彭練慈，蘆 懿，田洪亮，陳紅偉，葉 超，方仁東 (西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 北碚 400715)

隨著全球多重耐藥菌株的日益增加，能有效控制感染的抗生素急劇減少。此外，許多慢性炎癥性疾病的常用治療方法(如皮質類固醇)會增加感染的風險及產生具有耐藥性的頑固性病原體[1]。因此，迫切需要開發(fā)既可以殺死病原菌又可以解決有害炎癥的新型抗菌藥物。宿主防御肽(host defense peptides,HDPs)作為宿主自身分泌的小分子多肽，廣泛分布于不同動物體內，具有廣譜的抗菌活性[2]。

抗菌肽主要通過誘導細胞膜的極化導致菌體破裂而發(fā)揮作用，由于不涉及其他靶標，因此不易產生細菌耐藥性，在新型抗菌藥物的研發(fā)領域具有很大的優(yōu)勢和潛力。CATHs家族的抗菌肽作為宿主防御肽中的重要抗菌肽家族，除了具有更廣譜高效的抗微生物活性，還具有低細胞毒性、低溶血、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、促進傷口愈合和免疫調節(jié)等多種重要活性[3-4]，在新型抗感染及免疫調節(jié)藥物的研發(fā)領域具有巨大的潛力。

在所有CATHs生物活性的研究中，人源CATH (LL-37)的研究最為廣泛。近年來，牛、馬、豬等哺乳動物CATHs的生物活性也受到獸醫(yī)領域研究者的廣泛關注[5-8]，但是關于雞源CATHs的報道并不多。自2006年和2007年相繼發(fā)現(xiàn)雞體內的CATHs后，近十幾年來，雞源CATHs的研究也取得了一定的進展，其生物活性也在逐步被挖掘?，F(xiàn)對雞源CATHs結構與活性的關系、分布與表達、抗微生物活性、免疫調節(jié)活性等方面進行綜述，并對其應用前景進行綜合分析。

1 雞源CATHs結構與活性的關系

迄今為止，雞CATHs包括fowlicidin-1 (cathelicidin-1,CATH-1)、fowlicidin-2 (cathelicidin-2,CATH-2 )、 fowlicidin-3 (cathelicidin-3,CATH-3)和cathelicidin-B1 (CATH-B1)[9-10]。

CATHs 的前體由N-端信號肽區(qū)域(29～30 aa)、中間保守cathelin區(qū)域(94～114 aa)和高度特異的C-末端成熟肽區(qū)域 (12～100 aa)構成[3]。編碼C-末端成熟肽區(qū)域的序列具有多樣性，導致形成不同長度、不同電荷密度和結構差異的成熟抗菌肽。所有CATHs都帶正電荷，使CATHs可以和帶負電荷的細菌細胞膜相互作用，從而發(fā)揮抗菌活性，且不易產生耐藥性。

CATH-1、CATH-2和CATH-3具有α-螺旋結構，都是由中間的鉸鏈區(qū)域將C-末端的α-螺旋結構和N-末端的氨基殘基連結而成[11-13]。XIAO等[11]研究表明fowlicidin-1的α-螺旋結構包含的8個氨基殘基與其抗菌、溶血及中和LPS活性緊密相關。BOMMINENI等[14-15]證實fowlicidin-1在體內外均具有廣譜抗菌活性及免疫調節(jié)活性。fowlicidin-3的α-螺旋結構功能區(qū)是由第17 位甘氨酸扭結連結9～25位的氨基殘基構成[12]，具有廣譜抗菌活性，但是QU等[16]研究表明，fowlicidin-3中間鉸鏈區(qū)(-AGIN-)并無抗菌活性，反而能增加溶血活性和細胞毒性。與fowlicidin-3相反的是，XIAO等[13]和VAN DIJK等[17]研究表明，CATH-2的鉸鏈區(qū)域(氨基殘基13～20)對其抗菌活性和免疫調節(jié)活性具有重要作用。這些研究結果說明抗菌肽的結構對其功能的發(fā)揮起了關鍵性的作用，抗菌肽結構與活性關系的研究對于優(yōu)化抗菌肽序列、增強生物活性及抗菌肽的應用具有指導性的意義。與其他3種抗菌肽研究相比，關于CATH-B1的結構知之甚少，它的氨基酸序列已被預測，但分子構象尚未確定[10]。PENG等[18-19]最新的研究表明CATH-B1具有良好的抗病毒及免疫活性，但是它的結構與活性的關系還有待進一步研究。

2 雞源CATHs的分布與表達

CATHs在上皮細胞、黏膜表面和皮膚少量表達，主要是由中性粒細胞和單核吞噬細胞釋放。首先以失活的前體形式儲存在粒細胞的分泌顆粒中，當機體受到病原微生物入侵時，被彈性蛋白酶切割為成熟的抗菌肽釋放到機體中進而發(fā)揮生物學功能。VAN DIJK等[20]和SEKELOVA等[21]分別通過抗體及液相色譜-質譜法檢測到CATH-1、CATH-2和CATH-3蛋白均在異嗜性粒細胞中表達，類似于人源CATH (LL-37)在中性粒細胞中大量表達[22]，分布于機體的全身。GOITSUKA等[10]發(fā)現(xiàn)CATH-B1蛋白在法氏囊的上皮細胞中表達，值得一提的是，此上皮細胞是病原入侵粘膜淋巴組織的主要靶標，說明CATH-B1在法氏囊抵御病原入侵中起到了重要作用。但是，目前并未檢測其他組織是否有CATH-B1蛋白的表達，因此它的表達分布還需進一步的研究。

雞CATHs基因在機體中的表達更為廣泛，主要是在皮膚、呼吸道、胃腸道和淋巴器官中表達[23]。與蛋白表達類似，CATH-1、CATH-2、CATH-3的mRNA在骨髓細胞中大量表達，而CATH-B1 mRNA在法氏囊中大量表達[10]。有趣的是，CATH-2 mRNA也在(禽尾部)油脂腺中表達，脂腺分泌物中含有抗菌物質，這些抗菌物質可以轉移到皮膚并防止感染[24]。此外，4種CATHs mRNA在胚胎時期就開始表達[25-26]，之后在發(fā)育成熟的早期，在肺臟、法氏囊、腸道等不同組織中表達量逐步上調[23]，說明抗菌肽在體內的廣泛分布對抵抗病原體的入侵起著重要作用。

雞CATHs表達受體內外炎性或微生物刺激等多種因素的影響。VAN DIJK等[20]在感染腸炎沙門菌8 h后肉雞空腸的異嗜性細胞中觀察到大量的CATH-2。與沙門菌感染相反，空腸彎曲菌感染不會誘導募集異嗜性細胞到小腸，并且小腸中的CATH-2 mRNA表達在感染48 h后下調[27]。空腸彎曲菌也會下調CATH-1和CATH-3 mRNA表達，但是并不影響CATH-B1 mRNA表達[28]。PENG等[18]最新的研究發(fā)現(xiàn)，禽致病性大腸桿菌(APEC)感染巨噬細胞(HD11和原代單核細胞分化的巨噬細胞)可誘導CATH-B1 mRNA表達。這些研究結果表明，不同的病原感染可誘導不同種類抗菌肽的表達，抗菌肽的表達有助于宿主抵御病原的感染，但是抑制抗菌肽的表達可能也是病原逃逸宿主清除的機制之一。

維生素D和短鏈脂肪酸可誘導不同細胞表達LL-37，近期研究結果表明，它們也可誘導雞CATHs的表達。RODRIGUEZ等[29]發(fā)現(xiàn)飼喂維生素D可增加雞脾臟CATH-1和CATH-B1的表達水平。SUNKARA等[30]發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸(丁酸鹽)在巨噬細胞HD11中誘導CATH-B1的表達，口服丁酸鹽可誘導雞空腸和盲腸外植體CATH-B1的表達，而且經丁酸鹽處理后的巨噬細胞具有更好的抗菌能力。人源CATHs被維生素D和短鏈脂肪酸誘導表達的機制已經被廣泛研究，目前誘導其它動物源CATHs表達的機制并不清楚，這也是雞源CATHs研究的空白之一，但是尋找高效誘導CATHs表達的化合物是宿主抵御病原侵入的有效途徑之一，也是減少或替代抗生素使用的有效途徑之一。

3 雞源CATHs的抗微生物活性

抗菌活性是抗菌肽最經典的功能之一(圖1)，CATH-1、CATH-2、CATH-3均具有廣譜的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌、肺炎球菌、綠膿桿菌以及一些耐藥菌株等均具有良好的抗菌作用，其最小抑菌濃度(MIC)可低至0.4 μmol/L[9,12]。CATH-B1與其他3種抗菌肽相比，其抗菌譜較窄，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有效，當被測試的菌液濃度低至2×103CFU時，其MIC的范圍是0.63～2.5 μmol/L[10]，但是當菌液濃度提高至5×105CFU時，CATH-B1的MIC增加至12.5 μmol/L[31]。值得一提的是，大多數抗菌肽在生理環(huán)境中的抗菌活性降低，已成為抗菌肽應用的一大難題。VELDHUIZEN等[32]研究表明血清對CATH-1、CATH-2、CATH-3的抗菌活性并無太大影響，并且不會引起多重耐藥菌的耐藥性。除了在體外具有抗菌作用，抗菌肽在體內也具有抗感染活性。CUPERUS等[33]發(fā)現(xiàn)CATH-2對感染APEC的小雞具有明顯的保護作用，通過減少肺組織中的細菌感染量，最終降低了動物的死亡率。這些研究結果表明，雞源CATHs具有被研制成為新型抗菌藥物的潛力。

圖1 雞源CATHs的生物活性總結圖

雞源CATHs除了具有抗浮游菌活性外，MOLHOEK等[34]和CHEN等[35]研究表明CATH-2也可以抑制細菌生物被膜的形成。ORDONEZ等[36]報道CATH-2具有抗真菌活性，并且能在5 min內快速滲透進真菌細胞膜內。它們的抗菌機理主要是作用于細菌細胞膜，通過細菌細胞膜滲透進菌體內從而殺死細菌。有趣的是，SCHNEIDER等[37]發(fā)現(xiàn)CATH-2在低于MIC濃度下依然能滲透進菌體內阻礙細菌DNA和核糖體的合成，此外還會誘導細菌外膜囊泡的釋放，這些由抗菌肽誘導形成的外膜囊泡為疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

除了具有抗菌活性，雞源CATHs在近期首次被報道具有抗病毒活性。PENG等[19]發(fā)現(xiàn)4種CATHs在體外均具有一定的抗流感病毒(IAV)活性，其中CATH-B1具有最好的抗病毒活性，主要通過干擾病毒表面蛋白血凝素活性從而抑制病毒與細胞結合，最終阻止病毒的入侵。由于CATH-B1蛋白在機體分布位置的特殊性，推測CATH-B1在法氏囊內具有特殊的抗病毒功能，例如抑制傳染性法氏囊病毒(IBDV)的復制，但是此活性還需進一步的研究。

4 雞源CATHs的免疫調節(jié)活性

人源CATH(LL-37)的免疫調節(jié)功能已經被廣泛研究。LL-37可以抑制LPS誘導的免疫反應、調節(jié)免疫細胞的遷移分化和調控Toll樣受體(TLRs)的激活。LL-37可以直接作用于類甲酰肽受體(FPRL1)誘導細胞的趨化，也可以作用于P2X7受體誘導炎癥小體的激活。近期文獻報道，LL-37通過誘導溶酶體釋放組織蛋白酶B(cathepsin B)從而激活NLRP3炎癥小體，最終導致IL-1β和IL-18的釋放[38]。

雞源CATHs與LL-37具有一些相似的功能活性(圖1)。4種雞源CATHs 都可以與LPS/LTA結合，抑制TNF-α、IL-1β、IL-8 和IL-6等炎性因子的產生[12,15,17-18,31]。BOMMINENI等[15]研究表明CATH-1在體外能直接誘導巨噬細胞的活化，增強細胞因子、細胞標志物CD86和MHC-Ⅱ的表達。KRAAIJ等[39-40]研究發(fā)現(xiàn)，CATH-2也可以增加巨噬細胞表面的CD86、MHC-Ⅱ、MRC1、CD40等抗原遞逞受體的表達，也可以影響T和B細胞標志蛋白的表達。CATH-2也可以直接刺激細胞產生巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，CATH-B1可以增強巨噬細胞對細菌的吞噬能力[18]。這些研究表明抗菌肽對先天和后天免疫均具有重要作用，而且可能通過作用于細胞內的受體從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。

在4種雞源CATHs免疫調節(jié)活性機制的研究中，CATH-2的研究最為廣泛。COORENS等[41-42]研究表明，CATH-2可以通過與病原的相互作用抑制TLR2和TLR4的活化，還可以與DNA結合，增強細胞對DNA的吞噬，從而增強DNA介導的TLR9的激活，但是目前尚不清楚與CATH-2直接作用的胞內具體受體分子。以后的研究可以通過單細胞測序的技術篩選出CATH-2在胞內的靶向受體分子，為抗菌肽作為免疫調節(jié)藥物的研發(fā)奠定基礎。

5 雞源CATHs應用前景分析

由于CATHs家族抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，最初的研究都專注于開發(fā)抗菌肽成為新型抗菌藥物，但是近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽對于機體的免疫起著至關重要的作用。目前，雞源CATHs被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、增強抗原呈遞及吞噬活性、正向調控獲得性免疫等功能(圖1)。因此，在針對各種臨床感染疾病的藥物研發(fā)背景下，開發(fā)抗菌肽作為抗感染及免疫調節(jié)藥物緩解慢性疾病誘導的炎癥等具有良好的前景。最近，CATHs的外源性給藥已被用于多種動物感染模型，例如，LL-37能保護小鼠免受銅綠假單胞菌、流感病毒的感染[43]，卵內注射 CATH-2 可保護雞呼吸道抵御大腸桿菌感染[33]。除此之外，PENG等[44]最新的研究表明，豬源抗菌肽與IL-4/6聯(lián)合形成的殼聚糖納米顆粒增強了小鼠的免疫保護作用。這些研究都說明抗菌肽具有開發(fā)成為抗感染藥物的巨大潛力，為獸醫(yī)臨床實現(xiàn)“減抗、替抗、協(xié)抗”提供科學的理論依據。值得注意的是，目前已有少數的抗菌肽處于臨床測試中，例如LL-37用于臨床治療下肢靜脈潰瘍[43]，這些測試為抗菌肽應用于獸醫(yī)臨床提供了參考依據。

不可避免地，CATHs抗菌肽的臨床應用依然面臨在體內易降解、制劑難成形、合成成本高等挑戰(zhàn)。但是隨著抗菌肽的廣泛研究，可以通過合成D型氨基酸肽、乙酰化或酰胺化修飾肽鏈、有針對性的替代非必須氨基酸等方法增加抗菌肽的穩(wěn)定性[45]。CUPERUS等[33]通過合成D型CATH-2提高了抗菌肽在體內的穩(wěn)定性，從而使其高效地發(fā)揮抗菌活性。也可以利用材料工程技術和體內追蹤技術，建立把抗菌肽包裹在可降解高分子材料中心的制備方法，通過調節(jié)載體材料的親水疏水性及分子量，調控抗菌肽的釋放時間，有效的解決抗菌肽在體內易降解及作用時間短的難題，提高抗菌肽在體內的利用效率。PENG等[46]通過使用納米粒子材料靶向運輸抗菌肽或減緩抗菌肽在體內的釋放，從而提高抗菌肽抗菌能力。還可以通過篩選出促進抗菌肽表達的化合物，基于這些化合物的飼料添加劑可以有效地刺激抗菌肽表達從而提高動物的免疫保護作用，最終相對降低抗菌肽的合成成本[29]。雖然雞源CATHs的應用還處于初級階段，但是其功能研究已經取得了較大的進展，雞源CATHs廣譜高效的抗菌活性和免疫調節(jié)活性已經在獸醫(yī)領域展示了一定的應用前景。此外，近年來材料學科的迅速發(fā)展，不同學科之間的交叉融合，也將為抗菌肽的臨床應用提供堅實的基礎。