基酸，寡肽吸收速率快［13］，且具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗過(guò)敏等［14－22］活性。因此，本研究以閩北烏龍茶為原料制得寡肽粗提物，進(jìn)一步采用膜分離方式制得500～1500 Da分子量段寡肽，并初步探究了其相關(guān)生物學(xué)活性的表達(dá)，以期為活性寡肽序列篩選和茶葉活性表達(dá)機(jī)制研究指明方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

閩北烏龍茶，購(gòu)自耀東方茶葉有限公司，產(chǎn)地為武夷山。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

主要試劑：正戊烷，丙酮，二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯，α-葡萄糖苷酶，對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（pNP-G），pH 6.8的0.1 M磷酸緩沖液，pH 6.3的0.1 M磷酸緩沖液，牛黃膽酸鈉，甘氨膽酸鈉，膽酸鈉，胰酶，2-氮雜（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），過(guò)硫酸鉀，DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基），無(wú)水乙醇，鹽酸，濃硫酸均為分析純（上海麥克林生化科技有限公司）。

主要儀器設(shè)備：分液漏斗和400Y粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；KQ-500E超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器公司）；JM-B5003電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；FlowMem0021-HP三聯(lián)高壓平板膜分離設(shè)備（廈門福美科技有限公司）；HH-6S恒溫水浴鍋（上海拓赫機(jī)電科技有限公司）；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀和PHS-3E pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；ZXDP-B2050恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；ZWY-240恒溫震蕩培養(yǎng)箱（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 烏龍茶寡肽制備及殘留檢測(cè)

粗制：參考SALGER M［23］方法并改進(jìn)，稱取100.0 g粉碎茶葉，分5次加入共計(jì)1500 mL正戊烷（300 mL/次，浸提15 min/次），以脫除脂溶性成分；過(guò)濾后，再加分5次加入共計(jì)1500 mL丙酮∶水（V/V＝7∶3）（300 mL/次，室溫條件下超聲提取，10 min/次），過(guò)濾，合并濾液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去除丙酮，剩余水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗；依次以二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯進(jìn)行液液萃取，每種溶劑萃取5次，每次200 mL；萃取后的水相再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，凍干，得粗提物。

分段：取適量所得粗提物加2.0 L水溶解，使用三聯(lián)高壓平板膜，依次經(jīng)過(guò)1500 Da和500 Da超濾膜，保留500～1500 Da區(qū)間段，濃縮并凍干（凍干條件：-40℃預(yù)凍12 h，4 h升溫至40℃，40℃干燥12 h），得“烏龍茶寡肽”，-80℃保存。

茶多酚、咖啡堿、氨基酸和總糖殘留量：稱取10 mg粗提物，以水溶解定容至100 mL，分別按照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿測(cè)定》、GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》和DNS［24］比色法檢測(cè)。

1.3.2 烏龍茶寡肽生物活性評(píng)價(jià)

（1）降血糖：α-葡萄糖苷酶抑制活性

參照 Hailong Zhang［25］和 Qianfei Huang［25,26］的方法。分別取50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（1.0 U·mL-1）與50 μL不同濃度的寡肽粗提物水溶液（62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1）在 96 孔板中震蕩使混勻，37℃下放置10 min后，加50 μL底物（5.0 mM pNP-G）溶液，繼續(xù)置于37℃下反應(yīng)20 min，立即加100 μL 0.1 M Na2CO3使酶失活，終止反應(yīng)，405 nm下測(cè)定吸光值。具體操作方式見(jiàn)表1。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)試劑添加量Table 1 Addition amount of α-glucosidase inhibition reagent （單位：μL）

每次試驗(yàn)三組平行，以樣品濃度的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，建立線性方程，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

公式如下：

α-葡萄糖苷酶抑制率（%）＝［1－（實(shí)驗(yàn)組－空白組）/（酶對(duì)照組－空白對(duì)照組）］×100%

（2）降血脂：膽酸鹽法

參照李井雷［27］等人的方法。膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線：取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（膽酸鈉25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1，甘氨膽酸鈉 25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1，牛磺膽酸鈉25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1）2 mL于具塞試管中，加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4，于70℃水浴20 min，后冰浴5 min，在387 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪得膽酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)驗(yàn)組：取3mL 1 mg·mL-1寡肽溶液，加入1 mL 0.01 M鹽酸，3 mL胃蛋白酶溶液，37℃恒溫振蕩1 h后，用0.1M NaOH調(diào)pH至6.3，加入4 mL胰蛋白酶，37℃恒溫振蕩1 h后，再依次加入4 mL 0.3 mmol·L-1膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉溶液，37℃恒溫振蕩1 h，4000 r·min-1離心20 min，取上清液2 mL，加入6 mL 60% H2SO4于70℃水浴中反應(yīng)20 min后，取出冰浴5 min，387 nm處檢測(cè)吸光度。

空白組：3 mL PBS代替樣品溶液，重復(fù)以上步驟。

各組做三個(gè)平行，通過(guò)膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線求得膽酸鹽剩余含量。

公式如下：

膽酸鹽結(jié)合率（%）＝［（膽酸鹽加入量－膽酸鹽剩余量）/膽酸鹽加入量］×100%

（3）抗氧化：DPPH法

參照鄭景茹［28］等人的檢測(cè)方法。DPPH自由基清除能力測(cè)定：配制1 mg·mL-1寡肽溶液，稀釋成62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1的樣品溶液；室溫下，向96孔板的每個(gè)孔中依次加入100 μL寡肽溶液、100 μL乙醇、及100 μL DPPH溶液（237 μg·mL-1），充分混勻，避光30 min，于515 nm處測(cè)吸光度（A）；100 μL超純水代替樣液，作為空白對(duì)照（A空），每組做三個(gè)平行，谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照。

DPPH自由基清除率（%）＝［（A空－A）/A空］×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用office excel和IBM SPSS Statistics 22.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，利用回歸分析，建立樣品濃度的自然對(duì)數(shù)值——抑制率的回歸曲線，計(jì)算IC50；使用最小顯著性差異分析法（LSD）和Games-Howell法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏龍茶寡肽得率和純度

以烏龍茶為原料，經(jīng)過(guò)脫脂、提取、液液萃取過(guò)程，得到烏龍茶寡肽粗提物1.74 g，即得率為1.74%；粗提物經(jīng)超濾過(guò)程，截取得到500～1500 Da肽段0.272 g，得率為0.27%。

茶葉中已知的主要功能性成分包括茶多酚、咖啡因、多糖類、氨基酸等，通過(guò)對(duì)茶葉寡肽粗提物中的成分進(jìn)行理化檢測(cè)，其中總糖殘余量＜1.0%，茶多酚殘余量＜0.1%，未檢測(cè)出咖啡因、氨基酸。結(jié)合相關(guān)報(bào)道［23］，截取得到的500～1500 Da分子量段物質(zhì)主要為烏龍茶寡肽。

2.2 烏龍茶寡肽生物活性

2.2.1 烏龍茶寡肽降血糖效果

烏龍茶寡肽的降血糖效果如圖1所示，該寡肽在其測(cè)試濃度范圍內(nèi)均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，并且抑制率與寡肽濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系，各濃度之間均存在顯著性差異。經(jīng)擬合計(jì)算，寡肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為0.093 mg·mL-1。

圖1 烏龍茶寡肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 1 Inhibition effect of oolong tea oligopeptides on α-glucosidase

2.2.2 烏龍茶寡肽降血脂效果

以膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉三種膽酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品，研究烏龍茶寡肽的降血脂效果。結(jié)果表明，膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程分別為：y＝0.0265x＋0.0113，R2＝0.994；y＝ 0.0203x＋ 0.0063，R2＝ 0.993；y＝0.0226x－0.0079，R2＝0.9958，均符合試驗(yàn)要求（圖2）。1 mg寡肽可以結(jié)合（24.26±1.15）%膽酸鈉、（24.10±1.15）%?；悄懰徕c和（23.66±1.12）%甘氨膽酸鈉（圖3）。

圖2 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of cholate

圖3 烏龍茶寡肽對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力Fig. 3 Cholate binding ability of oolong tea oligopeptides

2.2.3 烏龍茶寡肽抗氧化效果

如圖4所示，谷胱甘肽和烏龍茶寡肽在其測(cè)試濃度范圍內(nèi)均可清除DPPH自由基。隨著寡肽濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也相應(yīng)增加，至寡肽濃度劑量為0.7 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率最高。經(jīng)擬合計(jì)算，谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的IC50為0.099 mg·mL-1，烏龍茶寡肽對(duì)DPPH自由基的IC50為0.033 mg·mL-1，說(shuō)明在同等濃度條件下，烏龍茶寡肽的抗氧化能力優(yōu)于谷胱甘肽。

圖4 谷胱甘肽和烏龍茶寡肽對(duì)DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH scavenging ability of glutathione and oolong tea oligopeptides

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，寡肽作為一種新型活性物質(zhì)被大眾熟知，主要采用酶解提取技術(shù)制得，工藝簡(jiǎn)單［14,29］，即選擇合適的酶水解大分子蛋白質(zhì)得到寡肽。本研究借鑒可可豆肽的制備方法，利用寡肽的化學(xué)性質(zhì)，采用丙酮水溶液直接提取茶葉中天然存在的寡肽，為茶葉中天然存在的寡肽的開(kāi)發(fā)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。茶葉富含茶多酚、茶多糖、茶色素、生物堿、氨基酸等多種生物活性成分，藥理作用表現(xiàn)在抗氧化、體重控制、防治心血管疾病、抗糖尿病等方面，本研究采用膜分離方式制得新型活性物質(zhì)——烏龍茶寡肽，并初步探索其生物學(xué)活性。

糖尿病是由于胰島素缺失產(chǎn)生的代謝性疾病，并且仍是當(dāng)今研究中的重點(diǎn)。α-葡萄糖苷酶又稱為α-葡萄糖苷水解酶，可以促進(jìn)體內(nèi)葡萄糖的釋放，從而導(dǎo)致血糖含量升高，抑制α-葡萄糖苷酶活性表達(dá)可有效防止血糖升高，從而調(diào)節(jié)血糖水平。試驗(yàn)表明，烏龍茶寡肽可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，并且隨著寡肽濃度的升高，且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)降血糖的效果，后續(xù)研究可進(jìn)一步從寡肽作用機(jī)制及具體活性結(jié)構(gòu)入手，開(kāi)發(fā)相關(guān)的茶葉寡肽活性產(chǎn)品。

另一方面，血脂水平與各類心血管疾病密切聯(lián)系。高血脂多發(fā)生在老年人群體，容易引發(fā)動(dòng)脈硬化，冠心病等癥狀。藥物通過(guò)結(jié)合膽酸鹽，阻止膽汁酸的重吸收，降低體內(nèi)膽汁酸含量，從而促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，進(jìn)而降低膽固醇水平。有研究表明［28］，茶葉可以與膽酸鹽結(jié)合，達(dá)到降血脂的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶寡肽對(duì)膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉的結(jié)合能力為24%左右，作用效果較低，可能與反應(yīng)時(shí)間以及寡肽濃度存在一定的量化關(guān)系，后續(xù)需進(jìn)一步探討。

目前關(guān)于茶葉抗氧化的體外實(shí)驗(yàn)，主要有清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子，以及鐵離子還原能力等［30］。本研究檢測(cè)烏龍茶寡肽清除DPPH自由基的能力，其IC50為0.033 mg·mL-1，低于陽(yáng)性對(duì)照——抗氧化劑谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的IC50（0.099 mg·mL-1），表明寡肽的抗氧化能力優(yōu)于谷胱甘肽。

綜上所述，本研究初步探究了閩北烏龍茶寡肽的生物學(xué)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且具備一定的降血糖和降血脂能力，后續(xù)可進(jìn)一步在寡肽氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行活性研究。