張雨強，駱婕，郭琴，趙曼丹，陶瑩

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510030）

子宮頸癌（cervical cancer）是威脅全球婦女生命健康的主要惡性腫瘤之一。據(jù)報道：子宮頸癌在女性惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中居世界第4位[1]，而中國的子宮頸癌發(fā)病率排第6位，死亡率排第8位[2]，且近年來子宮頸癌有逐步年輕化趨勢。細胞周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent kinases 9，CDK9）是絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶家族成員之一[3]，其通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNA PolⅡ）上的羧基末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD），調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄過程[4]，從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖及侵襲。p53凋亡刺激蛋白家族抑制成員（inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53,iASPP）為p53的抑制因子，不僅能夠抑制p53誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄活化的作用，也能抑制p53促細胞凋亡的功能[5]，從而造成細胞異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前，國內(nèi)外對CDK9和iASPP的研究主要集中于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、白血病等，關(guān)于兩者在子宮頸癌中的研究較少。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測CDK9和iASPP在不同子宮頸組織中的表達，分析CDK9、iASPP表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。初步探討CDK9、iASPP在子宮頸癌發(fā)生過程中的作用機制，進一步探討CDK9、iASPP在子宮頸癌早期診斷和臨床預(yù)后評估中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇來自廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2016年9月至2020年9年行手術(shù)治療或活檢確診的124位患者，其中癌癥組（子宮頸癌患者45位）、高級別組（子宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變患者40位）和低級別組（子宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組織39位），另選擇21位同期因“子宮平滑肌瘤”行全子宮切除術(shù)，術(shù)后病理是正常子宮頸組織的患者為對照組。所有入選病例均經(jīng)病理診斷，術(shù)前或活檢前均未進行藥物、化學(xué)、放射和激光等治療。其中，根據(jù)FIGO 2018年子宮頸癌分期標準，45例子宮頸癌患者的臨床分期在ⅠA-ⅣB期。

1.2 實驗試劑與方法

兔抗人CDK9多克隆抗體（BC001968，1∶200）、兔抗人iASPP多克隆抗體（BC064913，1∶800）購自美國Proteintech公司；通用型SP免疫組化染色試劑盒為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品。標本用福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm，脫蠟、水化，修復(fù)抗原，滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，復(fù)染，密封，鏡檢。

1.3 結(jié)果判斷

CDK9表達定位于細胞核，表現(xiàn)為黃色或棕黃色。iASPP表達定位于細胞核和（或）細胞質(zhì)，表現(xiàn)為黃色或棕黃色。CDK9和iASPP根據(jù)染色強度（無著色為0，淡黃色為1，黃色為2，棕黃色為3）和陽性細胞百分比（＜5%為0，5%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，＞75%為4）分別計分，將兩種評分相乘即為免疫組織化學(xué)結(jié)果最后得分。得分范圍為0～12分，其中0分為陰性（-），1～3分為弱陽性（+），4～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。陽性表達結(jié)果包括（+）及其以上者。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，運用單因素方差分析或Mann-WhitneyU秩和檢驗進行組間比較；采用卡方檢驗檢測CDK9和iASPP表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系；通過Spearman等級相關(guān)分析子宮頸癌組織中CDK9和iASPP的表達相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK9、iASPP在各組子宮頸組織中的表達

細胞核內(nèi)見棕黃色為CDK9陽性表達，細胞核內(nèi)未見棕黃色為CDK9陰性表達，見圖1。CDK9在對照組、低級別組、高級別組、癌癥組中的陽性表達率分別為19.4%、43.6%、55.0%、68.9%，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。細胞核和（或）細胞質(zhì)內(nèi)見棕黃色為iASPP陽性表達，細胞核和（或）細胞質(zhì)內(nèi)未見棕黃色為iASPP陰性表達，見圖2。對照組、低級別組、高級別組、癌癥組中CDK9的陽性表達率分別為28.6%、51.3%、65.0%、73.3%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 免疫組化檢查CDK9在各組子宮頸組織中的表達（400×）Figure 1 Immunohistochemical examination of the expression of CDK9in cervical tissues of different groups（400×）

表1 CDK9、iASPP在各組子宮頸組織中的表達Table 1 Expression of CDK9 and iASPP in cervical tissues of different groups

圖2 免疫組化檢查iASPP在各組子宮頸組織中的表達（400×）Figure 2 Immunohistochemical expression of iASPP in cervical tissues of different groups（400×）

2.2 CDK9、iASPP表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

子宮頸癌組織中，按照浸潤深度分組，浸潤深度＜1/2有24例，CDK9的陽性率為54.2%，iASPP的陽性率為58.3%；浸潤深度＞1/2有21例，CDK9的陽性率為85.7%，iASPP的陽性率為90.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.201，P=0.023；χ2=5.917，P=0.015）。按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，23例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CDK9陽性率為47.8%，iASPP陽性率為52.2%；22例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CDK9陽性率為90.9%，iASPP的陽性率為95.5%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.738，P=0.002；χ2=10.771，P=0.001）。CDK9和iASPP表達與患者臨床分期、分化程度、脈管浸潤等均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

2.3 CDK9與iASPP在子宮頸癌組織中的表達相關(guān)性

與14例CDK9陰性表達的子宮頸癌組織相比，在31例CDK9陽性表達的子宮頸癌組織中，iASPP的陽性表達率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步運用Spearman等級相關(guān)分析癌癥組的實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：CDK9和iASPP癌癥組中的表達相關(guān)性為正相關(guān)，表明CDK9和iASPP在子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著協(xié)同作用（P＜0.05）。見表3。

表3 CDK9和iASPP在子宮頸癌中的表達相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of CDK9 and iASPP in cervical carcinoma

3 討論

周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）是酵母中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶家族，具有調(diào)節(jié)細胞周期和細胞DNA轉(zhuǎn)錄的功能[6-7]。CDKs的激活在正常細胞中受到嚴格控制，以維持體內(nèi)細胞的平衡，當CDKs失去控制后會導(dǎo)致細胞異常增殖和癌癥進展。近年來的國內(nèi)外研究表明，CDKs在許多腫瘤中都過度表達，并參與腫瘤細胞的生長、分化、遷移、侵襲和凋亡[8-10]。因此，CDKs逐漸成為人類治療癌癥的新靶點，而主要參與基因轉(zhuǎn)錄和細胞周期調(diào)節(jié)的CDK9被認為是最重要的一個。CDK9與細胞周期蛋白T1（cyclins T1）結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物中包括正相轉(zhuǎn)錄延伸因子 b（positive transcription elongation factor b,P-TEFb），P-TEFb可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的羧基末端結(jié)構(gòu)域，從而促進前mRNA轉(zhuǎn)錄物的延伸[11]，造成細胞增殖失控。多項研究證明CDK9在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其中包括卵巢癌、兒童軟組織肉瘤、黑色素瘤、白血病、胰腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌[12-14]。然而CDK9在子宮頸癌中的生物學(xué)行為還處于未知狀態(tài)，CDK9在子宮頸癌中的靶向治療潛力也仍不清楚。

本研究結(jié)果表明：CDK9在對照組、低級別組、高級別組、癌癥組中的陽性率分別為19.4%、43.6%、55.0%、68.9%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示CDK9的過度表達參與子宮頸癌的早期形成，最終導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生。CDK9在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和骨肉瘤中也有類似表現(xiàn)。Parvathareddy等[13]發(fā)現(xiàn)在441例卵巢癌組織中有56.2%CDK9過度表達，CDK9過度表達與部分卵巢癌臨床病理特征顯著相關(guān)，如遠處轉(zhuǎn)移、Ⅳ期腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)和Ki-67指數(shù)高，且遠處轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中CDK9過度表達的發(fā)生率顯著高于原發(fā)卵巢癌組織。He等[12]通過免疫組織化學(xué)方法檢測了32例子宮內(nèi)膜癌組織中CDK9的表達情況，其中40.6%的子宮內(nèi)膜癌組織中CDK9高表達，原發(fā)子宮內(nèi)膜癌組織中的CDK9表達水平顯著低于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌組織。Ma等[15]在70例骨肉瘤組織中檢測出67例（95.7%）腫瘤組織CDK9表達陽性，轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中CDK9表達顯著升高，且CDK9低表達腫瘤患者的總體生存率明顯高于CDK9高表達腫瘤患者。Ajiro等[16]發(fā)現(xiàn)抑制CDK9不僅可以抑制HPV的復(fù)制和HPV E6及E7蛋白的表達，還可以恢復(fù)P53的抑癌功能，且進一步的研究發(fā)現(xiàn)在SIL人源性腫瘤異種移植（patient-derived xenografts，PDX）的小鼠模型上，抑制CDK9可以抑制HPV 18誘導(dǎo)的異型增生和過度增殖，同時也降低HPV的病毒載量。綜上所述，CDK9參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，包括子宮頸癌，且CDK9抑制劑在未來可能臨床應(yīng)用在子宮頸癌的治療上。

p53是一種與腫瘤高度相關(guān)的抑癌基因，不僅能抑制細胞增殖，也能促進細胞凋亡[17]。p53凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating proteins of p53,ASPP）家族是一組具有高度結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)家族[18]，能和p53特異性結(jié)合，增強或減弱p53促凋亡基因的啟動活性，從而對依賴p53的細胞凋亡通路進行調(diào)控，控制細胞的凋亡[19]。ASPP家族由3個成員組成：ASPP1、ASPP2和 iASPP，其中 ASPP1和ASPP2是p53基因的激活劑，能特異性激活p53基因的促細胞凋亡的能力[20]。iASPP為p53基因的抑制劑，特異性抑制p53基因誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄活化和促細胞凋亡功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[21-22]。因此，iASPP又被稱為是一種新的癌基因。此外，iASPP還能增加造血干細胞的數(shù)量和重建能力，保護受損細胞不發(fā)生細胞凋亡，導(dǎo)致受損細胞具有向惡性細胞轉(zhuǎn)化的能力[23]。也有研究表明過度表達的iASPP在絨毛膜癌中可能通過自噬作用調(diào)節(jié)癌細胞的生長，抑制自噬作用可增加機體對氧化應(yīng)激的敏感性[24]。大量的研究表明，iASPP在子宮頸癌組織中呈過度表達狀態(tài)，提示過度表達的iASPP很可能通過抑制細胞凋亡的過程，導(dǎo)致子宮頸癌的形成，并且與子宮頸癌患者的耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)[25]。

本研究結(jié)果顯示，iASPP在對照組、低級別組、高級別組及癌癥組中的陽性表達率分別為28.6%、51.3%、65.0%、73.3%。隨著子宮頸病變的加重，iASPP的陽性表達也逐漸增加，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與此相同的是，Wu等[25]通過免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測了iASPP在112位子宮頸癌患者的癌組織和癌旁子宮頸組織中的表達情況，結(jié)果顯示子宮頸癌組織中iASPP的陽性表達顯著高于癌旁子宮頸組織。另一項研究表明，子宮頸癌細胞中的iASPP mRNA也顯著高于正常子宮頸細胞，且細胞核iASPP高表達與放化療抵抗相關(guān)[26]。也有研究表明當子宮頸癌細胞中的iASPP被敲低表達后，子宮頸癌細胞的生長增殖減慢及侵襲力降低[27]。綜上所述，iASPP可能以多種方式、多種機制參與子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，且iASPP有望成為子宮頸癌藥物治療的新靶點

為了明確CDK9與iASPP表達與子宮頸癌臨床預(yù)后的關(guān)系，本研究分析了CDK9和iASPP表達與子宮頸癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示：CDK9和iASPP表達與臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等子宮頸癌臨床病理特征相關(guān)（P＜0.05），而與分化程度和脈管浸潤等子宮頸癌臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。以上結(jié)果說明CDK9和iASPP高表達的子宮頸癌患者相比于CDK9和iASPP低表達的子宮頸癌患者，處于過度增殖狀態(tài)的子宮頸癌細胞更具有侵襲轉(zhuǎn)移能力。同時，當子宮頸癌的分期越高，CDK9和iASPP的陽性表達率也越高。為了進一步明確CDK9與iASPP在子宮頸癌發(fā)展侵襲中的相關(guān)性，本研究通過Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：在子宮頸癌組織中CDK9和iASPP表達的相關(guān)性為正相關(guān)，表明CDK9和iASPP在子宮頸癌的發(fā)展侵襲過程中具有協(xié)同作用，兩者的過度表達共同促進子宮頸癌細胞異常增殖，進而促進子宮頸癌的發(fā)展侵襲。癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（the cancer genome atlas,TCGA）的一項結(jié)腸癌隊列研究中，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞系中的iASPP mRNA水平與CDK9 mRNA水平呈正相關(guān)，支持CDK9在促進iASPP轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用的觀點。此外，Wu等[28]發(fā)現(xiàn)抑制CDK9可以在轉(zhuǎn)錄水平降低iASPP，從而重新激活p53的抑癌功能，提出了CDK9-iASPP-p53生物軸的概念，但CDK9通過何種信號通路作用于iASPP未被提及，CDK9、iASPP之間的相關(guān)機制仍不清楚。本研究證實了在子宮頸癌組織中CDK9和iASPP具有正相關(guān)的關(guān)系，從側(cè)面驗證了CDK9-iASPP生物軸的存在。

綜上所述，子宮頸組織中CDK9與iASPP的表達高低與子宮頸病變程度關(guān)系密切，CDK9與iASPP在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。雖然CDK9和iASPP在子宮頸癌中的作用機制尚不明確，仍有待于更多的實驗和研究進一步明確CDK9和iASPP的作用機制，但CDK9和iASPP在未來有望成為治療子宮頸癌的潛在藥物靶點，以及成為臨床上評估子宮頸癌患者預(yù)后的有價值檢測指標。同時，對CDK9和iASPP的研究也為子宮頸癌的靶向藥物治療起到積極的推動作用。