李井賀，李 淼，石海濤，黎 江，譚躍榮，蘇廣旭，彭璐媛，申海清，付本懂，伊鵬霏 (吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是一種重要的人獸共患病病原菌，臨床主要癥狀是引起腹瀉，情況嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重威脅生命健康，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。ETEC致病方式主要通過產(chǎn)生黏附素和腸毒素，黏附素也叫定植因子，是一種菌毛蛋白，主要功能是介導(dǎo)細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附。黏附素可以幫助ETEC避免腸道清除作用，進(jìn)而可以在固定部位產(chǎn)生腸毒素，發(fā)揮致病作用。菌毛是ETEC引起腹瀉的關(guān)鍵[2]。腸毒素主要分為熱穩(wěn)定腸毒素和熱不穩(wěn)定腸毒素，在胞外發(fā)揮作用[3-5]。臨床治療大腸桿菌病的藥物主要是抗生素，但是由于細(xì)菌耐藥和抗生素殘留等問題，臨床逐漸限用抗生素，因此選擇替代抗生素的藥物成為關(guān)鍵[6]。

槲皮素化學(xué)式為C15H10O7，是一種黃酮親脂性植物化學(xué)物質(zhì)，也是自然界多酚類化合物之一，存在于大量常見的中藥和蔬菜水果中。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有降低血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌等作用[7-10]。

RNA-seq是轉(zhuǎn)錄測序的一種，通過高通量測序?qū)RNA、sRNA、非編碼RNA或其中的一部分進(jìn)行測序，以反映其表達(dá)水平，具有通量高、重復(fù)性好、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域廣泛使用[11-13]。因此，本研究擬借助RNA-seq技術(shù)分析槲皮素對大腸桿菌的作用，為尋找抗生素替代藥物提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑菌株：大腸桿菌O139(CVCC-1496)購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

儀器：空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司)；電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；Q6000+紫外可見核酸蛋白測量儀(北京Quawell公司)；BioTek多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(日本YAMATO公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

試劑：槲皮素(成都曼斯特生物科技有限公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；LB (Luria-Bertani)瓊脂及LB肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司)；Trizol(大連寶生物工程有限公司)；無水乙醇(成都市科龍化工試劑廠)；氯仿及異丙醇(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；miRNeasy Mini kit(QIAGEN)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×M5 Hiper Realtime PCR Super mix with Low Rox(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.2 菌種活化及培養(yǎng)將保存在-80℃的ETEC-O139取100 μL接種于30 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min的搖床活化5 h，然后將活化的菌劃線于LB瓊脂培養(yǎng)基后，置37℃恒溫培養(yǎng)箱12 h。

1.3 最小抑菌濃度(MIC)測定調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，用倍比稀釋法配置不同藥物質(zhì)量濃度，第1管取4 mL菌液并加入槲皮素，使其最終質(zhì)量濃度為20 mg/L，其余4管分別加入2 mL菌液，從第1管吸出2 mL液體加入第2管，依次倍比稀釋，最后1管不做任何處理。將配好的液體接種于24孔板，每孔0.5 mL，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，酶標(biāo)儀測600 nm處的D值。

1.4 ETEC-O139生長曲線測定取D600 nm=1.0的菌液以1∶500比例接種于50 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，用Q6000每2 h測定一次D600 nm值，共20 h。

1.5 RNA-seqETEC-O139在LB培養(yǎng)基37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL，設(shè)置3個(gè)組，ETEC-O139組、10 mg/L槲皮素組和20 mg/L槲皮素組，37℃恒溫培養(yǎng)4 h。使用miRNeasy Mini kit提取RNA，然后進(jìn)行總RNA樣本檢測。檢測合格后，去除rRNA，之后合成雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成，進(jìn)行庫檢。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行HiSeq/MiSeq測序。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq的差異表達(dá)基因

1.6.1細(xì)菌總RNA的提取及檢測 調(diào)整細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL，設(shè)置3個(gè)組，ETEC-O139組、10 mg/L槲皮素組和20 mg/L槲皮素組，37℃恒溫培養(yǎng)4 h。取菌液使用TRIzol法進(jìn)行RNA提取。使用微量核酸蛋白測定儀測定菌體RNA的濃度和純度，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.6.2反轉(zhuǎn)錄體系 根據(jù)測定的RNA濃度結(jié)果，將提取的RNA量調(diào)整一致。根據(jù)M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以rrsG為內(nèi)參基因，選取與ETEC-O139生物膜及群體感應(yīng)相關(guān)基因作為目標(biāo)擴(kuò)增基因，根據(jù) NCBI 上已經(jīng)公開發(fā)表的大腸桿菌基因的序列，利用 Primer 5.0 軟件，分別設(shè)計(jì)上游引物和下游引物。引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。各基因的引物信息如表1所示。Real-time PCR反應(yīng)體系：2×M5 Hiper Realtime PCR Super mix with Low Rox 10 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；cDNA 2 μL；RNase free H2O 7 μL；總體積20 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s， 60℃退火和延伸1 min,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析：建立各基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過斜率、決定系數(shù)和擴(kuò)增效率值3個(gè)參數(shù)共同評估各引物。試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法評估目的基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 最小抑菌濃度由圖1可知，經(jīng)過槲皮素處理的ETEC-O139組與未處理的ETEC-O139組相比，在600 nm處的D值并沒有顯著差異。因此，可以確定槲皮素在2.5～20 mg/L藥物質(zhì)量濃度不會(huì)抑制ETEC-O139的生長。后續(xù)試驗(yàn)選擇槲皮素質(zhì)量濃度為10，20 mg/L。

圖1 最小抑菌濃度測定

2.2 ETEC-O139生長曲線結(jié)果由圖2可知，與ETEC-O139組比較，經(jīng)過藥物處理的ETEC-O139組的細(xì)菌在不同的時(shí)間點(diǎn)上的D600 nm值并沒有顯著變化；表明藥物處理后并未影響細(xì)菌生長。根據(jù)生長曲線和MIC確定后續(xù)試驗(yàn)槲皮素與細(xì)菌的作用時(shí)間為4 h。

圖2 槲皮素對ETEC-O139生長曲線的影響

2.3 RNA-seq結(jié)果

2.3.1測序質(zhì)量評估 對測序結(jié)果進(jìn)行圖像識(shí)別，去污染、去接頭后得到Clean reads數(shù)量以及GC含量百分比等。各組A、T、C、G含量分布接近，并未出現(xiàn)分離情況。各組Q值均高于30，根據(jù)錯(cuò)誤率計(jì)算公式Q=-10lg(error rate)，說明各組堿基錯(cuò)誤率低于0.1%。另外，各組GC含量分布屬于正態(tài)分布。綜合以上結(jié)果，說明各組測序數(shù)據(jù)可靠，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3.2差異基因表達(dá) 根據(jù)設(shè)定的閾值，在生成的MA plot和volcano plot兩種圖，均反映差異基因整體分布情況，槲皮素與ETEC-O139相互作用后，ETEC-O139整體的一些基因發(fā)生了變化。其中共有24個(gè)差異表達(dá)基因，19個(gè)基因上調(diào)，5個(gè)基因下調(diào)。

2.3.3差異基因GO富集分析 基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，GO)包括基因的生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三個(gè)方面。如圖3A所示，與ETEC-O139組相比，用10 mg/L 的槲皮素處理后，槲皮素在細(xì)胞及細(xì)胞區(qū)域、細(xì)胞膜及膜區(qū)域和巨型分子復(fù)合物等部位發(fā)揮結(jié)合和催化活性的分子功能，引起ETEC-O139的細(xì)胞過程、代謝過程、對刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、定植、移動(dòng)和單細(xì)胞過程和多細(xì)胞過程等細(xì)胞表型發(fā)生變化。如圖3B所示，與ETEC-O139組相比，用20 mg/L的槲皮素處理后，槲皮素在細(xì)胞及細(xì)胞區(qū)域、細(xì)胞膜及膜區(qū)域和巨型分子復(fù)合物等部位發(fā)揮結(jié)合、催化活性和核酸轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能，引起ETEC-O139的細(xì)胞過程、代謝過程、對刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、定植和單細(xì)胞過程和多細(xì)胞過程等細(xì)胞表型發(fā)生變化。結(jié)果表明，槲皮素對ETEC-O139發(fā)揮一定分子功能，會(huì)導(dǎo)致ETEC-O139的表型發(fā)生變化。

A.ETEC-O139組與 10 mg/L槲皮素組;B.ETEC-O139組與 20 mg/L槲皮素組圖3 差異基因GO分類柱狀圖

2.3.4KEGG富集分析 如圖4所示，差異表達(dá)基因發(fā)生變化的Pathway Hierarchy1分別是細(xì)胞過程(cellular processes，CP)、環(huán)境信息處理(environmental information processing，EIP)和代謝(metabolism，M)。另外，如圖4A所示，ETEC-O139用10 mg/L槲皮素處理后，差異表達(dá)基因發(fā)生變化的Pathway Hierarchy2分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、其他氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝以及核酸代謝。如圖4B所示，ETEC-O139用20 mg/L槲皮素處理后，差異表達(dá)基因發(fā)生變化的Pathway Hierarchy2分別為原核細(xì)胞細(xì)胞群落、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、其他氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝、核酸代謝和多糖合成和代謝。根據(jù)富集最顯著的通路(KEGG pathway，即Pathway Hierarchy3)繪制出差異表達(dá)基因KEGG富集散點(diǎn)圖。經(jīng)過10 mg/L槲皮素處理后，差異表達(dá)基因發(fā)生變化的KEGG pathway分別為嘧啶代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、泛酸和輔酶A的合成、β-丙氨酸代謝、細(xì)菌趨化和雙補(bǔ)體系統(tǒng)。經(jīng)過20 mg/L槲皮素處理后，差異表達(dá)基因發(fā)生變化的KEGG pathway分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、生物膜生成、脂多糖合成、群體感應(yīng)、嘧啶代謝、雙補(bǔ)體系統(tǒng)、泛酸和輔酶A的合成、β-丙氨酸代謝。一些重要的基因在通路中的變化如表2所示。

A.ETEC-O139組與10 mg/L槲皮素組;B.ETEC-O139組與20 mg/L槲皮素組。圖4 差異基因KEGG分類圖

表2 差異表達(dá)基因相關(guān)通路變化

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證相關(guān)基因表達(dá)的變化為了驗(yàn)證RNA-seq的準(zhǔn)確性，選擇qRT-PCR對相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示，與ETEC-O139組相比，經(jīng)過槲皮素處理的ETEC-O139的lsrR、mglA、mglB、kdsD、waaA、waaF和gmhA基因的表達(dá)水平顯著下降。

圖5 槲皮素對ETEC-O139相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

臨床治療大腸桿菌病的藥物主要是抗生素，但是抗生素帶來的食品安全問題和耐藥問題，迫使人們不得不更換新的治療途徑。靶向細(xì)菌毒力因子成為一種新的抗菌療法，不直接殺菌因而不會(huì)對細(xì)菌造成生長壓力，降低細(xì)菌耐藥性發(fā)生率[14]。近年來槲皮素成為研究熱點(diǎn)，槲皮素具有多種生物學(xué)功能，例如抗增殖和抗凋亡作用，抑制癌細(xì)胞的生長，如肺癌、乳腺癌、食道癌和結(jié)腸癌等[15-16]。許多研究表明，槲皮素可以作為群體感應(yīng)抑制劑[8,17-19]，同時(shí)還有資料表明槲皮素具有抑制細(xì)菌生物膜生成的作用[20]。

藥物在2.5～20 mg/L質(zhì)量濃度時(shí)對細(xì)菌生長不會(huì)產(chǎn)生抑制作用，因此選擇10,20 mg/L兩個(gè)藥物質(zhì)量濃度與ETEC-O139相互作用進(jìn)行RNA-seq試驗(yàn)。根據(jù)RNA-seq綜合數(shù)據(jù)評估分析可知數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。將差異基因進(jìn)行Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)ETEC-O139經(jīng)過槲皮素處理過后，相應(yīng)的生物過程發(fā)生變化，生物過程決定生物表型，說明相應(yīng)的表型也發(fā)生了變化。為了驗(yàn)證表型變化是如何實(shí)現(xiàn)的，將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析。差異表達(dá)基因發(fā)生變化的通路主要有脂多糖合成、群體感應(yīng)、生物膜生成、細(xì)菌趨化、雙補(bǔ)體系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、泛酸和CoA合成、β-丙氨酸代謝和嘧啶代謝。脂多糖即內(nèi)毒素，構(gòu)成大部分革蘭陰性菌外膜，主要由3部分組成：脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原[21]。群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種細(xì)菌細(xì)胞間的交流，這種交流的基礎(chǔ)是一種自誘導(dǎo)分子 (autoinducer，AI)。群體感應(yīng)主要通過AI調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，因此可以影響細(xì)菌群體密度變化[22-23]。細(xì)菌趨化即細(xì)菌感受環(huán)境中的化學(xué)梯度，向更有利的環(huán)境條件移動(dòng)的過程。動(dòng)態(tài)微生物如大腸桿菌可以通過甲基接受趨化蛋白的跨膜受體來檢測和跟蹤環(huán)境中的化學(xué)梯度變化，大腸桿菌模型也是研究最多的趨化模型[24]。雙補(bǔ)體系統(tǒng)主要在調(diào)節(jié)細(xì)菌生長和運(yùn)動(dòng)、生物膜生成、毒力因子產(chǎn)生以及在細(xì)菌耐藥等方面發(fā)揮作用，因?yàn)榧?xì)菌必須不斷感知環(huán)境變化，才能生存和繁殖[25]。細(xì)菌趨化是雙補(bǔ)體系統(tǒng)的相關(guān)通路，但是，我們在RNA-seq分析中發(fā)現(xiàn)兩者并非通過相關(guān)上下游方式發(fā)生變化，而是單獨(dú)發(fā)生變化。ABC (ATP-binding cassette) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種完整的膜內(nèi)蛋白，是已知最大的蛋白家族之一，可以利用ATP水解為ADP產(chǎn)生能量逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)分子通過脂質(zhì)膜[26]，由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)核苷酸結(jié)構(gòu)域組成。β-丙氨酸代謝是嘧啶代謝、泛酸和CoA合成的相關(guān)通路，嘧啶代謝是β-丙氨酸代謝通路的上游，泛酸和CoA的合成是β-丙氨酸代謝通路的下游，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)三者通過相同基因建立相關(guān)通路，說明藥物引起三者發(fā)生變化是通過相關(guān)上下游通路作用的。KEGG整體反映藥物與細(xì)菌相互作用后主要是在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、催化反應(yīng)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和代謝發(fā)生變化，GO分析和KEGG分析結(jié)果相互印證。

為了驗(yàn)證RNA-seq分析，我們選擇了調(diào)節(jié)毒力因子以及致病相關(guān)的通路中的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。在大腸桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中，lsrR是群體感應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中l(wèi)sr的抑制子，可以阻礙lsr轉(zhuǎn)運(yùn)自誘導(dǎo)分子AI-2進(jìn)而發(fā)揮抑制群體感應(yīng)的作用[27]。RNA-seq分析顯示lsrR屬于上調(diào)基因，通過qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)藥物抑制lsrR的表達(dá)，但是隨著藥物濃度增加lsrR的表達(dá)呈現(xiàn)出上升趨勢。mglB在參與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)過程發(fā)揮重要作用，細(xì)菌在環(huán)境中需要通過調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)優(yōu)化自己與環(huán)境之間的作用[28]。 RNA-seq分析結(jié)果表明，mglB屬于上調(diào)表達(dá)基因，經(jīng)過qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)藥物抑制mglB的表達(dá)，但隨著藥物質(zhì)量濃度增加，mglB的表達(dá)量也逐漸增加。另外，mglA的表達(dá)趨勢和mglB的表達(dá)趨勢也是一致的。針對這兩個(gè)通路，并沒有對通路中其他基因進(jìn)行驗(yàn)證。但是RNA-seq分析中發(fā)現(xiàn)槲皮素抑制脂多糖合成過程中的kdsD的表達(dá)，kdsD是阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶，在脂多糖合成過程中發(fā)揮重要作用[29]，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致，而且隨著藥物濃度增加呈現(xiàn)出表達(dá)遞減趨勢。根據(jù)這一結(jié)果，對脂多糖合成過程中的其他基因也進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明槲皮素也抑制waaA、waaF和gmhA基因的表達(dá)，這3個(gè)基因在脂多糖合成過程中發(fā)揮重要作用，因此可以說明槲皮素可通過抑制脂多糖的合成達(dá)到降低產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致病性的作用。

綜上所述，本研究為槲皮素可以替代抗生素治療產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的藥物提供理論依據(jù)，槲皮素不直接殺菌，而是通過抗毒力方式作用于產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。根據(jù)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素調(diào)節(jié)毒力因子可能不止通過一個(gè)靶點(diǎn)，其他靶點(diǎn)有待于后續(xù)研究。